胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

要約

本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与する様々なステップを実証する。再生または完全に回復した角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。

要約

ひよこの胚性角膜創傷は完全かつ迅速に再生する顕著な能力を示すが、成人の創傷角膜は線維性瘢痕化による透明性の喪失を経験する。損傷した胚性角膜の組織完全性は、検出可能な瘢痕形成なしに本質的に回復される。そのアクセス性と操作の容易さを考えると、ひよこ胚は瘢痕のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルです。このプロトコルは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与するさまざまなステップを示しています。第一に、卵子は初期胚期に窓を開けられ、眼にアクセスする。第二に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作が行われ、角膜の3つの細胞層が形成されるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にする。第三に、外側上皮層および前間質を貫通する線状角膜創傷は、顕微手術ナイフを用いて作製される。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。このモデルを用いたこれまでの研究では、創傷胚性角膜が角化細胞分化の活性化を示し、ECMタンパク質の天然の三次元マクロ構造への協調的なリモデリングを受け、角膜感覚神経によって適切に再神経支配されることが明らかになった。将来的には、再生プロセスに対する内因性または外因性因子の潜在的な影響は、組織移植、エレクトロポレーション、レトロウイルス感染、またはビーズ移植などの発生生物学技術を使用して、治癒角膜において分析することができる。現在の戦略は、胚性ひよこを、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的要因を解明するための重要な実験パラダイムとして特定している。

概要

角膜は、視力を助長する光を透過および屈折させる透明で、最も外側の眼の組織である。成人角膜において、角膜間質への損傷または感染は、角化細胞増殖、線維症、サイトカイン誘発アポトーシスにつながる炎症の増加、修復筋線維芽細胞の生成、および細胞外マトリックス(ECM)の全体的なリモデリングを特徴とする迅速かつ堅牢な創傷治癒応答をもたらす^1,2.損傷後、このような角膜組織修復は、角膜の透明性を低下させ、光の通過を閉塞し、したがって視力を歪め、最も重篤な症例では角膜失明につながる不透明な瘢痕組織をもたらす³。したがって、創傷治癒の複雑さに対処し、創傷閉鎖および組織再生に関与する細胞因子および分子因子を同定するために、信頼できる動物モデルを開発することが明らかに必要である。

今日まで、角膜創傷治癒を調べるほとんどの研究は、出生後⁴または成体動物モデル¹、²、^5、6、7を利用してきた。これらの研究は、角膜創傷治癒応答および瘢痕形成の根底にあるメカニズムの理解において著しい進歩をもたらしたが、これらの治癒モデルにおける損傷した角膜組織は完全に再生できず、したがって、損傷後の角膜形態および構造を完全に反復させる分子因子および細胞機構を同定するための有用性を制限する。対照的に、胎児のひよこ角膜にナイフで生じた胎児の傷は、瘢痕のない方法で完全に治癒する固有の能力を有する⁸。具体的には、胚性ヒナギ角膜は、細胞外マトリックス構造の完全な反復および神経支配パターン^8、9を有する非線維性再生を示す。

本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで巻き取ることに関与する一連のステップを記載する。第一に、卵子は、胚へのアクセスを容易にするために、初期胚期にウィンドウ化される。第2に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作は、角膜の3つの細胞層が形成され、創傷が望まれるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にするために行われる。第三に、角膜上皮を通って前足間質に貫通する線状中枢角膜切開は、顕微手術ナイフを用いて行われる。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。

プロトコル

このプロトコルで使用された卵の株はホワイトレグホーンであり、すべての動物の手順はイリノイウェズリアン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1.ひよこの卵の孵化

1. 卵を産卵後最大1週間〜10°Cに保ち、発育を停止します。ひよこの胚の発生を開始する準備ができたら、室温の水で飽和させた糸くずの出ないワイプ( 材料表を参照)で卵殻全体を拭き取り、汚れや破片を取り除きます。
2. 卵の殻が消毒されていることを確認してください。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の表面全体を拭き取ります。エタノールをすばやく拭き取って卵を乾燥させ、卵殻から胚へのエタノール吸収を避けます。
3. 卵をトレイの上に水平に配置します。卵の上部にマークを付けて、胚の予想される位置を示します。卵を水平にインキュベートし、ロッキング機能を有効にして、38°Cの加湿インキュベーター内で孵化させる。

