Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Özet

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Özet

Civciv embriyonik kornea yaraları tamamen ve hızlı bir şekilde yenilenmek için dikkate değer bir kapasite gösterirken, yetişkin yaralı kornealar fibrotik skarlaşma nedeniyle şeffaflık kaybı yaşarlar. Yaralı embriyonik korneaların doku bütünlüğü, saptanabilir bir skar oluşumu olmadan içsel olarak restore edilir. Erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı göz önüne alındığında, civciv embriyosu, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir modeldir. Bu protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, yumurtalar göze erişmek için erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncüsü, dış epitel tabakasına ve anterior stromaya nüfuz eden lineer kornea yaraları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir. Bu modeli kullanarak bugüne kadar yapılan çalışmalar, yaralı embriyonik korneaların keratosit farklılaşmasının aktivasyonunu gösterdiğini, ECM proteinlerinin doğal üç boyutlu makroyapılarına koordineli bir şekilde yeniden şekillendiğini ve kornea duyu sinirleri tarafından yeterince yeniden innerve edildiğini ortaya koymuştur. Gelecekte, endojen veya eksojen faktörlerin rejeneratif süreç üzerindeki potansiyel etkisi, doku aşılama, elektroporasyon, retroviral enfeksiyon veya boncuk implantasyonu gibi gelişimsel biyoloji teknikleri kullanılarak iyileşen kornealarda analiz edilebilir. Mevcut strateji, embriyonik civcivleri, skarsız kornea yara iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için çok önemli bir deneysel paradigma olarak tanımlamaktadır.

Giriş

Kornea, görme keskinliğine elverişli ışığı ileten ve kıran gözün şeffaf, en dıştaki dokusudur. Yetişkin korneada, kornea stromasına verilen hasar veya enfeksiyon, keratosit proliferasyonu, fibroz, sitokin kaynaklı apoptozise yol açan inflamasyon artışı, onarım miyofibroblastlarının oluşumu ve hücre dışı matriksin (ECM) genel olarak yeniden şekillenmesi ile karakterize hızlı ve sağlam bir yara iyileşme yanıtına yol ^açar1,2 . Yaralanmayı takiben, bu tür kornea dokusu onarımı, kornea saydamlığını azaltan ve ışığın geçişini engelleyen, böylece görüşü bozan ve en ciddi vakalarda kornea körlüğüne yol açan opak skar ....

Protokol

Bu protokolde kullanılan yumurta suşu Beyaz Leghorn idi ve tüm hayvan prosedürleri Illinois Wesleyan Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Civciv yumurtalarının kuluçkalanması

1. Yumurtaları, gelişimi durdurmak için serildikten sonra 1 haftaya kadar ~ 10 ° C'de tutun. Civciv embriyosu gelişimini başlatmaya hazır olduğunuzda, kir ve kalıntıları temizlemek için tüm yumurta kabuğunu oda sıcaklığında suya doyurulmuş tüy bırakmayan mendillerle ( Malzeme Tablosuna bakınız) silin.
2. Yumurta kabuğunun sterilize edildiğinden emin olun. Tüm yumurta yüz....

Sonuçlar

Gelişmekte olan embriyonun kraniyal bölgesini ortaya çıkarmak için E5.5'te ACM ve TAT'ın daha önce diseksiyonunu takiben, ovo'da E7 merkezi korneasını kapsayan bir dizi yırtılma yapıldı (Şekil 1). Kornea rejenerasyonunu incelemek için ideal bir yara, her biri korneanın aynı yerinde yapılan üç yırtılmayı takiben ortaya çıkar. İlk yırtılma kornea epitelini geçerken, ikinci ve üçüncü yırtıklar sırasıyla altta yatan bazal membrana ve anterior stromay.......

Tartışmalar

Civciv, fetal, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir model sistemdir. Memelilerin aksine, civciv, ovo ⁸ veya ex ovo stratejileri²⁴ kullanılarak gelişim boyunca kolayca erişilebilir. Embriyonik civciv korneası, kemirgen kornealarından çok daha büyüktür, kafatası hacminin yaklaşık% 50'si göze^25'e adanmıştır ve bu da onu yaralama gibi fiziksel manipülasyonlara oldukça uygun hale getirir. Dahası,.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a