배아 상처 병아리 각막의 흉터없는 조직 재생 조사

요약

본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.

초록

병아리 배아 각막 상처는 완전하고 신속하게 재생하는 놀라운 능력을 나타내는 반면, 성인 상처 각막은 섬유성 흉터로 인해 투명성 상실을 경험합니다. 손상된 배아 각막의 조직 무결성은 검출 가능한 흉터 형성없이 본질적으로 회복됩니다. 접근성과 조작의 용이성을 감안할 때, 병아리 배아는 흉터가없는 각막 상처 복구를 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 계란은 초기 배아 나이에 눈에 접근하기 위해 창문을 만듭니다. 둘째, 각막의 세 세포층이 형성되는 경우에 해당하는 발달의 후기 단계를 통해 눈에 대한 접근이 유지되도록 보장하기 위해 일련의 난 소 내 물리적 조작이 수행됩니다. 셋째, 외부 상피층과 전방 스트로마를 관통하는 선형 각막 상처는 미세 외과 용 나이프를 사용하여 만들어집니다. 재생 과정 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있다. 이 모델을 사용한 지금까지의 연구에 따르면 상처 입은 배아 각막은 각질세포 분화의 활성화를 나타내며, ECM 단백질을 본래의 입체 거대 구조로 조율 리모델링하고, 각막 감각 신경에 의해 적절하게 재 신경을 과민 반응시키는 것으로 나타났습니다. 미래에는 재생 과정에 대한 내인성 또는 외인성 요인의 잠재적 인 영향을 조직 이식, 전기 천공, 레트로 바이러스 감염 또는 비드 이식과 같은 발달 생물학 기술을 사용하여 각막 치유에서 분석 할 수 있습니다. 현재의 전략은 배아 병아리를 흉터가없는 각막 상처 치유를 조정하는 분자 및 세포 인자를 해명하기위한 중요한 실험 패러다임으로 식별합니다.

서문

각막은 시력에 도움이되는 빛을 전달하고 굴절시키는 눈의 투명하고 가장 바깥 쪽 조직입니다. 성인 각막에서, 각막 기질에 대한 손상 또는 감염은 각질세포 증식, 섬유증, 사이토카인-유도된 아폽토시스로 이어지는 염증 증가, 수복 근섬유아세포의 생성, 및 세포외 기질(ECM)의 전반적인 리모델링을 특징으로 하는 신속하고 강력한 상처 치유 반응을 유도한다^1,2 . 손상 후, 이러한 각막 조직 복구는 각막 투명성을 감소시키고 빛의 통과를 방해하는 불투명 한 흉터 조직을 초래하여 시력을 왜곡시키고 가장 심한 경우에는 각막 실명으로 이어진다³. 따라서, 상처 치유의 복잡성을 해결하고 상처 폐쇄 및 조직 재생을 담당하는 세포 및 분자 인자를 확인하기 위해 신뢰할 수 있는 동물 모델을 개발할 필요가 분명히 있다.

현재까지 각 막 상처 치유를 조사하는 대부분의 연구는 출생 후⁴ 또는 성인 동물 모델^1,2,5,6,7을 활용^했습니다. 이러한 연구들이 각막 상처 치유 반응과 흉터 형성의 근간이 되는 메커니즘에 대한 이해에 상당한 발전을 가져왔지만, 이러한 치유 모델에서 손상된 각막 조직은 완전히 재생되지 못하고, 따라서 각막 형태학 및 손상 후 구조를 완전히 되풀이하는 분자 인자 및 세포 메커니즘을 확인하는 데 그 유용성을 제한한다. 대조적으로, 배아 병아리 각막에서 칼로 생성된 태아 상처는 흉터가 없는 방식으로 완전히 치유될 수 있는 내재적 능력을 가지고 있다⁸. 구체적으로, 배아 병아리 각막은 세포외 기질 구조 및 신경 과민 패턴 ^8,9의 완전한 재회고와 함께 비섬유성 재생을 나타낸다.