2.膜解剖の準備のために卵を窓にする

1. 胚発生の3日目(E3)にインキュベーターから卵を取り出す。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の上部を殺菌します。卵殻表面からエタノールを乾燥させる。
   注:ウィンドウ手順中に発育が遅れないようにするために、6〜12個の卵を除去し、残りの卵をインキュベーターに残したまま、これらの卵に対して手順を迅速に実施した。
2. 卵を安全な卵ホルダーに水平に置きます( 材料表を参照)。解剖ハサミの鋭い端を使用して、卵の尖った端の近くに卵殻の上部に小さな穴を開けます。
   注:この穴は卵黄と胚を内側の卵殻表面から落とすために必要な卵白の除去を容易にします。卵所有者のために、卵が出荷される紙パルプ卵フィラーフラットが使用されました。
3. 穴を通して(ステップ2.2)、18Gの斜めの皮下注射針を挿入します。針を卵の底部内面に押し込み、針の斜め側を卵の尖った端に向け(例えば、卵黄と胚の予想される位置から卵の真ん中近くから離して)、鶏の卵から2〜3mLの卵白を取り除き、捨てる。
   注:このステップ中に針が胚またはそれに関連する血管系に刻まれると、卵白で血液が吸引されます。これは胚の死をもたらすでしょう。さらに、このステップ中に卵黄が卵白と一緒に誤って吸引された場合、胚は生存不能になる。いずれの場合も、胚を直ちに他の目的に使用できない場合は、卵子を捨てるべきです。
4. 70%エタノールで軽く湿らせた糸くずの出ないワイプで穴を囲む卵殻の表面をきれいにし、乾いた拭き取ります。卵白を除去するために作った穴を透明なテープで密封します。
5. 解剖ハサミの鋭い端で、マーキング部位の卵殻の上部に2番目の「窓」穴を開けます(ステップ1.3)。はさみが卵殻にあまりにも遠くまで伸びないようにして、胚または胚性血管系(しばしば卵の中に第2の穴の部位の真下に位置する)に接触して損傷するのを避けるようにする。
6. 湾曲した虹彩鉗子を使用して、「窓」の穴を直径約2〜3cmに広げ、殻の下の発達中の胚への「窓」として機能します。
   1. 鉗子の一方の端を穴に挿入し、卵の殻と平行に、そして密接に並置するようにします。もう一方の鉗子の端を卵殻の外側に配置して、2つの鉗子の端を慎重につまんで、卵殻の小さな部分を壊して取り除くことができます。胚を直接覆う2〜3cmの窓が残るまで、卵殻の破片を壊して取り除き続けます。
      注:ステップ2.6で作った穴の真下に胚が産まない卵。今後の膜解剖を完了するのが難しいため、使用しないでください。卵を水平に揺らしても、卵の約10%は胚の位置が悪いために使用できません。これらの胚は、他の目的に使用することができる。
7. 細菌汚染を制限するために、ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質(ペニシリン50U/mLおよびストレプトマイシン50μg/mL)を含むリンゲル溶液(NaCl8g、KCl0g、および蒸留_H20 0 Lあたり0.23gのCaCl _{2.2H 2}0)を窓の穴から(例えば卵の中に)加え、 材料表を参照)。
8. 窓の穴は透明な粘着テープでシールします。テープの角を穴の長軸に合わせ、穴の端から約1〜2cm離れたシェルにテープを押し付けて、卵のシールを行います。
   1. テープの垂れ下がったフラップが片側に残るまで、開口部の周りをシールし続けます。2枚のテープを一緒に押して穴の上にドーム型を作り、張り出したテープのフラップを殻に押し付けて卵を密封し終えます。
      注:卵はE2またはE3のいずれかでウィンドウ化する必要があります。経験によると、E2の前にウィンドウイングすると、胚の生存率が低下します。さらに、E4によって、胚および胚外膜が卵殻¹⁰に付着し、E4以降で窓を張ろうとする試みは、しばしば胚損傷または胚外血管の引き裂きをもたらし、いずれかの事象が胚死の結果につながる。
9. さらなる発達のために「窓付きの」卵をインキュベーターに戻します。卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能をオフにしてください。
10. 手順 2.2.-2.9 を繰り返します。各卵のために。

