Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários

Resumo

O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.

Resumo

As feridas na córneas embrionárias do pintinho apresentam uma capacidade notável de se regenerarem totalmente e rapidamente, enquanto as córneas feridas adultas experimentam uma perda de transparência devido a cicatrizes fibrosas. A integridade tecidual das córneas embrionárias feridas é intrinsecamente restaurada sem formação detectável de cicatrizes. Dada a sua acessibilidade e facilidade de manipulação, o embrião de filhotes é um modelo ideal para estudar o reparo da ferida córnea sem cicatrizes. Este protocolo demonstra os diferentes passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para acessar o olho. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas. Terceiro, feridas lineares de córnea que penetram na camada epitelial externa e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir. Estudos até o momento usando este modelo revelaram que as córneas embrionárias feridas exibem ativação da diferenciação de ceratocitos, passam por remodelação coordenada de proteínas ECM à sua macroestrutura tridimensional nativa e tornam-se adequadamente re-inervadas por nervos sensoriais córneas. No futuro, o impacto potencial de fatores endógenos ou exógenos no processo regenerativo poderia ser analisado na cura de córneas usando técnicas de biologia do desenvolvimento, como enxerto de tecido, eletroporação, infecção retroviral ou implantação de contas. A estratégia atual identifica o filhote embrionário como um paradigma experimental crucial para elucidar os fatores moleculares e celulares que coordenam a cicatrização da ferida córnea.

Introdução

A córnea é o tecido transparente, mais externo do olho que transmite e refrata a luz propícia à acuidade visual. Na córnea adulta, danos ou infecções no estroma córnea leva a uma resposta rápida e robusta de cicatrização de feridas caracterizada pela proliferação de ceratocitos, fibrose, aumento da inflamação que leva à apoptose induzida por citocina, geração de miofibroblasts de reparação e remodelação geral da matriz extracelular (ECM)^1,2 . Após a lesão, tal reparação do tecido córnea resulta em tecido cicatrizado opaco que reduz a transparência da córnea e oclui a passagem da luz, distorcendo assim a visão e, nos casos mais graves, levando à cegueira corneal³. Assim, há uma clara necessidade de desenvolver modelos animais confiáveis para abordar as complexidades da cicatrização das feridas e identificar os fatores celulares e moleculares responsáveis pelo fechamento da ferida e regeneração tecidual.

Até o momento, a maioria dos estudos que examinam a cicatrização de feridas córneas utilizaram modelos de animais pós-natal⁴ ou adultos 1,2,5,6,7. Embora esses estudos tenham levado a um avanço significativo na compreensão da resposta de cura da ferida córnea e dos mecanismos subjacentes à formação da cicatriz, os tecidos córneas danificados nesses modelos de cura não se regeneram totalmente, limitando assim sua utilidade para identificar os fatores moleculares e mecanismos celulares responsáveis pela recapitulação completa da morfologia cornela e da estrutura pós-lesão. Em contraste, as feridas fetais geradas com uma faca na córnea do pintinho embrionário possuem uma capacidade intrínseca de curar totalmente de forma sem cicatrizes⁸. Especificamente, a córnea de pintinho embrionário apresenta regeneração não fibritic com a recapitulação completa da estrutura da matriz extracelular e padrões de inervação ^8,9.

O presente protocolo descreve uma sequência de passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para facilitar o acesso ao embrião. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas e o ferimento é desejado. Terceira, incisões lineares de córnea central penetrando através do epitélio córnea e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.

Protocolo

A variedade de ovos usados neste protocolo foi White Leghorn, e todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Wesleyan de Illinois.

1. Incubação de ovos de pintinhos

1. Mantenha os ovos a ~10 °C por até 1 semana depois que eles são colocados para parar o desenvolvimento. Quando estiver pronto para iniciar o desenvolvimento de embriões de filhotes, limpe toda a casca de ovo com lenços sem fiapos (ver Tabela de Materiais) saturados com água de temperatura ambiente para remover sujeira e detritos.
2. Certifique-se de que a casca de ovo está higienizada. Limpe toda a superfície do ovo com lenços umedecidos sem fiapos com 70% de etanol. Limpe rapidamente o etanol para secar o ovo e evite a absorção de etanol através da casca de ovo para o embrião.
3. Disponha os ovos horizontalmente em uma bandeja. Marque o topo do ovo para denotar a posição esperada do embrião. Incubar os ovos horizontalmente, com a função de balanço ativada, em uma incubadora umidificada de 38 °C.

