Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Resumo

Este protocolo utiliza o inchaço de agarose como uma técnica poderosa e generalizável para incorporar proteínas de membrana integral (IMPs) em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (GUVs), como descrito aqui para a reconstituição da proteína humana receptora de serotonina _{1A (5-HT1AR}), uma das classes de receptores farmacofarologicamente importantes acoplados à proteína G.

Resumo

Investigações in vitro robustas da estrutura e função das proteínas da membrana integral tem sido um desafio devido às complexidades da membrana plasmática e aos inúmeros fatores que influenciam o comportamento proteico nas células vivas. Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são um sistema de modelo biomimético e altamente incapaz de in vitro para investigar interações proteína-membrana e sondar o comportamento proteico de forma precisa e dependente de estímulos. Neste protocolo, apresentamos um método barato e eficaz para a fabricação de GUVs com o receptor humano de serotonina _{1A (5-HT1AR}) firmemente integrado na membrana. Fabricamos GUVs usando um método modificado de inchaço de hidrogel; depositando uma película lipídica em cima de uma mistura de agarose e _5-HT1AR e, em seguida, hidratando todo o sistema, as vesículas podem ser formadas com _5-HT1AR devidamente orientados e funcionais incorporados na membrana. Esses GUVs podem então ser usados para examinar interações proteína-membrana e comportamento de localização via microscopia. Em última análise, este protocolo pode avançar nossa compreensão da funcionalidade das proteínas da membrana integral, fornecendo uma visão fisiológica profunda.

Introdução

As membranas de modelo sintético são ferramentas poderosas na investigação das propriedades e funções fundamentais dos biomembranos. Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são uma das plataformas mais proeminentes para estudar uma variedade de propriedades de membrana plasmática e podem ser projetadas para imitar diferentes condições fisiológicas1,2,3,4,5,6,7,8. Está bem estabelecido que a membrana plasmática e sua organização desempenham um papel fundamental em uma infinidade de processos celulares, como transdução de sinal, adesão, endocitose e transporte9,10,11,12,13,14,15.

Os GUVs foram fabricados utilizando vários métodos, incluindo hidratação ^suave16, inchaço de ^hidrogel17, ^{eletroformação18}, técnicas microfluídicas19,20,21,22, ^jetting23 e troca de solventes24,25,26. Devido aos desafios no manuseio de proteínas de membrana integral (IMPs), as plataformas in vitro para estudá-las têm sido limitadas. Os GUVs apresentam uma plataforma simplificada para estudar IMPs em um ambiente que imita seu ambiente nativo. Embora tenha havido várias abordagens para a reconstituição de proteínas nos GUVs, os desafios surgem da incorporação de proteínas com a orientação correta e manutenção da funcionalidade ^proteica27.

A reconstituição de proteínas mais bem sucedida em GUVs requer o método de troca de detergentes; que envolve solubilizar as proteínas de seu ambiente nativo por detergentes, seguido pela purificação de proteínas, e, em seguida, substituir as moléculas de detergente por lipídios através de vários ^métodos28. Enquanto os detergentes servem para estabilizar a estrutura terciária dos IMPs durante a purificação, as micelas detergentes são um ambiente relativamente antinatural para essas proteínas, que são melhor estabilizadas, particularmente para estudos funcionais, em bicamadas lipídicas28,29,30. Além disso, a incorporação de proteínas transmembranas funcionais na bicamada lipídica utilizando técnicas tradicionais de fabricação de GUV tem sido difícil devido ao tamanho, à delicadeza dessas proteínas e às etapas adicionais de troca de detergente que seriam necessárias27,31,32,33. O uso de solvente orgânico para remover detergentes causa agregação de proteínas e desnaturação34. Um método melhorado mediado por detergente tem sido promissor, no entanto, é necessário cautela para a etapa de remoção do detergente e a otimização pode ser necessária para proteínas ^{específicas31,35}. Além disso, métodos que utilizam a eletroformação podem restringir a escolha da proteína e podem não ser adequados para todas as composições lipídicas especialmente lipídios carregados31,36,37. Outra técnica que tem sido utilizada é a fusão induzida por peptídeos de grandes vesículas unilamellar (LUVs) contendo a proteína desejada com GUVs, embora tenha sido considerada trabalhosa e pode levar à inserção de moléculas estranhas - os peptídeos fusogênicos33,38,39. As vesículas gigantes da membrana plasmática (GPMVs), derivadas de células vivas, podem ser usadas para superar algumas dessas questões, porém permitem o controle mínimo da composição lipídica e proteica resultante14,40,41. Portanto, a integração dos IMPs na camada bilipid de GUVs utilizando nosso método de inchaço agarose modificado apresenta um método confiável para examinar ainda mais essas proteínas no ambiente da membrana42,43,44,45.