3. 胚外膜のマイクロダイセクション

1. E5.5ウィンドウ付き卵をインキュベーターから取り出します。滅菌した解剖はさみで窓からテープを切断して胚を露出させます。
2. 解剖顕微鏡を使用して、窓から胚とその胚外膜を観察します。必要に応じて、はさみまたは湾曲した虹彩鉗子を使用して窓を広げ、胚が窓の下によく配置されるようにし、胚の血管系を傷つけないように注意する。
   1. ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンガーの溶液を2滴加えて、胚を水和させ、卵子を滅菌する。
3. 解剖顕微鏡を使用して、胚が適切な発生段階(ハンバーガーハミルトン段階27、〜E5.5)^11,12にあることを確認し、羊膜(ACM)および脈絡膜(CAM)の位置を特定します。
   注:この段階では、胚は、羊膜と融合した絨毛膜と、胚の腸領域から伸び、重ねられた絨毛膜と融合してCAM^11,12を形成する高度に血管化されたアラントワによって部分的に覆われたACMに囲まれています。ACMは血管新生があまりないため、これらの膜を解剖して血管を損傷したり胚を傷つけたりすることなく胚を露出させることができます。
4. この段階で胚外膜解剖を行う(E5.5)。
   注:E5.5は、胚外膜解剖を行うのに理想的な時期です。CAM形成前に膜を早期に(例えばE4で)解剖すると、後の段階¹¹で胚のアクセス性が低下する。さらに、E5.5では、胚は高度に血管化されたCAMによって部分的にしか覆われていないが、次の1〜2日間で、CAMはすぐに胚を包み込み、さらなるアクセスを妨げる^11,12。このため、E6以降での膜解剖は、血管を裂くリスクが高まるため、困難である。
   1. 滅菌した細い鉗子を使用してACMを優しくつかみ、胚から引き離します。次に、滅菌されたマイクロ解剖ハサミを使用して、前肢を覆う膜から頭部を覆う膜まで伸びる前肢の真上のACMの穴を切断する。
      注:このステップは、絨毛膜および羊膜を弛緩させるため、次のステップで鉗子でつかんでさらに解剖することが容易になります。膜が卵殻窓を通してどのように解剖されるかの有用な概略については、 図1 を参照してください。
5. ACMとCAMの間の2つの隣接する位置(例えば、前肢の上に作られた切り込みとCAMの最も近い端との間の領域)で羊膜を優しくつかむために、2対の微細で滅菌された鉗子を使用する。
   1. 羊膜をしっかりと把持している各ペアの鉗子を慎重に動かし、一方のペアを胚に対して背方向に動かし、もう一方を腹側に移動します。
      注:この動きは、ACM(1対の鉗子によって胚に対して背側に引っ張られる)とCAM(他の一対の鉗子によって胚に対して腹側に引っ張られる)を分離しながら、羊膜をさらに引き裂くのに役立つ。
   2. CAMが胚を覆わなくなったときに膜が分離され、胚の腸からCAMに発せられるアラント動脈および静脈が容易に明らかであることを確認する。
6. 滅菌された細かい鉗子を使用して、胚を覆っている残りの羊膜を解剖して除去します。残りの羊膜が胚の尾半分を部分的に覆うことが最も一般的に観察される。
   1. 滅菌した鉗子を使用して、胚の頭蓋中央領域付近の羊膜をつかみ、胚に対して尾方向に羊膜を慎重に引っ張り、以前の変位したCAMに向かってください。胚は完全に露出し、CAMのさらなる成長は主に発達中の胚から離れて起こる。
      注:膜解剖後に露出した胚がどのように現れるかについての有用な概略図については、 図1 を参照してください。また、ステップ 3.3.-3.6 の役立つ概略図については、以前に公開されたレポート¹¹ を参照してください。
7. ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を数滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。
8. ステップ 2.8 の説明に従って、透明なテープを使用して窓の穴を密封し直します。さらなる発達のために卵をインキュベーターに戻し、卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能を不活性化したままにする。
9. 手順 3.1.-3.8 を繰り返します。各卵のために。
   注:上記のE5.5での胚外膜解剖は、E7を介して胚へのアクセスを可能にするが、これは創傷を行うことができるときである^8,9。E8によって、CAM組織の継続的な成長は胚の頭蓋領域を覆い始め、したがって角膜へのさらなるアクセスを排除する。古いE8-E9角膜で創傷を行いたい場合は、胚に対して成長中のCAMを腹側に再配置することが可能である(ステップ3.10。E7で巻きたい場合は、ステップ3.10。行う必要はなく、1つはステップ4、角膜創傷に進むことができる。
10. E5.5で胚外膜を解剖したE7卵子をインキュベーターから取り出します(ステップ3.1.-3.8)。CAMに融合した利用可能な羊膜組織を滅菌鉗子でつかみ、胚に対して腹側方向に胚の頭蓋領域から羊膜を静かに引き離す。
    注:胚から離れて移動している羊膜はCAMに融合されているため、成長し血管化されたCAMは羊膜をつかむ鉗子に追従し、頭蓋領域から離れます。このステップを毎日繰り返して、胚が創傷のための所望の年齢になるまで、CAMを胚から遠ざけ続ける。

