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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eine vorübergehende Verbrühungsverletzung (65 °C ± 0,5 °C, 3 s) einer Hinterpfote verringert die Schwelle (g) zur Von-Frey-Filamentstimulation der ipsilateralen Seite und verändert das Gangbild. Außerdem induziert eine Brandverletzung ein depressionsähnliches Verhalten im erzwungenen Schwimmtest.

Zusammenfassung

Brühendes Wasser ist die häufigste Ursache für Brandverletzungen sowohl bei älteren als auch bei jungen Bevölkerungsgruppen. Es ist eine der größten klinischen Herausforderungen aufgrund der hohen Mortalität und der Folgen in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen. Verbrennungen verursachen häufig intensive spontane Schmerzen und anhaltende Allodynie sowie lebensbedrohliche Probleme. Noch wichtiger ist, dass übermäßige Schmerzen oft von Depressionen begleitet werden, die die Lebensqualität erheblich beeinträchtigen können. Dieser Artikel zeigt, wie man ein Tiermodell für die Untersuchung von verbrennungsinduzierten Schmerzen und depressionsähnlichem Verhalten entwickelt. Nach der Anästhesie wurde eine Brandverletzung induziert, indem eine Hinterpfote der Maus für 3 s in heißes Wasser (65 ° C ± 0,5 ° C) getaucht wurde. Der von Frey Test und die automatisierte Ganganalyse wurden alle 2 Tage nach einer Brandverletzung durchgeführt. Darüber hinaus wurde das depressionsähnliche Verhalten mit dem erzwungenen Schwimmtest untersucht, und der Rota-Rod-Test wurde durchgeführt, um die abnormale motorische Funktion nach einer Brandverletzung zu unterscheiden. Der Hauptzweck dieser Studie ist es, die Entwicklung eines Tiermodells für die Untersuchung von durch Verbrennungsverletzungen verursachten Schmerzen und depressionsähnlichem Verhalten bei Mäusen zu beschreiben.

Einleitung

Gewebeschäden wie Verbrennungen und Traumata sind im Allgemeinen mit dem gleichzeitigen Auftreten akuter Schmerzen verbunden. Brandverletzungen und traumabedingte Symptome sind schätzungsweise 1.80.000 Todesfälle pro Jahr, die durch Verbrennungen verursacht werden - die überwiegende Mehrheit tritt in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen durch verschiedene Arten von Verbrennungenauf 1. Laut einem weltweiten Bericht sind Verbrennungen bei Kindern häufig und machen etwa 40% -60% der hospitalisierten Patientenaus 2,3. Diese spezifischen Verletzungen sind noch schwerwiegender, da sie im Alltag auftreten können, wie z.B. kochendes oder badendes Wasser 4,5. Obwohl akute Schmerzen in den meisten Fällen spontan nach der Genesung von Gewebeschäden behoben werden können, kann es möglich sein, aufgrund abnormaler Veränderungen im Nervensystem chronisch zu werden 6,7.

Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass akute Schmerzen eine depressive Stimmung hervorrufen können, und chronische Schmerzen können Angst und Depressionverursachen 8,9,10,11. Die Koexistenz von Schmerz und Depression erschwert die Behandlung des Patienten. Depressionen neigen auch dazu, die Schmerzempfindlichkeit zu erhöhen, was wahrscheinlich zu intensiveren Depressionen und Schmerzen führt12. Komplikationen von Schmerzen und Depressionen werden in Tiermodellen der peripheren Entzündung13,14,15,16 gezeigt. Die detaillierten Mechanismen, die der schmerzinduzierten Depression zugrunde liegen, sind bis jetzt nicht gut bekannt17. Daher ist es notwendig, wirksamere Behandlungen für Verbrennungen zu entwickeln, um die Nebenwirkungen und Symptome zu lindern.

Daher wurde die vorliegende Studie entwickelt, um ein Tiermodell zu entwickeln, um durch Brandverletzungen verursachte akute Schmerzen und depressionsähnliches Verhalten bei Mäusen zu untersuchen. Dazu wurden eine durch Brandverletzungen verursachte abnormale taktile Empfindlichkeit, ein verändertes Gangmuster und ein depressionsähnliches Verhalten gemessen. Darüber hinaus versucht diese Studie, das Modell mithilfe von NSAIDs zu validieren.

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Protokoll

Alle experimentellen Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Chungnam National University in Südkorea überprüft und genehmigt und dann auf der Grundlage der ethischen Richtlinien der International Association for the Study of Pain18 durchgeführt.

