Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti

Riepilogo

Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.

Abstract

Le ferite corneali embrionali di pulcino mostrano una notevole capacità di rigenerarsi completamente e rapidamente, mentre le cornee ferite adulte sperimentano una perdita di trasparenza a causa di cicatrici fibrotiche. L'integrità tissutale delle cornee embrionali danneggiate viene intrinsecamente ripristinata senza formazione di cicatrici rilevabili. Data la sua accessibilità e facilità di manipolazione, l'embrione di pulcino è un modello ideale per studiare la riparazione della ferita corneale senza cicatrici. Questo protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. In primo luogo, le uova vengono finestre in età embrionale precoce per accedere all'occhio. In secondo luogo, una serie di manipolazioni fisiche in ovo alle membrane extraembrionali sono condotte per garantire che l'accesso all'occhio sia mantenuto attraverso le fasi successive dello sviluppo, corrispondenti a quando si formano i tre strati cellulari della cornea. In terzo luogo, le ferite corneali lineari che penetrano nello strato epiteliale esterno e nello stroma anteriore sono realizzate utilizzando un coltello microchirurgico. Il processo di rigenerazione o le cornee completamente ripristinate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari dopo la procedura di ferita. Studi condotti finora con questo modello hanno rivelato che le cornee embrionali ferite mostrano l'attivazione della differenziazione dei cheratociti, subiscono un rimodellamento coordinato delle proteine ECM alla loro macrostruttura tridimensionale nativa e diventano adeguatamente innervate dai nervi sensoriali corneali. In futuro, il potenziale impatto di fattori endogeni o esogeni sul processo rigenerativo potrebbe essere analizzato nella guarigione delle cornee utilizzando tecniche di biologia dello sviluppo, come l'innesto di tessuto, l'elettroporazione, l'infezione retrovirale o l'impianto di perline. L'attuale strategia identifica il pulcino embrionale come un paradigma sperimentale cruciale per chiarire i fattori molecolari e cellulari che coordinano la guarigione delle ferite corneali senza cicatrici.

Introduzione

La cornea è il tessuto trasparente più esterno dell'occhio che trasmette e rifrange la luce favorevole all'acuità visiva. Nella cornea adulta, il danno o l'infezione allo stroma corneale porta a una risposta di guarigione delle ferite rapida e robusta caratterizzata da proliferazione dei cheratociti, fibrosi, aumento dell'infiammazione che porta ad apoptosi indotta da citochine, generazione di miofibroblasti di riparazione e rimodellamento generale della matrice extracellulare (ECM)^1,2 . A seguito di lesioni, tale riparazione del tessuto corneale si traduce in tessuto cicatriziale opaco che riduce la trasparenza corneale e occlude il passaggio della luce, distorcendo così la visione e, nei casi più gravi, portando alla cecità corneale³. Pertanto, vi è una chiara necessità di sviluppare modelli animali affidabili per affrontare le complessità della guarigione delle ferite e identificare i fattori cellulari e molecolari responsabili della chiusura delle ferite e della rigenerazione dei tessuti.

Ad oggi, la maggior parte degli studi che esaminano la guarigione delle ferite corneali hanno utilizzato modelli animali post-natali⁴ o adulti ^1,2,5,6,7. Mentre questi studi hanno portato a un significativo progresso nella comprensione della risposta di guarigione delle ferite corneali e dei meccanismi alla base della formazione di cicatrici, i tessuti corneali danneggiati in questi modelli di guarigione non riescono a rigenerarsi completamente, limitando così la loro utilità per identificare i fattori molecolari e i meccanismi cellulari responsabili della completa ricapitolazione della morfologia corneale e della struttura post-lesione. Al contrario, le ferite fetali generate con un coltello nella cornea embrionale del pulcino possiedono una capacità intrinseca di guarire completamente in modo senza cicatrici⁸. In particolare, la cornea embrionale del pulcino mostra una rigenerazione non fibrosa con la completa ricapitolazione della struttura della matrice extracellulare e dei modelli di innervazione ^8,9.