4. 角膜損傷

1. 所望の胚期に創傷するためのインキュベーターE7-E9から卵子を得る。滅菌した解剖はさみで窓からテープを切断して胚を露出させます。ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を数滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。
2. マイクロ解剖ナイフを使用して、脈絡膜の亀裂に平行で、脈絡膜の亀裂に沿った右目の角膜の範囲にまたがる切開(胚が卵にどのように産むかのために、左目はアクセスできないが、創傷していない対照として役立つことができる)を行う(図1)。最初のカットは角膜上皮を横断します。
   1. マイクロ解剖ナイフを使用して、最初の切開と同じ場所で角膜を2倍以上裂傷(例えば、合計3回の切断、切断2および切断3が切断1と同じ位置で角膜内の同じ位置とともに生じる)¹¹。第2の裂傷は基底膜を横断し、第3の裂傷は前間質を貫通する。
      注:胚が解剖されたCAMの下に落ち着いた場合は、滅菌された湾曲した虹彩鉗子を使用して、CAMの下から頭を慎重に動かすことができます。湾曲した虹彩鉗子を頭の下に置き、頭の左側に接触させます。閉じた湾曲した虹彩鉗子の上に頭全体を抱きかかえ、CAMの周りと上に頭をそっと上げます。生存率を助けるために、湾曲した虹彩鉗子で同様の技術を使用して、CAMの適切な成長を促進するために、手術後に胚をCAMの下に戻す。
3. ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を3〜4滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。
4. 透明なテープで窓の穴を再シールし、卵を水平のままインキュベーターに戻します。胚が発達し、角膜創傷が所望の期間(例えば、0.5〜11日)治癒するのを許し、次いで断頭によって胚を人道的に安楽死させる。
5. 湾曲した虹彩鉗子を使用して、リンガーの生理食塩水の入ったペトリ皿に浮かぶ安楽死胚から目を収穫するには、目と顔の組織が出会う後側の目を優しくつかみ、目全体を慎重に持ち上げて顔の組織から解放します。
   1. 細かい鉗子を使用して、目の後ろの小さな穴(3〜5cm)を突いて、軽度の攪拌で一晩4°Cで4%パラホルムアルデヒドに目全体を固定します。

結果

E5.5でACMとCAMを早期に解剖して発育中の胚の頭蓋領域を露出させた後、E7中央角膜にまたがる一連の裂傷が 卵子で 行われました(図1)。角膜再生を研究するのに理想的な創傷は、それぞれが角膜の同じ場所で作られた3つの裂傷の後に起こる。第1の裂傷は角膜上皮を横断し、第2および第3の裂傷はそれぞれ下層の基底膜および前中質を貫通する。理想的な創傷を達成?...

ディスカッション

ひよこは胎児の、傷跡のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルシステムです。哺乳類とは異なり、ひよこは、 ovo⁸または ex ovo戦略²⁴を用いて、開発全体を通して容易にアクセス可能である。胚性のひよこ角膜はげっ歯類の角膜よりもはるかに大きく、頭蓋容積のほぼ50%が眼²⁵に捧げられており、創傷などの物理的...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a