1. Induktion einer verbrühenden Brandverletzung an der Hinterpfote

  1. Unterbringung der männlichen ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g in einem hellen und temperaturkontrollierten Raum (12/12 h Hell-Dunkel-Zyklus, 22,5 °C ± 2,5 °C) mit einer Luftfeuchtigkeit von 40%-60%.
    HINWEIS: Für dieses Protokoll können sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet werden.
  2. Erlauben Sie dem Tier freien Zugang zu Nahrung und Wasser und akklimatisieren Sie sich für mindestens 1 Woche, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
    HINWEIS: Alle Tiere wurden in Gruppen untergebracht, um Variablen wie Isolationsstress auszuschließen.
  3. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip der Versuchs- oder Kontrollgruppe zu und führen Sie blinde Experimente mit Tiernummern als Codes durch.
  4. Am Tag der Verbrennungsinduktion die Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 300 μL Alfaxalone in einer Dosis von 100 mg/kg betäuben. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie die Verbrennungsinduktion durchführen.
  5. Nach der Tiefenbetäubung der Maus um die rechte Hinterpfote mit 70% Ethanol desinfizieren.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die mangelnde Reaktion auf die Pinch-Stimulation an den Hinterzehen oder am Schwanz, um den Zustand der Tiefenanästhesie zu bestätigen.
  6. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut nach der Induktion der Anästhesie zu verhindern.
  7. Tauchen Sie die rechte Hinterpfote der tiefbetäubten Maus in heißes Wasser bei 65 °C ± 0,5 °C für 3 s. Markieren Sie den Knöchel jeder Maus, bevor Sie die Hinterpfote in heißes Wasser tauchen, um die Konsistenz im verbrannten Bereich aufrechtzuerhalten.
  8. Nach der Induktion von Verbrennungen bringen Sie die Mäuse in einen sauberen Hauskäfig und legen Sie sie auf ein Heizkissen, bis sich die Tiere von der Narkose erholen.
    HINWEIS: Das Analgetikum, Paracetamol (200 mg/kg), wurde intraperitoneal einmal täglich für 7 Tage ab dem Tag der Brandverletzung verabreicht (nur Burn + Acetaminophen-Gruppe). Die Burn-Gruppe wurde mit Kochsalzlösung als Fahrzeugkontrolle behandelt. Das Experiment wurde nach der in einer früheren Studiebeschriebenen Methode durchgeführt 4.

2. Messung der mechanischen Allodynie

  1. Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und lassen Sie sie sich vor dem Test mindestens 30 Minuten lang akklimatisieren. Tragen Sie während der Durchführung des Tests ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske.
  2. Legen Sie die Mäuse in eine quadratische Box (Durchmesser: 13 cm, Höhe: 12 cm) auf einem Metallgitterboden (Maschenweite: 0,7 cm x 0,7 cm) und lassen Sie sie für mindestens 30 min akklimatisieren.
  3. Beurteilen Sie die mechanische Schwelle der Hinterpfote mit der aufsteigenden Reizmethode19,20.
  4. Stechen Sie vorsichtig eine Reihe von Von-Frey-Filamenten mit 5-8 s Intervallen, um den hinteren Plantar zu stimulieren. Rufen Sie die Basiswerte am Tag vor der Brandinduktion ab.
    HINWEIS: Die 0,16-1,2 g von Frey-Filamente wurden im Test verwendet, um die Pfotenentzugsschwelle bei allen Tieren zu messen. Der Pfotenentzugstest wurde mit der niedrigsten Biegekraft von Frey-Filament (0,16 g in diesem Protokoll) gestartet. Wenn es keine Reaktion gab, wurde ein Filament mit der nächsten Biegekraft angelegt.
  5. Führen Sie fünf Versuche durch, um mechanische Schwellenwerte für jede ipsilaterale (verletzte) Hinterpfote zu bewerten.
    HINWEIS: Die Biegekraft des von-Frey-Filaments, die mehr als das Dreifache der fünf Versuche bei jedem Tier eine Reaktion hervorruft, wurde als Pfotenentzugsschwelle (PWT, g) ausgedrückt. Mechanische Schwellenwerte wurden einen Tag vor und bei 1, 3, 5 und 7 Tagen nach der Brandverletzung gemessen. Die analgetische Wirkung wurde 1 h nach Verabreichung des Paracetamol beim Tier beurteilt.