2. Janelas dos ovos para preparar para dissecção da membrana

1. Remova os ovos da incubadora no terceiro dia de desenvolvimento embrionário (E3). Esterilize a parte superior dos ovos com lenços umedecidos sem fiapos com 70% de etanol. Seque o etanol das superfícies da casca de ovo.
   NOTA: Para garantir que o desenvolvimento não fosse adiado durante o procedimento de janela, 6-12 ovos foram removidos, e o procedimento foi rapidamente realizado sobre estes enquanto os ovos restantes foram deixados na incubadora.
2. Posicione um ovo horizontalmente em um suporte de ovo seguro (ver Tabela de Materiais). Usando a ponta afiada da tesoura dissecando, crie um pequeno buraco no topo da casca de ovo perto da extremidade pontiaguda do ovo.
   NOTA: Este orifício facilitará a remoção do albumen, que é necessário para soltar a gema e o embrião longe da superfície interna da casca de ovo. Para os portadores de ovos, foram utilizados os planos de enchimento de ovos de papel-polpa, dentro dos quais os ovos são enviados.
3. Através do orifício (Passo 2.2.), insira uma agulha hipodérmica chanfrada de 18 G. Com a agulha empurrada para a superfície interna inferior do ovo e o lado de bisel da agulha voltado para a extremidade pontiaguda do ovo (por exemplo, longe da localização esperada da gema e do embrião perto do meio do ovo), remova 2-3 mL de albumen do ovo de galinha e descarte.
   NOTA: Se a agulha cortar o embrião ou sua vasculatura associada durante esta etapa, resultará em sangue aspirado com o albumen. Isso resultará em morte de embrião. Além disso, se a gema for inadvertidamente aspirada junto com o albumen durante esta etapa, o embrião não será viável. Em ambos os casos, o ovo deve ser descartado se o embrião não puder ser usado imediatamente para outros fins.
4. Limpe a superfície da casca de ovo ao redor do orifício com lenços sem fiapos levemente umedecidos com 70% de etanol e limpe. Sele o orifício feito para remover albumen com fita clara.
5. Com a ponta afiada da tesoura dissecando, faça um segundo buraco de "janela" no topo da casca de ovo no local de marcação (Passo 1.3.). Certifique-se de que a tesoura não se estenda muito até a casca de ovo para evitar o contato e danificar o embrião ou vasculatura embrionária, que muitas vezes será posicionado dentro do ovo diretamente abaixo do local do segundo orifício.
6. Usando fórceps de íris curvas, amplie o orifício "janela" para se estender ~2-3 cm de diâmetro e servir como uma "janela" para o embrião em desenvolvimento sob a concha.
   1. Insira uma extremidade das fórceps no orifício, mantendo-a paralela e justaposta com a casca de ovo. Com a outra extremidade fórceps posicionada fora da casca de ovo, belisque cuidadosamente as duas extremidades fórceps juntas, permitindo que eles quebrem e removam pequenos pedaços da casca de ovo. Continue quebrando e removendo fragmentos de casca de ovo até que permaneça uma janela de 2-3 cm que sobrepõe diretamente o embrião.
      NOTA: Os ovos em que os embriões não se colocam diretamente abaixo do orifício feito na Etapa 2.6. não deve ser usado, pois as próximas dissecções de membrana seriam desafiadoras para completar. Mesmo com o balanço horizontal dos ovos, cerca de 10% dos ovos são inutilizáveis devido ao mau posicionamento do embrião. Esses embriões podem ser usados para outros fins.
7. Para limitar a contaminação bacteriana, adicione através do orifício da janela (por exemplo, no ovo) ~100-200 μL da solução de Ringer (8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, e 0,23 g de CaCl_{2.2H 2}0 por L de h₂₀destilado) contendo antibióticos penicilina/estreptomicina (50 U/mL de Penicilina e 50 μg/mL de Estreptomicina, ver Tabela de Materiais).
8. Sele o orifício da janela usando fita adesiva clara. Execute a vedação do ovo alinhando um canto da fita no longo eixo do orifício e pressionando a fita para a casca ~1-2 cm de distância da borda do orifício.
   1. Continue selando ao redor da abertura até que uma aba de fita pendurada seja deixada de um lado. Pressione as duas peças de fita juntas, criando uma forma de domed sobre o orifício, e pressione a aba da fita sobre-pendurada na casca para terminar de selar o ovo.
      NOTA: Os ovos precisam ser janelas no E2 ou no E3. De acordo com a experiência, a janela antes do E2 resulta em baixa viabilidade de embriões. Além disso, por E4, o embrião e as membranas extraembriônicas tornam-se ligados à casca^{de ovo 10}, e qualquer tentativa de janela no E4 ou mais tarde muitas vezes resulta em danos embriões ou rasgos de vasos sanguíneos extraembrínicos, com qualquer evento levando ao resultado da morte do embrião.
9. Devolva os ovos "com janelas" à incubadora para maior desenvolvimento. Certifique-se de manter os ovos horizontais e desligue a função de balanço da incubadora.
10. Repetir as etapas 2.2.-2.9. para cada ovo.