본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 데 관련된 일련의 단계를 기술한다. 첫째, 난자는 배아에 쉽게 접근 할 수 있도록 초기 배아 시대에 창문이 있습니다. 둘째, 각막의 세 세포층이 형성되고 상처가 필요할 때 상응하는 발달의 후기 단계를 통해 눈에 대한 접근이 유지되도록하기 위해 배아 외 막에 대한 일련의 물리적 조작이 수행됩니다. 셋째, 각막 상피를 관통하고 전방 스트로마로 침투하는 선형 중앙 각막 절개는 미세 외과 용 나이프를 사용하여 만들어집니다. 재생 과정 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용 된 계란의 균주는 White Leghorn이었으며 모든 동물 절차는 일리노이 웨슬리안 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 병아리 알의 부화

1. 발달을 멈추기 위해 알을 낳은 후 최대 1 주 동안 ~ 10 °C에서 유지하십시오. 병아리 배아 발달을 시작할 준비가되면 상온의 물로 포화 된 보풀이없는 물티슈 ( 재료 표 참조)로 달걀 껍질 전체를 닦아 먼지와 파편을 제거하십시오.
2. 달걀 껍질이 소독되었는지 확인하십시오. 70 % 에탄올로 적신 보풀이없는 물티슈로 계란 표면 전체를 닦으십시오. 에탄올을 빨리 닦아 난자를 말리고 달걀 껍질을 통해 배아에 에탄올 흡수를 피하십시오.
3. 쟁반에 수평으로 달걀을 배열하십시오. 배아의 예상 위치를 나타내기 위해 난자의 상단을 표시하십시오. 38°C 가습 인큐베이터에서 흔들기 기능이 활성화된 상태에서 알을 수평으로 인큐베이션한다.

2. 막 해부를 준비하기 위해 계란을 창으로 씌우기

1. 배아 발달 3 일째 (E3)에 인큐베이터에서 알을 제거하십시오. 70 % 에탄올로 적신 보풀이없는 물티슈로 계란 상단을 살균하십시오. 달걀 껍질 표면에서 에탄올을 말리십시오.
   참고 : 창 만들기 절차 중에 개발이 지연되지 않도록하기 위해 6-12 개의 알을 제거하고 나머지 알을 인큐베이터에 남겨 두는 동안 절차를 신속하게 수행했습니다.
2. 안전한 달걀 홀더에 달걀을 수평으로 놓습니다 ( 재료 표 참조). 해부 가위의 날카로운 끝을 사용하여 달걀의 뾰족한 끝 근처의 달걀 껍질 꼭대기에 작은 구멍을 만듭니다.
   참고 :이 구멍은 알부민의 제거를 용이하게하며, 이는 노른자와 배아를 내부 달걀 껍질 표면에서 떨어 뜨리는 데 필요합니다. 계란 홀더의 경우, 계란이 배송되는 종이 펄프 달걀 필러 플랫이 사용되었습니다.
3. 구멍을 통해 (단계 2.2.), 경사진 피하 바늘 18 G를 삽입한다. 바늘을 난자의 밑바닥 내부 표면과 바늘의 베벨 쪽이 계란의 뾰족한 끝을 향하게되면 (예 : 난황과 난자의 중간 근처의 배아의 예상 위치로부터 멀리 떨어져) 닭 알에서 2-3 mL의 알부민을 제거하고 버립니다.