A sinalização e comunicação celular envolve uma família de proteínas conhecidas como receptores acoplados à proteína G (GPCRs); Os GPCRs estão entre a maior família de proteínas e estão associados à modulação do humor, apetite, pressão arterial, função cardiovascular, respiração e sono entre muitas outras funções fisiológicas46. Neste estudo, utilizamos o receptor humano de serotonina 1A (_5-HT1AR), que é um membro prototípico da família GPCR. _5-HT1AR pode ser encontrado no sistema nervoso central (SNC) e vasos sanguíneos; influencia inúmeras funções como funções cardiovasculares, gastrointestinais, endócrinas, além de participar da regulação do ^humor47. Uma grande barreira à pesquisa de GPCR surge de sua complexa estrutura anfílica, e os GUVs apresentam uma plataforma promissora para a investigação de várias propriedades de interesse, que vão desde a funcionalidade proteica, interações lipídica-proteínas e interações proteína-proteína. Várias abordagens têm sido utilizadas para estudar interações lipídica-proteína, como ressonância de plasmon superficial (SPR)^48,49, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR)^50,51, sobreposição lipídica proteica (OLP) ^{ensaio51,52,53,54}, espectrometria de massa ^nativa555, calorimetria de titulação isotemal (ITC)^56,57, e lipososom ensaio de ^{sedimentação58,59}. Nosso laboratório tem usado a abordagem simplificada do GUV para investigar o efeito das interações lipídica-proteína na funcionalidade proteica, incapsulando BODIPY-GTPγS, que se liga à subunidade _Giα no estado ativo do receptor. Sua ligação insocra o fluoróforo produz um sinal de fluorescência que poderia ser detectado ao longo do ^tempo45. Além disso, vários estudos investigaram as interações lipídica-proteínas e o papel das proteínas na detecção ou estabilização da curvatura da ^{membrana60,61}, e utilizar uma abordagem Uctávia viável do GUV pode ser uma vantagem fundamental.

Este protocolo demonstra um método simples para incorporar GPCRs na membrana de GUVs usando um sistema de hidrogel agarose ^{modificado17,42}. Além disso, com base em nosso trabalho anterior, nosso método pode ser adequado para IMPs que podem suportar exposição a curto prazo a 30-40 °C. Resumidamente, espalhamos um filme fino de agarose combinado com fragmentos de membrana contendo o GPCR de interesse. Após a gelação desta camada, depositamos uma solução lipídica em cima da agarose e permitimos que o solvente evapore. A reidratação do sistema foi então realizada com um tampão aquoso, resultando na formação de GUVs com proteína incorporada na bicamada lipídica.

Protocolo

1. Rotulagem de proteínas

1. Permita que os fragmentos de membrana NHS-Rhodamine, _5-HT1A e uma coluna de dessecação de spin de 7 K MWCO se equilibrem à temperatura ambiente.
2. Dissolver 1 mg de NHS-rhodamina em 100 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
3. Adicione 5 μL de solução de bicarbonato de sódio de 1 M para aumentar o pH da solução _5-HT1AR ao pH 8.
4. Adicione 3,66 μL da solução NHS-rhodamine a 50 μL da solução _5-HT1AR e pipeta suavemente para cima e para baixo em um tubo de microcentrifuuge.
   NOTA: Certifique-se de ter pelo menos 10x de excesso molar de NHS-rhodamina.
5. Mantenha a mistura protegida da luz e coloque o rotador em temperatura ambiente por 1h.
6. Lave uma coluna de giro de 7 k MWCO com 200 μL de soro fisiológico tampão de fosfato de 1x (1x PBS) três vezes por 1,5 min a 1,5 RCF para cada lavagem.
7. Adicione a proteína rotulada a uma coluna e equilibre a quantidade em outro tubo de microcentrífuga.
8. Gire a proteína rotulada uma vez por 5 min a 1,5 RCF.
9. Pegue um espectro UV-vis usando um espectotúmetro nanodrop a 280 nm e 554 nm e calcule a eficiência de rotulagem seguindo o manual do fabricante.
10. Armazene a proteína rotulada coberta a 5 °C até que use mais. A solução é estável por aproximadamente uma semana após a rotulagem.

