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要約

このプロトコルは、アガロース膨潤を、巨大な単層脂質小胞(GUV)に組み込むための強力かつ一般化可能な技術として利用し、ここで述べるように、ヒト1Aセロトニン受容体タンパク質(5-HT1AR)の再構成に関して、薬理学的に重要なGタンパク質結合型受容体の1つである。

要約

一体膜タンパク質の構造と機能の堅牢な インビトロ 調査は、原形質膜の複雑性と生細胞におけるタンパク質の挙動に影響を与える多くの要因による課題となっています。巨大なユニラメラ小胞(GUV)は、タンパク質膜相互作用を調査し、正確で刺激に依存する方法でタンパク質の挙動を探査するためのバイオミメティックで高度に調整可能な インビトロ モデルシステムです。本プロトコルでは、膜中に安定に統合されたヒトセロトニン1A受容体(5-HT1AR)を用いてGUVを製造するための安価で効果的な方法を提示する。我々は、修飾されたヒドロゲル膨潤法を用いてGUVを製造する。アガロースと5-HT1ARの混合物の上に脂質膜を堆積させ、その後、システム全体をハイドレートすることによって、小胞は膜に組み込まれた適切に配向し、機能的な5-HT1ARで形成することができる。これらのGUVは、顕微鏡を介してタンパク質膜相互作用と局在化行動を調べるために使用することができます。最終的に、このプロトコルは、深い生理学的洞察を提供し、一体膜タンパク質の機能性の理解を進めることができます。

概要

合成モデル膜は、生体膜の基本的な特性と機能の調査に強力なツールです。巨大な単層小胞(GUV)は、様々な形質膜特性を研究するための最も顕著なプラットフォームの1つであり、異なる生理学的条件を模倣するように設計することができます1、2、3、4、5、6、7、8。シグナル伝達、接着、エンドサイトーシス、輸送9,11,12,13,14,15など、細胞プロセスの多くにおいて、形質膜とその組織が重要な役割を果たしていることは十分に確立されています。

GUVは、穏やかな水和物16、ヒドロゲル膨潤17、電気形質18、マイクロ流体技術19、20、21、22、jetting23、および溶媒交換24、25、26を含む様々な方法を用いて製造されている。一体型膜タンパク質(IMP)の取り扱いにおける課題により、それらを研究するインビトロプラットフォームは限られています。GUVは、ネイティブ環境を模倣した環境でのIMPを研究するための簡略化されたプラットフォームを提供します。GUVではタンパク質再構成にはいくつかのアプローチがありましたが、正しい向きを持つタンパク質を組み込み、タンパク質の機能性を維持することで課題が生じます。

GUVで最も成功したタンパク質再構成には、洗剤交換法が必要です。これは、洗剤によって天然環境からタンパク質を可溶化し、続いてタンパク質精製を行い、その後、様々な方法で洗浄剤分子を脂質に置き換えることを含む28。洗浄剤は精製中にIPSの三次構造を安定させるのに役立ちますが、洗剤ミセルはこれらのタンパク質にとって比較的不自然な環境であり、特に脂質二重層における機能研究のために、より良い安定化を図ります。また、従来のGUV製造技術を用いて機能性膜貫通タンパク質を脂質二重層に組み込むことは、これらのタンパク質の大きさ、繊細さ、および必要となる追加の洗剤交換ステップ27,31,32,33のために困難であった。有機溶剤を使用して洗剤を除去すると、タンパク質の凝集と変性34が発生します。改善された洗剤媒介方法は有望であったが、洗剤除去ステップには注意が必要であり、特定のタンパク質31,35に対して最適化が必要となる可能性がある。さらに、電気的な形質を利用する方法はタンパク質の選択を制限し、特に帯電した脂質31,36,37のすべての脂質組成物に適していない可能性があります。もう一つの技術は、所望のタンパク質を含む大きなユニラメラ小胞(RV)とGUVのペプチド誘発融合であるが、骨の折れるものであり、外来分子の挿入につながる可能性があるが、フソジェニックペプチド33,38,39。生きた細胞に由来する巨大な原形質膜小胞(GPMV)は、これらの問題のいくつかを克服するために使用することができますが、結果として生じる脂質およびタンパク質組成の制御を最小限に抑えることができます14,40,41。従って、我々の修飾アガロース膨潤法を用いたGUVのバイリピッド層におけるIPSの統合は、膜環境におけるこれらのタンパク質をさらに調べる信頼性の高い方法を提示する42,43,44,45。