   참고 :이 단계에서 바늘이 배아 또는 관련 혈관 구조를 닉닉하면 혈액이 알부민으로 흡입됩니다. 이것은 배아 사망을 초래할 것입니다. 또한,이 단계에서 노른자가 실수로 알부민과 함께 흡인되면 배아는 생존 할 수 없습니다. 두 경우 모두 배아를 다른 목적으로 즉시 사용할 수없는 경우 난자를 폐기해야합니다.
4. 보풀이 없는 물티슈로 구멍을 둘러싸고 있는 달걀 껍질 표면을 70% 에탄올로 가볍게 적신 후 닦아내십시오. 알부민을 제거하기 위해 만들어진 구멍을 투명한 테이프로 밀봉하십시오.
5. 가위를 해부하는 날카로운 끝으로 마킹 부위의 달걀 껍질 상단에 두 번째 "창"구멍을 만듭니다 (1.3 단계). 가위가 달걀 껍질까지 너무 멀리 확장되어 배아 또는 배아 혈관 조직이 접촉하고 손상되지 않도록하십시오.이 혈관은 종종 두 번째 구멍 부위 바로 아래의 난자 내에 위치합니다.
6. 곡선 홍채 집무를 사용하여 직경 ~ 2-3cm에 걸쳐 "창"구멍을 넓히고 껍질 아래의 발달중인 배아에 "창"역할을합니다.
   1. 포셉의 한쪽 끝을 구멍에 삽입하여 달걀 껍질과 평행하고 밀접하게 병치시킵니다. 달걀 껍질 바깥쪽에 다른 포셉 끝이 놓인 상태에서 두 포셉 끝을 조심스럽게 꼬집어 달걀 껍질의 작은 조각을 부수고 제거 할 수 있습니다. 배아를 직접 오버레이하는 2-3cm 창이 남을 때까지 달걀 껍질 조각을 계속 부수고 제거하십시오.
      참고: 배아가 2.6단계에서 만든 구멍 바로 아래에 놓이지 않는 알. 다가오는 막 해부가 완료하기가 어려울 것이므로 사용해서는 안됩니다. 알을 수평으로 흔들더라도 배아의 위치가 좋지 않아 계란의 약 10 %를 사용할 수 없습니다. 이 배아는 다른 목적으로 사용될 수 있습니다.
7. 박테리아 오염을 제한하려면 페니실린/스트렙토마이신 항생제(페니실린 50U/mL, 스트렙토마이신 50μg/mL)가 들어있는 링거 용액(NaCl 8g, KCl 0.37g, 증류 H20 L 당_{CaCl2.2H200 0.23g})을 창 구멍을 통해 (예를 들어, 달걀에 넣음) 첨가_{하십시오.} 자료 표 참조).
8. 투명 접착 테이프를 사용하여 창 구멍을 밀봉하십시오. 테이프의 모서리를 구멍의 긴 축에 맞추고 테이프를 구멍의 가장자리에서 ~ 1-2cm 떨어진 쉘에 눌러 계란 밀봉을 수행하십시오.
   1. 매달린 테이프 플랩이 한쪽에 남을 때까지 개구부 주위를 밀봉을 계속하십시오. 두 개의 테이프를 함께 눌러 구멍 위에 돔형 모양을 만들고 껍질에 돌출 된 테이프의 플랩을 눌러 계란 밀봉을 마칩니다.
      참고 : 계란은 E2 또는 E3에서 창을 만들어야합니다. 경험에 따르면, E2 이전의 윈도잉은 배아 생존력을 낮춘다. 더욱이, E4에 의해, 배아 및 배아 외막은 달걀 껍질¹⁰에 부착되고, E4 또는 그 이후에 창으로 시도하려는 시도는 종종 배아 손상 또는 배아 외 혈관의 찢어짐을 초래하며, 어느 한 사건이 배아 사망의 결과로 이어진다.
9. 추가 개발을 위해 "창문이있는"알을 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 계란을 수평으로 유지하고 인큐베이터의 흔들림 기능을 끄십시오.
10. 2.2.-2.9단계를 반복합니다. 각 달걀에 대해.