Il presente protocollo descrive una sequenza di passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. In primo luogo, le uova vengono finestrate in età embrionale precoce per facilitare l'accesso all'embrione. In secondo luogo, una serie di manipolazioni fisiche in ovo alle membrane extraembrionali sono condotte per garantire che l'accesso all'occhio sia mantenuto attraverso le fasi successive dello sviluppo, corrispondenti a quando si formano i tre strati cellulari della cornea e si desidera la ferita. In terzo luogo, le incisioni lineari della cornea centrale che penetrano attraverso l'epitelio corneale e nello stroma anteriore sono fatte usando un coltello microchirurgico. Il processo di rigenerazione o le cornee completamente ripristinate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari dopo la procedura di ferita.

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Protocollo

Il ceppo di uova utilizzato in questo protocollo era White Leghorn e tutte le procedure animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Illinois Wesleyan University.

1. Incubazione di uova di pulcino

1. Mantenere le uova a ~ 10 ° C per un massimo di 1 settimana dopo che sono state deposte per arrestare lo sviluppo. Quando sei pronto per iniziare lo sviluppo dell'embrione di pulcino, pulisci l'intero guscio d'uovo con salviette prive di lanugine (vedi Tabella dei materiali) sature di acqua a temperatura ambiente per rimuovere sporco e detriti.
2. Assicurarsi che il guscio d'uovo sia igienizzato. Pulire l'intera superficie dell'uovo con salviette prive di lanugine inumidite con etanolo al 70%. Pulire rapidamente l'etanolo per asciugare l'uovo ed evitare l'assorbimento di etanolo attraverso il guscio d'uovo all'embrione.
3. Disporre le uova orizzontalmente su un vassoio. Segna la parte superiore dell'uovo per indicare la posizione prevista dell'embrione. Incubare le uova orizzontalmente, attivata la funzione di dondolo, in un incubatore umidificato a 38 °C.