細胞シグナル伝達とコミュニケーションは、Gタンパク質共役受容体(GPCRs)として知られているタンパク質のファミリーを含みます。GPCRsはタンパク質の最大のファミリーの一つであり、気分、食欲、血圧、心血管機能、呼吸、および他の多くの生理学的機能の中で睡眠を調節することに関連しています46。本研究では、ヒトセロトニン1A受容体(5-HT1AR)を用いたGPCRファミリーの原型的なメンバーである。5-HT1AR は中枢神経系 (CNS) 血管で見つけることができます。;それは、心血管、胃腸、内分泌機能、ならびにmood47の調節に参加する多数の機能に影響を与える。GPCR研究の大きな障壁は、その複雑な両親媒性構造から生じ、GUVはタンパク質機能性、脂質タンパク質相互作用、タンパク質間相互作用に至るまで、関心のある様々な特性の調査のための有望なプラットフォームを提示します。表面プラズモン共鳴(SPR)48,49、核磁気共鳴分光法(NMR)50,51、タンパク質脂質オーバーレイ(PLO)アッセイ51,52,53,54、天然質量分析計55、等温滴定熱量測定(ITC)56,56,56,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,lipsome、及び567,576,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,576,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,5700,57,5700,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,5堆積アッセイ58,59.我々の研究室では、簡略化したGUVアプローチを用いて、受容体の活性状態でGiαサブユニットと結合するBODIPY-GTPγSをカプセル化することにより、脂質-タンパク質相互作用がタンパク質機能に及ぼす影響を調べています。彼らの結合は、時間45で検出され得る蛍光シグナルを産生する蛍光を解く。さらに、様々な研究が脂質タンパク質相互作用と、膜曲率60,61を感知または安定化するタンパク質の役割を調査し、実現可能なGUVアプローチを利用することが重要な利点となり得る。

このプロトコルは、修飾されたアガロースヒドロゲルシステム17,42を使用してGPVの膜にGPCRを組み込むための簡単な方法を示しています。さらに、当社の前の研究に基づいて、我々の方法は、30〜40°Cに短期的に曝すことができるIMPに適している可能性があります。 簡単に言うと、目的のGPCRを含む膜断片と組み合わせたアガロースの薄膜を広げる。この層のゲル化後、アガロースの上に脂質溶液を堆積させ、溶媒を蒸発させます。その後、システムの再水和を水溶液バッファーで行い、脂質二重層にタンパク質を取り込んだGUVの形成を行った。

プロトコル

1. タンパク質標識

  1. NHS-ローダミン、5-HT1A 膜断片、および室温で平衡化する1つの7 K MWCOスピン脱塩カラムを可能にする。
  2. 1mgのNHS-ローダミンをジメチルスルホキシド(DMSO)の100 μLに溶解します。
  3. 5-HT1AR溶液のpHをpH 8に増加させるために1 M重炭酸ナトリウム溶液の5 μLを加えます。
  4. 5-HT1AR溶液の50 μLに3.66 μLのNHS-ローダミン溶液を加え、ピペットをマイクロ遠心チューブで上下に軽く上下させます。
    注:NHS-ローダミンの少なくとも10倍のモル過剰を持っていることを確認してください。
  5. 混合物を光から保護し、室温で1時間回転器を置きます。
  6. 1回のリン酸バッファー生理食塩紙(1x PBS)の200 μLで7 k MWCOスピンカラムを洗浄1.5 RCFで1.5分間3回洗浄します。
  7. 標識したタンパク質を1つのカラムに加え、別のマイクロ遠心分離管の量のバランスをとります。
  8. 標識タンパク質を1.5 RCFで5分間1回スピンダウンします。
  9. 280 nm および 554 nm のナノドロップ分光光度計を使用して UV-vis スペクトルを取り、メーカーズマニュアルに従ってラベリング効率を計算します。
  10. さらに使用するまで5°Cで覆われた標識タンパク質を保管してください。このソリューションは、ラベル付け後約1週間安定しています。