3. Automatisierte Ganganalyse

  1. Akklimatisieren Sie die Mäuse im Ganganalysesystem einmal täglich für 10-15 Minuten ab 5 Tagen vor der Brandverletzung. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie eine Ganganalyse durchführen.
  2. Bringen Sie die Mäuse am Tag des Tests in den Verhaltenstestraum und akklimatisieren Sie sie mindestens 30 Minuten vor dem Test.
    HINWEIS: Führen Sie Akklimatisierungs- und Ganganalysetests in einer dunklen Umgebung durch. Legen Sie die Bedingungen des Programmmenüs wie folgt fest.
    1. Klicken Sie nach dem Ausführen des Programms auf das Menü Neues Experiment erstellen , um den Ordner zum Speichern der Daten festzulegen.
    2. Stellen Sie nach der Benennung die maximale Laufzeit auf 5 s und die maximal zulässigen Geschwindigkeitsschwankungen auf 50 % ein.
    3. Wählen Sie eine registrierte Kamera aus und stellen Sie die Gehweglänge auf 30 cm auf der Registerkarte Setup des Programms ein.
    4. Wählen Sie im Programmmenü auf der Registerkarte Erwerben die Option Erfassung öffnen aus.
    5. Klicken Sie basierend auf den Statusmeldungen auf die Schaltfläche Hintergrund ausrichten , um ein Hintergrundbild eines leeren Gehwegs zu erhalten.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassung starten , und platzieren Sie die Maus am Eingang des von links nach rechts befahrbaren Gehwegs. Die Aufzeichnung beginnt automatisch nach der freien Bewegung der Maus.
    HINWEIS: Wenn der Gang des Tieres erfolgreich aufgezeichnet wurde und alle Schritte erkannt wurden, wird er mit einem grünen Symbol als Compliant Run markiert. Wenn die Software keine Schritte erkennt, wird ein rotes Symbol angezeigt, in diesem Fall wird empfohlen, die Aufnahme erneut durchzuführen. Die Autoren empfehlen, mindestens fünf erfolgreiche konforme Läufe mit ähnlichen Laufgeschwindigkeiten zu sammeln und zu analysieren.
  4. Wählen Sie im Programmmenü auf der Registerkarte Erwerben die Option Läufe klassifizieren aus.
    HINWEIS: Nachdem Sie die Daten aus dem oben genannten erfolgreichen Compliance-Lauf ausgewählt haben, gehen Sie zum Videoanalysebildschirm, auf dem die Gangmuster der Mäuse aufgezeichnet wurden.
  5. Wählen Sie den zu analysierenden Lauf aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Automatisch klassifizieren .
  6. Entfernen Sie nach der automatischen Klassifizierung die Nase, die Genitalerkennung und die Fehlerkennung von Pfoten, um Daten in jedem Durchlauf zu verwerfen, und analysieren Sie dann die Daten.
    HINWEIS: Alle statistischen Parameter werden automatisch analysiert und im Programm gespeichert, und Rohdatenwerte finden Sie im Analysemenü des Experimentators. Die automatische Ganganalyse wurde vor und nach 1, 3, 5 und 7 Tagen nach der Brandverletzung durchgeführt. Die Bewertung wurde 30 Minuten nach der Verabreichung von Paracetamol in der Gruppe Burn + Acetaminophen und 30 Minuten nach der Kochsalzbehandlung in der Gruppe Burn durchgeführt. Dieses Experiment wurde nach der in den vorangegangenen Studien beschriebenen Methodedurchgeführt 4,21,22.

4. Messung von depressionsähnlichem Verhalten

HINWEIS: Verzweiflungsbasiertes Verhalten, Immobilitätszeit im Wasser wurde durch den erzwungenen Schwimmtest gemessen.

  1. Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und akklimatisieren Sie sie mindestens 30 Minuten vor dem Test. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie den erzwungenen Schwimmtest durchführen.
  2. Legen Sie die Maus für 15 min in einen durchsichtigen Plexiglaszylinder (10 cm x 25 cm) mit 15 cm Wasser (25 °C ± 0,5 °C).
  3. Nach 24 h setzen Sie die Maus in den Zylinder der gleichen Bedingungen und messen die Immobilitätszeit.
    HINWEIS: Die Immobilitätszeit wurde für 5 Minuten Testzeit gemessen, und die Zeit, in der Mäuse aufhörten zu klettern oder zu schwimmen und nur schwammen, um ihren Kopf über der Wasseroberfläche zu halten, wurde aufgezeichnet. Der erzwungene Schwimmtest wurde am 7. Tag nach der Brandverletzung durchgeführt. Die Bewertung wurde 1 h nach der Verabreichung von Paracetamol in der Gruppe Burn + Acetaminophen und 1 h nach der Kochsalzbehandlung in der Burn-Gruppe durchgeführt. Das Experiment wurde nach der in früheren Studien beschriebenen Methodedurchgeführt 23,24.