2. GUVs com 5-HT _1A incorporados por membrana

1. Preparação de materiais e reagentes
   1. Permita que a proteína, lipídios e BSA (albumina de soro bovino) se equilibrem até a temperatura ambiente.
   2. Durante este tempo, limpe as tampas colocando-as em metanol e sonicando por 30 min a 40 °C. Certifique-se de que o metanol cubra completamente as manchas e que o nível de água no banho de água esteja acima do nível do metanol no recipiente.
      NOTA: O metanol é tóxico e deve ser manuseado em capô químico apropriado.
   3. Seque o excesso de metanol nas tampas com um fluxo suave de ar. Coloque o rack de deslizamento coberto em um forno de 40 °C por 15 minutos para garantir que as tampas em excesso sequem.
   4. Comece o processo de limpeza do plasma. Primeiro, coloque as tampas no limpador de plasma e feche a válvula de entrada de ar para evacuar todo o ar dentro da câmara.
   5. Uma vez que a câmara esteja sob vácuo, limpe as tampas por 5 minutos usando uma configuração de alta potência rf e um vácuo quase completo, com apenas uma leve entrada de ar na câmara de vácuo. Para garantir o nível adequado de plasma, ajuste a abertura da câmara de vácuo de modo que a cor resultante do plasma seja um rosa estável e brilhante.
      NOTA: É crucial ao usar o ar que o plasma permanece uma cor rosa brilhante durante a duração da etapa de tratamento plasmápide, pois uma cor roxa mais escura indica que há uma quantidade inadequada de ar na câmara e resultará em um tratamento de plasma subótimo.
   6. Uma vez que os 5 minutos tenham passado, desligue a energia RF e solte o vácuo.
      NOTA: Após a remoção da câmara de plasma, certifique-se de que as manchas permanecem cobertas.
2. Preparação de hidrogel
   1. Combine 6 mg de temperatura de fusão ultra-baixa com 300 μL de água ultrauso (ou seja, 2% (w/v) agarose).
      NOTA: 2% de agarose serão usados para fazer GUVs livres de proteínas. A solução de agarose pode ser mantida a 45 °C por dois dias.
   2. Combine 9 mg de temperatura ultra-baixa agarose com 300 μL de água ultrapura por 3 w/v% agarose como preparado na etapa 3.1. 3% de agarose será usado para fazer GUVs incorporados de proteína.
   3. Vórtice a solução brevemente antes de colocá-los no bloco de calor de 90 °C por 10 minutos. Em seguida, o vórtice do tubo novamente antes de transferi-lo para um bloco de calor de 45 °C para mantê-lo na forma derretida até que use mais.
3. Agarose e mistura de proteínas
   1. Misture 21 μL de 3% de agarose com os 7 μL de fragmentos de membrana _5-HT1AR. Pipeta para cima e para baixo lentamente muitas vezes para garantir a mistura adequada. Em seguida, incubar a 45 °C por 1 min.
4. Deposição de hidrogel e lipídida
   1. Para GUVs livres de proteínas: Faça uma película fina em tampas recém-limpas com plasma usando 20 μL de 2% de agarose. Solte rapidamente outra mancha de cobertura em cima da gotícula de agarose e deslize suavemente as tampas para fazer uma película fina em ambas as tampas.
      NOTA: Este passo é complicado na medida em que o deslizamento da gota deve ocorrer enquanto a agarose ainda está na forma derretida.
   2. Para GUVs incorporados por proteínas: Pipeta a mistura proteína/agarose para cima e para baixo mais uma vez, e, em seguida, depositar 20 μL dos 2% de agarose em uma tampa limpa de plasma. Siga as instruções de desemrapante, conforme descrito acima.
   3. Deixe a agarose gel protegido da luz por 30 minutos à temperatura ambiente.
   4. Deposite os lipídios em cima da camada agarose. Use um total de 10 μL de 2 mg/mL de 1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosforcholina (POPC) com 0,4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl-sn-gliceo-3-fosfoetanolamina (DPPE) rotulado com ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (ou mistura lipídica de interesse) em clorofórmio em cima do filme agarose. Deposite as gotículas usando uma agulha de cromatografia a gás e espalhe uma gota de cada vez através de uma corrente de ar suave.
      NOTA: É necessário cuidado com esta etapa para fazer uma camada relativamente uniforme de lipídios em cima do hidrogel. Além disso, o clorofórmio é tóxico e deve ser manuseado em capô químico apropriado.
   5. Monte as câmaras Sykes-Moore (S-M) colocando um o-ring em cima do deslizamento de tampas e, em seguida, colocando o componente superior da câmara em cima do anel O. Use a chave fornecida pelo fabricante para montar a câmara, aparafusando os componentes da câmara para selar a câmara e evitar qualquer vazamento.