2. 膜組み込み 5-HT 1A を持つ GUV

  1. 材料・試薬の製造
    1. タンパク質、脂質およびBSA(ウシ血清アルブミン)を室温まで平衡化することを許可する。
    2. この間、カバーリップをメタノールに入れ、40°Cで30分間超音波処理して清掃してください。 メタノールがカバースリップを完全に覆い、水浴中の水位が容器内のメタノールのレベルを上回っていることを確認してください。
      注:メタノールは毒性があり、適切な化学フードで取り扱う必要があります。
    3. 空気の穏やかな流れでカバーリップの余分なメタノールを乾燥させます。40°Cのオーブンで覆われたカバースリップラックを15分間置き、余分なカバーリップが乾燥していることを確認します。
    4. プラズマ洗浄プロセスを開始します。まず、カバースリップをプラズマクリーナーに入れ、空気取り入れバルブを閉じてチャンバー内のすべての空気を避難させます。
    5. チャンバーが真空状態になったら、高いRF電源設定とほぼ完全な真空を使用して、真空チャンバーにわずかな空気を入れて5分間カバーリップを清掃します。プラズマの適切なレベルを確保するために、プラズマの結果として生じる色が安定した明るいピンク色になるように真空チャンバの開口部を調整します。
      注:空気を使用する場合、プラズマ処理工程の間プラズマが明るいピンク色のままで、暗い紫色がチャンバー内に不適切な量の空気があることを示し、最適でないプラズマ処理を行う可能性があります。
    6. 5分が過ぎたら、RF電源を遮断し、真空を放します。
      注:プラズマチャンバから取り外した際は、カバーリップが覆われたままであることを確認してください。
  2. ヒドロゲル調製物
    1. 超低温融解温度アガロース6mgと300μLの超純水(すなわち、2%(w/v)アガロース)を組み合わせます。
      注:2%アガロースは、タンパク質を含まないGUVを作るために使用されます。アガロース溶液は、45°Cで2日間保つことができます。
    2. ステップ3.1で調製した3 w/v%アガロース用300μLの超純水と9mgの超低温アガロースを組み合わせます。3%アガロースはタンパク質組み込みGUVを作るために使用されます。
    3. 90°Cのヒートブロックに10分間置く前に溶液を短時間渦液にします。次いで、チューブを45°Cのヒートブロックに移す前に再び渦を出し、さらに使用するまで溶融形態に保つ。
  3. アガロースとタンパク質混合
    1. 21 μLの3%アガロースを、5-HT1AR膜フラグメントの7 μLと混合します。ピペットは何度も何度もゆっくりと上下し、十分な混合を確保します。その後、45°Cで1分間インキュベートする。
  4. ヒドロゲルと脂質沈着
    1. タンパク質を含まないGUVの場合:2%アガロースの20 μLを使用して、プラズマ洗浄の新鮮なカバーリップに薄膜を作ります。アガロース液滴の上に別のカバースリップを素早く落とし、カバーリップをそっとスライドさせて両方のカバーリップに薄いフィルムを作ります。
      注:このステップは、アガロースがまだ溶融形態にある間に液滴の滑りが起こらなければならないという点で難しいです。
    2. タンパク質組み込みGUVの場合:ピペットタンパク質/アガロース混合物をもう1回上下し、2%アガロースの20 μLを血漿洗浄カバースリップに沈着させます。上で説明したスリップキャストの指示に従います。
    3. アガロースを室温で30分間光から保護してゲル化させます。
    4. アガロース層の上に滴下して脂質を堆積させます.1-パルミトイル-2-オレロイルグリセロ-3-ホスホコリン(POPC)の合計10 μLを0.4モル%1,2-ジパルミトイルsで使用 アガロースフィルムの上にクロロホルムにATTO 488(ATTO-488-DPPE)(または脂質混合物)で標識した3-ホスホエタノールアミン(DPPE)ガスクロマトグラフィー針を使用して液滴を堆積させ、穏やかな気流を介して一度に1滴ずつ広げます。
      注: このステップでは、ヒドロゲルの上に比較的均一な脂質層を作る場合は注意が必要です。また、クロロホルムは有毒であり、適切な化学フードで取り扱われるべきである。
    5. カバースリップの上にOリングを置き、Oリングの上にチャンバーの上部コンポーネントを置くことによって、サイクスムーア(S-M)チャンバーを組み立てます。チャンバーコンポーネントを一緒にねじ込んでチャンバーを組み立てるので、チャンバーを組み立てるのにメーカーから提供されたキーを使用して、チャンバを密封し、漏れを防ぎます。
      注:チャンバーの上部はOリングで締め付ける必要がありますが、Oリングがチャンバーに正しく座っていない場合、カバースリップが割れる可能性がありますので、カバースリップがそのまま残っていることを確認するには注意が必要です。また、膨潤液を添加してもチャンバーが漏れないように、チャンバーが十分に密閉されていることを確認してください。チャンバーを十分に締め付けに失敗すると、漏れやサンプルの損失が発生します。
  5. 小胞の腫れと収穫
    1. 200 mMスクロース450 μLを1x PBSで静かにピペットし、チャンバーを軽くタップしてヒドロゲル-脂質層の十分なバッファーカバレッジを確保することで、システム全体をハイドレートします。
      注:スクロース溶液は、目的の生物学的プローブを含む水分補給緩衝液に置き換えることができます。
    2. チャンバーを45°Cに置き、チャンバーの上部をカバースリップで覆い、蒸発を防ぎます。サンプルが膨らみ、破片や光から1時間保護されます。
    3. 使用する96ウェルプレートの各ウェルに、1 mg/mL BSAを超純水に100 μL加えます。室温で1時間インキュベートする。
    4. 超純水で3回、1x PBSで200mMスクロースで1回洗浄します。
    5. 最後に、GUVサンプル溶液を添加するまで1x PBSに200mMのグルコースを添加する。
      注: BSA は GUV 吸着をブロックするために使用されました。
    6. ヒドロゲルを膨らませた後、チャンバーを軽く振ってタップして、ヒドロゲル表面に取り付けられたままのGUVを取り外します。次いで、GUV-スクロース溶液を慎重にピペットアップする。
      注:すべての小胞が表面から取り外されることを確認するための任意のステップとして、ショ糖懸濁液の一部をヒドロゲル表面に静かにピペットします。
    7. 1x PBSで200 mMのグルコースの700 μLを含む以前に調製されたマイクロ遠心分離チューブに懸濁液を移動します。
      注: 密度勾配は遠心管の底に小胞の沈降につながります。
    8. 小胞がマイクロ遠心チューブの底に沈み、最適な回収を可能にするために、さらに1時間落ち着くようにします。
    9. グルコースにGUVを沈降した後、遠心分離管の底部(沈着小胞)から、前に調製したBSA処理した96ウェルプレートに300μLを移し、共焦点顕微鏡下の小胞を調べます。
      注:最終的なサンプルで収集された破片の量を最小限に抑えるために、マイクロ遠心チューブの一番下を避けるようにしてください。
  6. 顕微鏡下でサンプルを確認します。
    1. サンプルに488 nmレーザーを照射します(二重層がATTO-488-DPPEで標識されているように、膜を視覚化することができます)。
    2. サンプルに561 nmのレーザーを照らします(NHS-ローダミンで標識されているので、タンパク質を視覚化することができます)。
      注:光酸化が小胞を不安定にする可能性があるとしてサンプルをイメージングする際には注意が必要です。同じ日に小胞が観察された。