3. Microdisseções das membranas extraembriônicas

1. Remova um ovo com janelas E5.5 da incubadora. Exponha o embrião cortando a fita da janela com uma tesoura dissecando esterilizada.
2. Use um microscópio dissecando para observar o embrião e suas membranas extraembriônicas através da janela. Se necessário, use tesouras ou fórceps de íris curvados para ampliar a janela para que o embrião esteja bem posicionado sob a janela, tomando cuidado para não danificar a vasculatura embrionária.
   1. Adicione duas gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
3. Use um microscópio de dissecação para garantir que o embrião esteja no estágio de desenvolvimento adequado (Hamburger Hamilton estágio 27, ~E5.5)^11,12 e localize as posições da membrana amicooquicoçônica (ACM) e da membrana corioallantónica (CAM).
   NOTA: Nesta fase, o embrião é cercado pelo ACM, que compreende a membrana amniótica e a membrana coriônica constrói e parcialmente coberta pela allantois altamente vascularizada, que se estende da região intestinal do embrião e se funde com o acorde sobreposto para formar a CAM^11,12. O ACM não é fortemente vascularizado, o que permite dissecar essas membranas para expor o embrião sem danificar os vasos sanguíneos e prejudicar o embrião.
4. Realizar dissecções de membrana extraembriônica nesta fase (E5.5).
   NOTA: E5.5 é o momento ideal para realizar as dissecções de membrana extraembriônica. Dissecando as membranas anteriormente (por exemplo, no E4) antes que a formação cam reduza a acessibilidade de embriões nos estágios^{posteriores 11}. Além disso, em E5.5, o embrião é apenas parcialmente coberto pela CAM altamente vascularizada, mas nos próximos 1-2 dias, o CAM rapidamente envolve e impede mais acesso ao embrião^11,12. Por essa razão, a dissecção da membrana no E6 ou posterior é desafiadora à medida que o risco de rasgar os vasos sanguíneos aumenta.
   1. Use um par de fórceps finos esterilizados para agarrar suavemente o ACM e puxá-lo para longe do embrião. Em seguida, use uma tesoura de micro dissecação esterilizada para cortar um orifício no ACM diretamente acima do membro dianteiro que se estende da membrana sobredissendo o membro dianteiro até a membrana sobredissendo a cabeça.
      NOTA: Esta etapa relaxa as membranas de chorão e amnion, tornando-as mais fáceis de agarrar e dissecar ainda mais com fórceps nos próximos passos. Consulte a Figura 1 para obter um esquema útil de como as membranas são dissecadas através da janela da casca de ovo.
5. Use dois pares de fórceps finos e estéreis para agarrar suavemente o amnion em duas posições adjacentes entre o ACM e o CAM (por exemplo, uma área entre o corte feito acima do membro dianteiro e a borda mais próxima da CAM).
   1. Mova cuidadosamente cada par de fórceps, ambos firmemente segurando a membrana amniótica, longe um do outro, com um par movendo-se dorsalmente para o embrião e o outro ventricamente.
      NOTA: Este movimento serve para rasgar ainda mais o amnion, separando também o ACM (que é puxado na direção dorsal em relação ao embrião por um par de fórceps) e o CAM (que é puxado na direção ventral em relação ao embrião pelo outro par de fórceps).
   2. Certifique-se de que as membranas são separadas quando a CAM não cobre mais o embrião e a artéria e veia allantónica, que emanam do intestino embrionário para a CAM, são prontamente aparentes.
6. Use fórceps finos esterilizados para dissecar e remover qualquer membrana de amnion restante que cubra o embrião. É mais comumente observado que o amnion restante cobrirá parcialmente a metade caudal do embrião.
   1. Usando fórceps esterilizados, segure o amnion perto da região central do embrião e puxe cuidadosamente o amnão em uma direção caudal em relação ao embrião em direção ao CAM deslocado anteriormente. O embrião será agora totalmente exposto, e o crescimento adicional da CAM ocorrerá principalmente longe do embrião em desenvolvimento.
      NOTA: Consulte a Figura 1 para obter um esquema útil sobre como o embrião exposto aparecerá após a dissecação da membrana. Além disso, consulte um relatório publicado anteriormente¹¹ para diagramas esquemáticos úteis das etapas 3.3.-3.6.
7. Adicione algumas gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
8. Resear o orifício da janela usando fita adesiva, conforme descrito na Etapa 2.8. Retorne o ovo à incubadora para maior desenvolvimento, mantendo o ovo horizontal e mantendo a função de balanço da incubadora inativada.
9. Repetia as etapas 3.1.-3.8. para cada ovo.
   NOTA: As dissecções de membrana extraembriônica no E5.5 descrito acima permitirão o acesso ao embrião através do E7, que é quando o ferimento pode ser realizado ^8,9. Por E8, o crescimento contínuo do tecido CAM começa a cobrir a região craniana do embrião, impedindo assim um acesso adicional à córnea. Se desejar realizar ferimentos nas córneas E8-E9 mais antigas, é possível reposicionar o cam em crescimento ventrally em relação ao embrião (Passo 3.10.). Se alguém quiser ferir no E7, passo 3.10. não é necessário realizar e pode-se prosseguir para o Passo 4, ferida corneal.
10. Remova um ovo E7 da incubadora cujas membranas extraembriônicas foram previamente dissecadas em E5.5 (Etapas 3.1.-3.8.). Segure com fórceps esterilizados quaisquer tecidos de membrana de amnion disponíveis fundidos à CAM e puxe suavemente a membrana de amnion para longe da região craniana do embrião em uma direção ventral em relação ao embrião.
    NOTA: Uma vez que a membrana amniônica que está sendo deslocada para longe do embrião é fundida para o CAM, o CAM em crescimento e altamente vascularizado seguirá as fórceps apreendidoras de amnion e se afastará da região craniana. Repita este passo diariamente para deslocar continuamente a CAM para longe do embrião até que o embrião esteja na idade desejada para ferir.