2. Finestre delle uova per prepararsi alla dissezione della membrana

1. Rimuovere le uova dall'incubatrice il terzo giorno di sviluppo embrionale (E3). Sterilizzare la parte superiore delle uova con salviette prive di lanugine inumidite con etanolo al 70%. Asciugare l'etanolo dalle superfici del guscio d'uovo.
   NOTA: Per garantire che lo sviluppo non sia stato ritardato durante la procedura di finestratura, sono state rimosse 6-12 uova e la procedura è stata eseguita rapidamente su queste mentre le uova rimanenti sono state lasciate nell'incubatrice.
2. Posizionare un uovo orizzontalmente in un portauova sicuro (vedere Tabella dei materiali). Usando l'estremità affilata delle forbici di dissezione, crea un piccolo foro nella parte superiore del guscio d'uovo vicino all'estremità appuntita dell'uovo.
   NOTA: Questo foro faciliterà la rimozione dell'albume, che è necessario per far cadere il tuorlo e l'embrione lontano dalla superficie interna del guscio d'uovo. Per i portauova sono stati utilizzati piatti di riempimento delle uova di pasta di carta, all'interno dei quali le uova vengono spedite.
3. Attraverso il foro (passo 2.2.), inserire un ago ipodermico smussato da 18 G. Con l'ago spinto sulla superficie interna inferiore dell'uovo e il lato smussato dell'ago rivolto verso l'estremità appuntita dell'uovo (ad esempio, lontano dalla posizione prevista del tuorlo e dell'embrione vicino al centro dell'uovo), rimuovere 2-3 ml di albume dall'uovo di gallina e scartare.
   NOTA: Se l'ago colpisce l'embrione o la sua vascolarizzazione associata durante questa fase, si tradurrà in sangue aspirato con l'albume. Ciò comporterà la morte dell'embrione. Inoltre, se il tuorlo viene inavvertitamente aspirato insieme all'albume durante questa fase, l'embrione non sarà vitale. In entrambi i casi, l'uovo deve essere scartato se l'embrione non può essere immediatamente utilizzato per altri scopi.
4. Pulire la superficie del guscio d'uovo che circonda il foro con salviette prive di lanugine leggermente inumidite con etanolo al 70% e asciugare. Sigillare il foro fatto per rimuovere l'albume con nastro trasparente.
5. Con l'estremità affilata delle forbici di dissezione, fare un secondo foro "finestra" nella parte superiore del guscio d'uovo nel sito di marcatura (Passo 1.3.). Assicurarsi che le forbici non si estendano troppo lontano nel guscio d'uovo per evitare di contattare e danneggiare l'embrione o la vascolarizzazione embrionale, che spesso sarà posizionata all'interno dell'uovo direttamente sotto il sito del secondo foro.
6. Usando una pinza dell'iride curva, allarga il foro della "finestra" per estendersi di ~ 2-3 cm di diametro e fungere da "finestra" per l'embrione in via di sviluppo sotto il guscio.
   1. Inserire un'estremità della pinza nel foro, mantenendola parallela e strettamente giustapposta al guscio d'uovo. Con l'altra estremità della pinza posizionata all'esterno del guscio d'uovo, pizzicare con cura le due estremità della pinza insieme, permettendo loro di rompere e rimuovere piccoli pezzi del guscio d'uovo. Continuare a rompere e rimuovere i frammenti di guscio d'uovo fino a quando rimane una finestra di 2-3 cm che si sovrappone direttamente all'embrione.
      NOTA: Uova in cui gli embrioni non giacciono direttamente sotto il foro fatto nella fase 2.6. non deve essere usato in quanto le prossime dissezioni a membrana sarebbero difficili da completare. Anche con la rotazione orizzontale delle uova, circa il 10% delle uova è inutilizzabile a causa dello scarso posizionamento dell'embrione. Questi embrioni possono essere utilizzati per altri scopi.
7. Per limitare la contaminazione batterica, aggiungere attraverso il foro della finestra (ad esempio, nell'uovo) ~ 100-200 μL di soluzione di Ringer (8 g di NaCl, 0,37 g di KCl e 0,23 g di_{CaCl 2,2H 2}0 per L di H₂0 distillato) contenente antibiotici Penicillina/Streptomicina (50 U/mL di Penicillina e 50 μg/mL di Streptomicina, vedi Tabella dei materiali).
8. Sigillare il foro della finestra con nastro adesivo trasparente. Eseguire la sigillatura dell'uovo allineando un angolo del nastro sull'asse lungo del foro e premendo il nastro sul guscio a ~ 1-2 cm di distanza dal bordo del foro.
   1. Continuare a sigillare intorno all'apertura fino a quando un lembo di nastro adesivo appeso viene lasciato su un lato. Premere i due pezzi di nastro insieme, creando una forma a cupola sopra il foro, e premere il lembo di nastro adesivo sul guscio per finire di sigillare l'uovo.
      NOTA: le uova devono essere posizionate all'E2 o all'E3. Secondo l'esperienza, la finestra prima di E2 si traduce in una bassa vitalità embrionale. Inoltre, con E4, l'embrione e le membrane extraembrionali si attaccano al guscio d'uovo¹⁰, e qualsiasi tentativo di finestra a E4 o successivamente spesso provoca danni all'embrione o lacerazione dei vasi sanguigni extraembrionali, con entrambi gli eventi che portano all'esito della morte dell'embrione.
9. Restituire le uova "finestrate" all'incubatrice per un ulteriore sviluppo. Assicurarsi di mantenere le uova orizzontali e disattivare la funzione di oscillazione dell'incubatrice.
10. Ripetere i passaggi 2.2.-2.9. per ogni uovo.