3. 배아외 막의 미세 해부

1. 인큐베이터에서 E5.5 창문이있는 달걀을 제거하십시오. 멸균 된 해부 가위로 창문에서 테이프를 잘라 배아를 노출시킵니다.
2. 해부 현미경을 사용하여 창을 통해 배아와 배아 외막을 관찰하십시오. 필요한 경우 가위 또는 곡선 홍채 포셉을 사용하여 창을 넓혀 배아가 창 아래에 잘 배치되도록 배아 혈관 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오.
   1. 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 두 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
3. 해부 현미경을 사용하여 배아가 적절한 발달 단계 (햄버거 해밀턴 단계 27, ~ E5.5)^11,12에 있는지 확인하고 양수 이온막 (ACM)과 chorioallantoic 막 (CAM)의 위치를 찾습니다.
   참고 :이 단계에서 배아는 양막과 융모 성 막이 융합되고 부분적으로 배아의 장 영역에서 연장되고 오버레이 chorion과 융합되어 CAM^11,12를 형성하는 고혈관화 된 알란토이스로 덮인 ACM으로 둘러싸여 있습니다. ACM은 심하게 혈관화되지 않으므로 혈관을 손상시키지 않고 배아를 손상시키지 않고 배아를 노출시키기 위해이 막을 해부 할 수 있습니다.
4. 이 단계에서 배아외 막 해부를 수행합니다 (E5.5).
   참고 : E5.5는 배아 외 막 해부를 수행하기에 이상적인 시간입니다. CAM 형성 전에 막을 더 일찍 해부(예를 들어, E4에서)하는 것은 후기 단계¹¹에서 배아 접근성을 감소시킨다. 더욱이, E5.5에서, 배아는 고도로 혈관화된 CAM에 의해 부분적으로만 커버되지만, 다음 1-2일 동안, CAM은 배아^11,12에 대한 더 이상의 접근을 빠르게 감싸고 배제한다. 이러한 이유로 E6 이상에서의 막 해부는 혈관이 찢어질 위험이 증가함에 따라 어렵습니다.
   1. 한 쌍의 멸균 된 미세 포셉을 사용하여 ACM을 부드럽게 잡고 배아에서 떼어냅니다. 그런 다음 멸균 된 마이크로 해부 가위를 사용하여 앞다리 바로 위의 ACM에 구멍을 뚫어 앞다리가 덮인 막에서 머리 위에 놓인 막까지 뻗어 있습니다.
      참고: 이 단계는 chorion 및 양막이 이완되어 다음 단계에서 포셉으로 쉽게 잡고 해부할 수 있도록 합니다. 달걀 껍질 창을 통해 멤브레인이 어떻게 해부되는지에 대한 유용한 개략도는 그림 1 을 참조하십시오.
5. 두 쌍의 미세한 멸균 포셉을 사용하여 ACM과 CAM 사이의 두 개의 인접한 위치(예를 들어, 앞다리 위에 만들어진 절단과 CAM의 가장 가까운 가장자리 사이의 영역)에서 양수를 부드럽게 잡으십시오.
   1. 조심스럽게 양막을 단단히 잡고, 양막을 단단히 잡고, 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 심실로 움직입니다.
      참고 :이 운동은 ACM (한 쌍의 포셉에 의해 배아에 대해 등쪽 방향으로 당겨짐)과 CAM (다른 한 쌍의 포셉에 의해 배아에 대해 복부 방향으로 당겨짐)을 분리하면서 양수를 더 찢는 역할을합니다.
   2. CAM이 더 이상 배아를 덮지 않을 때 막이 분리되고 배아 내장에서 CAM으로 방출되는 알란토 동맥과 정맥이 쉽게 드러납니다.
6. 멸균 된 미세 포셉을 사용하여 배아를 덮고있는 남아있는 양막을 해부하고 제거하십시오. 나머지 양수가 배아의 꼬리 절반을 부분적으로 덮을 것이라는 것이 가장 일반적으로 관찰됩니다.
   1. 멸균 된 포셉을 사용하여 배아의 중간 두개골 영역 근처의 양수를 잡고 배아에 대해 꼬리 방향으로 양수를 조심스럽게 당겨 초기 변위 CAM쪽으로 당깁니다. 배아는 이제 완전히 노출 될 것이며, CAM의 추가 성장은 주로 발달중인 배아에서 멀리 떨어져서 발생할 것입니다.
      참고 : 노출 된 배아가 막 해부 후 어떻게 나타나는지에 대한 유용한 개략도는 그림 1 을 참조하십시오. 또한 3.3.-3.6단계의 유용한 개략도에 대해서는 이전에 게시된 보고서¹¹ 을 참조하십시오.
7. 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 몇 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
8. 2.8단계에서 설명한 대로 투명 테이프를 사용하여 창 구멍을 다시 밀봉합니다. 추가 개발을 위해 달걀을 인큐베이터로 돌려 보내고, 달걀을 수평으로 유지하고 인큐베이터의 흔들림 기능을 비활성화하십시오.
9. 3.1.-3.8단계를 반복합니다. 각 달걀에 대해.
   참고 : 위에서 설명한 E5.5에서 배아외 막 해부는 E7을 통해 배아에 접근 할 수있게 해주 며, 이는 상처가 ^8,9 일 때 수행 될 수 있습니다. E8에 의해, CAM 조직의 지속적인 성장은 배아의 두개골 영역을 덮기 시작하여, 각막에 대한 더 이상의 접근을 배제한다. 오래된 E8-E9 각막에서 상처를 수행하고자 하는 경우, 성장하는 CAM을 배아에 대하여 심실로 재배치할 수 있다(단계 3.10.). E7에서 상처를 입으려면 3.10 단계를 수행하십시오. 를 수행할 필요는 없으며 각막 상처 단계 4로 진행할 수도 있다.
10. E5.5에서 이전에 배아외 막이 해부된 인큐베이터에서 E7 난자를 제거한다(단계 3.1.-3.8.). CAM에 융합된 사용 가능한 양막 조직을 멸균된 포셉으로 잡고 배아에 대하여 배아의 두개골 영역에서 양막의 양을 부드럽게 당겨 배아에 대하여 복부 방향으로 떼어낸다.
    참고 : 배아에서 멀리 옮겨지는 양이온 막이 CAM에 융합되기 때문에 성장하고 고도로 혈관화 된 CAM은 양이온 포셉을 따라 두개골 영역에서 멀어집니다. 이 단계를 매일 반복하여 배아가 상처에 원하는 나이가 될 때까지 CAM을 배아에서 계속 대체하십시오.