      NOTA: A parte superior da câmara deve ser apertada no anel O, mas é necessário cautela para garantir que o deslizamento de tampa permaneça intacto, pois o deslizamento de tampa pode rachar se o anel O não se sentar corretamente na câmara. Além disso, certifique-se de que a câmara esteja bem fechada para que a câmara não vaze quando a solução de inchaço for adicionada. A não ressarcimento da câmara resultará em vazamentos e perda de amostra.
5. Inchaço e colheita de vesículas
   1. Hidrate todo o sistema, tubondo suavemente 450 μL de sacarose de 200 mM em 1x PBS e tocando suavemente as câmaras para garantir uma cobertura tampão adequada das camadas hidrogel-lipídicas.
      NOTA: A solução de sacarose pode ser substituída por um tampão de reidratação contendo sondas biológicas de interesse.
   2. Coloque as câmaras a 45 °C e cubra a parte superior da câmara com uma tampa para evitar a evaporação. Deixe a amostra inchar, protegida de detritos e luz por 1h.
   3. Adicione 100 μL de 1 mg/mL BSA em água ultrauso em cada poço de uma placa de 96 poços destinada a ser usada. Incubar em temperatura ambiente por 1h.
   4. Lave três vezes com água ultra-pura e uma vez com sacarose de 200 mM em 1x PBS.
   5. Por fim, adicione 200 mM de glicose em 1x PBS até a adição da solução amostral GUV.
      NOTA: O BSA foi usado para bloquear a adsorção do GUV.
   6. Depois de permitir que o hidrogel incha, agite suavemente e bata na câmara para desalojar quaisquer GUVs que possam permanecer ligados à superfície do hidrogel. Em seguida, cuidadosamente pipeta até a solução GUV-sucrose.
      NOTA: Como um passo opcional para garantir que todas as vesículas sejam separadas da superfície, pipete suavemente parte da suspensão de sacarose de volta para a superfície do hidrogel.
   7. Mova a suspensão para um tubo de microcentrifuuge previamente preparado contendo 700 μL de glicose de 200 mM em 1x PBS.
      NOTA: O gradiente de densidade levará à fixação das vesículas na parte inferior do tubo centrífuga.
   8. Permita que as vesículas se contentem por mais uma hora para garantir que as vesículas possam afundar até o fundo do tubo de microcentrifusagem, permitindo uma coleta ideal.
   9. Após a fixação de GUVs em glicose, transfira 300 μL da parte inferior do tubo de centrífuga (as vesículas assentadas) para a placa de 96 poços previamente preparada e tratada por BSA para examinar as vesículas sob o microscópio confocal.
      NOTA: Certifique-se de evitar a parte inferior do tubo de microcentragem para minimizar a quantidade de detritos coletados na amostra final.
6. Verifique as amostras sob o microscópio.
   1. Brilhe um laser de 488 nm na amostra (que nos permite visualizar a membrana, já que a bicamada foi rotulada com ATTO-488-DPPE).
   2. Brilhe um laser de 561 nm na amostra (que nos permite visualizar a proteína, uma vez que foi rotulada com NHS-Rhodamine).
      NOTA: É necessário ter cuidado ao ver a amostra como a fotooxidação pode desestabilizar as vesículas. Vesículas foram observadas no mesmo dia.

Figura 1: Ilustração das etapas detalhadas do protocolo. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

A concentração de proteína foi medida, e o grau de rotulagem foi calculado como a razão molar entre o corante e a proteína a ser de 1:1. Examinando os GUVs utilizando microscopia confocal, pudemos confirmar a formação bem sucedida e a integração proteica das vesículas. Os lipídios foram rotulados com 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, e a proteína foi rotulada covalentemente através da modificação de rhodamina NHS-éster de aminas primárias. A Figura 2a e a Figura 2...

Discussão

Identificamos duas etapas que são fundamentais para o sucesso do protocolo geral: tratamento plasmás e deposição lipídica. A limpeza plasmática das tampas é essencial para garantir que haja cobertura adequada e adesão do hidrogel agarose ao deslizamento de tampas de vidro. A limpeza plasmática realiza duas coisas: primeiro, remove vestígios de matéria orgânica da superfície do vidro; segundo, ativa a superfície do deslizamento de tampas, permitindo um aumento na capacidade de verícula à medida que a hidro...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882