3. Microdissezioni delle membrane extraembrionali

1. Rimuovere un uovo finestrato E5.5 dall'incubatrice. Esporre l'embrione tagliando il nastro lontano dalla finestra con forbici da dissezione sterilizzate.
2. Utilizzare un microscopio di dissezione per osservare l'embrione e le sue membrane extraembrionali attraverso la finestra. Se necessario, utilizzare forbici o pinze di iride curva per allargare la finestra in modo che l'embrione sia ben posizionato sotto la finestra, facendo attenzione a non danneggiare la vascolarizzazione embrionale.
   1. Aggiungere due gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
3. Utilizzare un microscopio di dissezione per garantire che l'embrione sia nella fase di sviluppo corretta (stadio hamburger Hamilton 27, ~ E5.5) ^11,12 e individuare le posizioni della membrana amniocorionica (ACM) e della membrana corioallantoica (CAM).
   NOTA: In questa fase, l'embrione è circondato dall'ACM, che comprende la membrana amniotica e la membrana corionica sovrastante fusa e parzialmente coperta dall'allantoide altamente vascolarizzata, che si estende dalla regione intestinale dell'embrione e si fonde con il corion sovrapposto per formare il CAM^11,12. L'ACM non è fortemente vascolarizzato, il che consente di sezionare queste membrane per esporre l'embrione senza danneggiare i vasi sanguigni e danneggiare l'embrione.
4. Eseguire dissezioni extraembrionali della membrana in questa fase (E5.5).
   NOTA: E5.5 è il momento ideale per eseguire le dissezioni extraembrionali della membrana. Sezionare le membrane prima (ad esempio, a E4) prima della formazione di CAM riduce l'accessibilità dell'embrione nelle fasi successive¹¹. Inoltre, a E5.5, l'embrione è solo parzialmente coperto dalla CAM altamente vascolarizzata, ma nei prossimi 1-2 giorni, la CAM avvolge rapidamente e preclude ulteriormente l'accesso all'embrione^11,12. Per questo motivo, la dissezione della membrana a E6 o successivamente è difficile in quanto aumenta il rischio di lacerazione dei vasi sanguigni.
   1. Utilizzare un paio di pinze sottili sterilizzate per afferrare delicatamente l'ACM e allontanarlo dall'embrione. Quindi utilizzare forbici micro-dissezionanti sterilizzate per tagliare un foro nell'ACM direttamente sopra l'arto anteriore che si estende dalla membrana sovrastante l'arto anteriore alla membrana sovrastante la testa.
      NOTA: Questo passaggio rilassa le membrane di corione e amnione, rendendole così più facili da afferrare e sezionare ulteriormente con una pinza nei passaggi successivi. Vedere la Figura 1 per uno schema utile di come le membrane vengono sezionate attraverso la finestra del guscio d'uovo.
5. Utilizzare due paia di pinze sottili e sterili per afferrare delicatamente l'amnione in due posizioni adiacenti tra l'ACM e il CAM (ad esempio, un'area tra il taglio effettuato sopra l'arto anteriore e il bordo più vicino del CAM).
   1. Muovi con attenzione ogni coppia di pinze, entrambe afferrando saldamente la membrana amniotica, lontano l'una dall'altra, con una coppia che si muove dorsalmente verso l'embrione e l'altra ventralmente.
      NOTA: Questo movimento serve a strappare ulteriormente l'amnione mentre separa anche l'ACM (che viene tirato nella direzione dorsale rispetto all'embrione da un paio di pinze) e il CAM (che viene tirato nella direzione ventrale rispetto all'embrione dall'altra coppia di pinze).
   2. Assicurarsi che le membrane siano separate quando la CAM non copre più l'embrione e l'arteria allantoica e la vena, che emanano dall'intestino embrionale alla CAM, sono immediatamente evidenti.
6. Utilizzare pinze sottili sterilizzate per sezionare e rimuovere qualsiasi membrana di amnione rimanente che copre l'embrione. Si osserva più comunemente che l'amnione rimanente coprirà parzialmente la metà caudale dell'embrione.
   1. Usando una pinza sterilizzata, afferrare l'amnione vicino alla regione cranica centrale dell'embrione e tirare con attenzione l'amnione in direzione caudale rispetto all'embrione verso il precedente CAM spostato. L'embrione sarà ora completamente esposto e l'ulteriore crescita della CAM avverrà principalmente lontano dall'embrione in via di sviluppo.
      NOTA: Vedere la Figura 1 per uno schema utile su come apparirà l'embrione esposto dopo la dissezione della membrana. Inoltre, fare riferimento a un rapporto¹¹ pubblicato in precedenza per utili diagrammi schematici dei passaggi 3.3.-3.6.
7. Aggiungere alcune gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/ Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
8. Richiudere il foro della finestra utilizzando del nastro trasparente, come descritto nel passaggio 2.8. Riportare l'uovo all'incubatrice per un ulteriore sviluppo, mantenendo l'uovo orizzontale e mantenendo inattivata la funzione di dondolo dell'incubatore.
9. Ripetere i passaggi 3.1.-3.8. per ogni uovo.
   NOTA: Le dissezioni extraembrionali della membrana a E5.5 sopra descritte consentiranno l'accesso all'embrione attraverso E7, che è quando la ferita può essere eseguita ^8,9. Con E8, la continua crescita del tessuto CAM inizia a coprire la regione cranica dell'embrione, precludendo così un ulteriore accesso alla cornea. Se si desidera eseguire ferite in cornee E8-E9 più vecchie, è possibile riposizionare la CAM in crescita ventralmente rispetto all'embrione (Fase 3.10.). Se si desidera ferire a E7, Passo 3.10. non è necessario eseguire e si può procedere alla fase 4, ferita corneale.
10. Rimuovere un uovo E7 dall'incubatrice le cui membrane extraembrionali sono state precedentemente sezionate a E5.5 (Passi 3.1.-3.8.). Afferrare con pinze sterilizzate tutti i tessuti di membrana amnionica disponibili fusi al CAM e tirare delicatamente la membrana amnione lontano dalla regione cranica dell'embrione in direzione ventrale rispetto all'embrione.
    NOTA: Poiché la membrana amnionica che viene spostata lontano dall'embrione è fusa al CAM, la CAM in crescita e altamente vascolarizzata seguirà la pinza che afferra l'amnione e si allontanerà dalla regione cranica. Ripeti questo passaggio ogni giorno per spostare continuamente la CAM lontano dall'embrione fino a quando l'embrione non è all'età desiderata per la ferita.