figure-protocol-4574
図1:詳細なプロトコル手順の図。BioRender.com で作成されたこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

結果

タンパク質の濃度を測定し、標識の程度を、色素とタンパク質との間のモル比を1:1と計算した。共焦点顕微鏡を用いてGUVを調べることで、小胞の形成とタンパク質の統合が成功したことを確認することができました。脂質を0.4モル%ATTO 488-DPPEで標識し、タンパク質を一次アミンのローダミンNHSエステル修飾を介して共有結合標識した。 図2a および 図2b

ディスカッション

我々は、全体的なプロトコルの成功に不可欠な2つのステップを同定しました:プラズマ処理と脂質堆積。カバーリップのプラズマ洗浄は、ガラスカバースリップにアガロースヒドロゲルの十分なカバレッジと接着性を確保するために不可欠です。プラズマ洗浄は、まず、ガラス表面から有機物の痕跡を取り除く、という2つのことを達成します。第二に、それはカバースリップ表面を活性化し?...

開示事項

著者らは開示する利益相反はない。

謝辞

私たちは、貴重な議論とアドバイスのためにマシュー・ブロッサーに感謝します。この研究は、海軍研究局(N00014-16-1-2382)と国立科学財団(PHY-1915017)によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscopeNikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-ringsSterling Seal & Supply, Neptune, IN5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device cameraPhotometrics, Huntington Beach, CA Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nmCoherent, Santa Clara, CA488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragmentsPerkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, GermanyAD 488-155
Bench top plasma cleanerHarrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
bovine serum albumin (BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
chloroform (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
Cholesterol (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear BottomCorning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Germany[no longer sold on main website]
glucoseSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
methanol (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
spinning-disc CSUX confocal headYokogawa,Tokyo, JapanCSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslipsChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
sucroseSigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Sykes-Moore chambersBellco, Vineland, NJ1943-11111
Ultra-low melting temperature agaroseSigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
VWR Analog HeatblockVWR International, Radnor, PA[no longer sold on main website]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

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