5. Messung der normalen Motorfunktion

HINWEIS: Der Rota-Rod-Test wurde durchgeführt, um die abnormale motorische Funktion nach einer Brandverletzung zu unterscheiden.

  1. Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und akklimatisieren Sie sie mindestens 30 Minuten vor dem Test. Tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske, während Sie den erzwungenen Schwimmtest durchführen.
  2. Stellen Sie die Tiere auf eine rollende zylindrische Plattform (5,7 cm breit; 3 cm Durchmesser), die 16 cm über dem Boden des Geräts aufgehängt ist.
  3. Erlauben Sie jedem Tier, mindestens 5 Tage lang einmal täglich an einer Rota-Stange zu trainieren, bevor eine Verbrennungsverletzung auftritt.
  4. Führen Sie den Rota-Rod-Test alle 20 Minuten für 2 Stunden nach der Verabreichung des Arzneimittels durch. Stellen Sie die Cut-off-Zeit auf 2 Minuten ein.
  5. Messen Sie die Zeitdauer, die die Maus auf einem rotierenden Stab mit der konstanten Geschwindigkeit von 15 Umdrehungen pro Minute läuft, ohne zu fallen.
    HINWEIS: Der Rota-Rod-Test wurde 7 Tage nach der Induktion der Verbrennungsverletzung durchgeführt. Die Bewertung wurde unmittelbar nach der Verabreichung von Paracetamol in der Gruppe Burn + Acetaminophen und nach der Behandlung mit Kochsalzlösung in der Gruppe Burn durchgeführt. Alfaxalone wurde in diesem Test als Positivkontrolle für experimentell behandelte Medikamente verwendet. Während des Rotarod-Tests wird die Dauer gemessen, die die Maus auf dem rotierenden Stab läuft, ohne zu fallen. Das Experiment wurde nach der in früheren Studien beschriebenen Methodedurchgeführt 22,25.

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Ergebnisse

Um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der Tiere zu reduzieren, die gemäß den Three Rs (Replacement, Reduction, and Refinement) -Richtlinien verwendet werden, wurde diese Studie mit der Mindestanzahl von Tieren für die Erhebung signifikanter Daten konzipiert, die durch vorläufige Experimente ermittelt wurden. In dieser Studie wurden Verhaltensexperimente unabhängig voneinander zweimal wie folgt durchgeführt. Die Ganganalyse, mechanische Allodynie und depressionsähnliche Verhaltenstests wurden mit den...

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Diskussion

Die Verbrühungsverbrennung ist eine Art thermische Verbrennung, die durch erhitzte Flüssigkeiten verursacht wird. Es wurde vermutet, dass in den meisten Fällen Verbrennungen ersten oder zweiten Grades auftreten, aber langfristiger Kontakt mit Wärmequellen kann Verbrennungen dritten Grades verursachen26. In der vorliegenden Studie wurde eine Brandverletzung induziert, indem die rechte Hinterpfote von Mäusen bei 65 °C für 3 s 4,26 in ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Chungnam National University und dem Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der Regierung Koreas finanziert wurde (NRF-2019R1A6A3A01093963 und NRF-2021R1F1A1062509).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD307809
1.5 mL tubeAxygenMCT-150-C
50 mL tubeSPL50050
Acetaminophen BioXtra, ≥99.0%Sigma-AldrichA7085-100GThis analgesic agent is used as a positive control.
Alfaxan multidose (Alfaxalone)JUROX Pty.LimitedIn this experiment, this material was used for animal anesthesia, and was used as a positive control for experimentally treated drugs in the rota-rod test.
CatWalk automated gait analysis systemNoldusCatWalk XTGait analysis in freely walking rodents is used to study the changes in limb movement and positioning in models with sensory-motor dysfunction
OPTISHIELD (Cyclosporin ophthalmic ointment)Ashish Life ScienceThis material was used for an ointment to prevent corneal drying after induction of anesthesia.
Plexiglass cylinderSCITECH KOREAcustom made productsUsed in forced swimming test
Rota-rod systemSCITECH KOREAAccelerating rota rodUsed in the measurement of Normal Motor Function
von Frey filamentsNorth Coast MedicalNC12775Used in the measurement of Mechanical Allodynia
WaterbathCHANGSHIN SCIENCEC-WBEUsed in the burn injury induction

Referenzen

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