4. Lesioni corneali

1. Ottenere un uovo dall'incubatrice per la ferita all'età embrionale desiderata, E7-E9. Esporre l'embrione tagliando il nastro lontano dalla finestra con forbici da dissezione sterilizzate. Aggiungere alcune gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/ Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
2. Utilizzare un coltello micro-dissezione per fare un'incisione che attraversa l'estensione della cornea dell'occhio destro (a causa di come l'embrione depone nell'uovo, l'occhio sinistro non è accessibile ma può servire come controllo non ferito), che è parallelo e in linea con la fessura coroide (Figura 1). Il primo taglio attraverserà l'epitelio corneale.
   1. Utilizzare il coltello micro-dissezione per lacerare nuovamente la cornea nello stesso punto della prima incisione 2 volte di più (ad esempio, tre tagli totali, con taglio 2 e taglio 3 che si verificano insieme alla stessa posizione nella cornea come taglio 1) ¹¹. La seconda lacerazione attraverserà la membrana basale e la terza penetrerà nello stroma anteriore.
      NOTA: Se l'embrione si è depositato sotto la CAM sezionata, si può usare una pinza dell'iride curva sterilizzata per spostare con cura la testa da sotto la CAM. Posizionare la pinza dell'iride curva sotto la testa, entrando in contatto con il lato sinistro della testa. Cullare l'intera testa sopra una pinza dell'iride curva chiusa e sollevare delicatamente la testa intorno e sopra il CAM. Per aiutare con la vitalità, utilizzare una tecnica simile con la pinza dell'iride curva per infilare l'embrione sotto la CAM dopo l'intervento chirurgico per promuovere una corretta crescita della CAM.
3. Aggiungere 3-4 gocce di soluzione di Ringer contenente antibiotici Penicillina/Streptomicina per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
4. Risigillare il foro della finestra con nastro trasparente e tornare all'incubatrice, lasciando l'uovo orizzontale. Lasciare che l'embrione si sviluppi e la ferita corneale guarisca per il periodo desiderato (ad esempio, 0,5-11 giorni), quindi eutanasizzare umanamente l'embrione per decapitazione.
5. Usa una pinza dell'iride curva per raccogliere l'occhio da un embrione eutanasizzato che galleggia in una capsula di Petri della soluzione salina di Ringer afferrando delicatamente l'occhio sul lato posteriore, dove l'occhio e il tessuto facciale si incontrano, e sollevando con cura l'intero occhio lontano e libero dal tessuto facciale.
   1. Utilizzare una pinza fine per praticare un piccolo foro (3-5 cm) nella parte posteriore di tutto l'occhio e fissare l'intero occhio in paraformaldeide al 4% a 4 °C durante la notte con lieve agitazione.

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Risultati

A seguito della precedente dissezione dell'ACM e del CAM a E5.5 per esporre la regione cranica dell'embrione in via di sviluppo, una serie di lacerazioni che attraversavano la cornea centrale E7 è stata effettuata in ovo (Figura 1). Una ferita ideale per studiare la rigenerazione della cornea si verifica dopo tre lacerazioni, ciascuna effettuata nella stessa posizione della cornea. La prima lacerazione attraversa l'epitelio corneale, mentre la seconda e la terza lacerazione penetra...

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Discussione

Il pulcino è un sistema modello ideale per studiare la riparazione della ferita corneale fetale e senza cicatrici. A differenza dei mammiferi, il pulcino è facilmente accessibile durante tutto lo sviluppo utilizzando le strategie ovo⁸ o ex ovo ²⁴. La cornea embrionale del pulcino è molto più grande delle cornee dei roditori, con quasi il 50% del volume cranico dedicato all'occhio²⁵, rendendolo altamente suscettibile di manipolaz...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a