4. 각막 상처

1. 원하는 배아 연령, E7-E9에서 상처를 입히기 위한 인큐베이터로부터 난자를 얻는다. 멸균 된 해부 가위로 창문에서 테이프를 잘라 배아를 노출시킵니다. 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 몇 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
2. 마이크로 해부 칼을 사용하여 오른쪽 눈의 각막의 정도에 걸친 절개를 만듭니다 (배아가 난자에 누워있는 방식 때문에 왼쪽 눈은 접근 할 수 없지만 상처가없는 대조군으로 작용할 수 있음), 맥락막 균열과 평행하고 일치합니다 (그림 1). 첫 번째 절단은 각막 상피를 횡단합니다.
   1. 마이크로 해부 나이프를 사용하여 첫 번째 절개와 동일한 지점에서 각막을 다시 2 배 더 레이스 시키십시오 (예를 들어, 절단 2 및 절단 3이 각막에서 동일한 위치와 함께 발생하는 총 3 컷 1)¹¹. 두 번째 열상은 지하실 막을 가로 지르고 세 번째 열상은 전방 스트로마를 관통합니다.
      참고 : 배아가 해부 된 CAM에 정착 한 경우 멸균 된 곡선 홍채 포셉을 사용하여 머리를 CAM 아래에서 조심스럽게 움직일 수 있습니다. 구부러진 아이리스 포셉을 머리 아래에 위치시켜 머리 왼쪽과 접촉시킵니다. 닫힌 곡선 아이리스 포셉 위에 머리 전체를 크래들링하고 CAM 주위와 위에서 머리를 부드럽게 들어 올립니다. 생존력을 돕기 위해 곡선 홍채 포셉과 유사한 기술을 사용하여 CAM의 적절한 성장을 촉진하기 위해 수술 후 배아를 CAM 아래에 다시 집어 넣으십시오.
3. 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 3-4 방울을 첨가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
4. 투명 테이프로 창문 구멍을 다시 밀봉하고 인큐베이터로 돌아가서 계란을 수평으로 남겨 둡니다. 배아가 발달하고 각막 상처가 원하는 기간 (예 : 0.5-11 일) 동안 치유되도록 허용 한 다음 감금에 의해 배아를 인간적으로 안락사시킵니다.
5. 구부러진 홍채 포셉을 사용하여 눈과 얼굴 조직이 만나는 후방의 눈을 부드럽게 잡고 조심스럽게 눈 전체를 들어 올려 얼굴 조직에서 벗어나 Ringer의 식염수 인 페트리 접시에 떠있는 안락사 된 배아에서 눈을 수확하십시오.
   1. 미세한 포셉을 사용하여 전체 눈 뒤쪽의 작은 구멍 (3-5cm)을 찌르고 가벼운 교반으로 밤새 4 °C에서 4 % 파라 포름 알데히드에 전체 눈을 고정시킵니다.

결과

발달중인 배아의 두개골 영역을 노출시키기 위해 E5.5에서 ACM과 CAM을 일찍 해부한 후, E7 중앙 각막에 걸친 일련의 열상이 ovo에서 이루어졌습니다 (그림 1). 각막 재생을 연구하는 이상적인 상처는 각막의 동일한 위치에서 만들어진 세 개의 열상 후에 발생합니다. 첫 번째 열상은 각막 상피를 횡단하는 반면, 두 번째 및 세 번째 열상은 각각 기저 기저막과 전방 스트로마?...

토론

병아리는 태아, 흉터가없는 각막 상처 수리를 연구하기위한 이상적인 모델 시스템입니다. 포유동물과는 달리, 병아리는 ovo ⁸ 또는 ex ovo 전략⁽²⁴)을 사용하여 개발 전반에 걸쳐 쉽게 접근할 수 있다. 배아 병아리 각막은 설치류 각막보다 훨씬 크며, 두개골 부피의 거의 50 %가 눈²⁵에 전념하여 상처와 같은 신체적 조작에 매우 적합합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a