4. Ferida corneal

1. Obtenha um óvulo da incubadora para ferimentos na idade embrionária desejada, E7-E9. Exponha o embrião cortando a fita da janela com uma tesoura dissecando esterilizada. Adicione algumas gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
2. Use uma faca de micro-dissecação para fazer uma incisão que abrange a extensão da córnea do olho direito (devido à forma como o embrião está no ovo, o olho esquerdo não é acessível, mas pode servir como um controle não ferido), que é paralelo e em consonância com a fissura choroide (Figura 1). O primeiro corte atravessará o epitélio córnea.
   1. Use a faca de micro-dissecação para dilacerar novamente a córnea no mesmo local da primeira incisão 2x mais (por exemplo, três cortes totais, com corte 2 e corte 3 ocorrendo junto com a mesma posição na córnea como corte 1)¹¹. A segunda laceração atravessará a membrana do porão, e a terceira penetrará no estroma anterior.
      NOTA: Se o embrião se estabeleceu sob a CAM dissecada, pode-se usar fórceps de íris curvas esterilizados para mover cuidadosamente a cabeça para fora sob a CAM. Posicione as fórceps de íris curvas sob a cabeça, fazendo contato com o lado esquerdo da cabeça. Embale toda a cabeça em cima de fórceps de íris curvadas fechadas e levante suavemente a cabeça ao redor e acima da CAM. Para ajudar com a viabilidade, use uma técnica semelhante com os fórceps de íris curvados para colocar o embrião de volta sob a CAM após a cirurgia para promover o crescimento adequado da CAM.
3. Adicione 3-4 gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
4. Recaça o orifício da janela com fita adesiva e retorne à incubadora, deixando o ovo horizontal. Permita que o embrião se desenvolva e a ferida córnea se cure por um período desejado (por exemplo, 0,5-11 dias), e então eutanize humanamente o embrião por decapitação.
5. Use fórceps de íris curvas para colher o olho de um embrião eutanizado flutuando em uma placa de Petri da solução salina de Ringer, agarrando suavemente o olho em seu lado posterior, onde o olho e o tecido facial se encontram, e cuidadosamente levantando todo o olho para longe e livre do tecido facial.
   1. Use fórceps finos para fazer um pequeno orifício (3-5 cm) na parte de trás do olho inteiro e fixar o olho inteiro em 4% de paraformaldeído a 4 °C durante a noite com leve agitação.

Resultados

Após a dissecação anterior do ACM e cam em E5.5 para expor a região craniana do embrião em desenvolvimento, uma série de lacerações que abrangeram a córnea central E7 foi feita em ovo (Figura 1). Uma ferida ideal para estudar a regeneração da córnea ocorre após três lacerações, cada uma feita no mesmo local da córnea. A primeira laceração atravessa o epitélio córnea, enquanto a segunda e terceira lacerações penetram na membrana do porão subjacente e no estrom...

Discussão

O filhote é um sistema modelo ideal para estudar o reparo da ferida da córnea fetal e sem cicatrizes. Ao contrário dos mamíferos, o filhote é facilmente acessível durante todo o desenvolvimento usando em estratégias ovo⁸ ou ex ovo ²⁴. A córnea de pintinho embrionário é muito maior que as córneas de roedores, com quase 50% do volume craniano dedicado ao olho²⁵, tornando-a altamente favorável a manipulações físicas como...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a