Embriyonik Yaralı Civciv Kornealarında İzsiz Doku Rejenerasyonunun İncelenmesi

Özet

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Özet

Civciv embriyonik kornea yaraları tamamen ve hızlı bir şekilde yenilenmek için dikkate değer bir kapasite gösterirken, yetişkin yaralı kornealar fibrotik skarlaşma nedeniyle şeffaflık kaybı yaşarlar. Yaralı embriyonik korneaların doku bütünlüğü, saptanabilir bir skar oluşumu olmadan içsel olarak restore edilir. Erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı göz önüne alındığında, civciv embriyosu, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir modeldir. Bu protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, yumurtalar göze erişmek için erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncüsü, dış epitel tabakasına ve anterior stromaya nüfuz eden lineer kornea yaraları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir. Bu modeli kullanarak bugüne kadar yapılan çalışmalar, yaralı embriyonik korneaların keratosit farklılaşmasının aktivasyonunu gösterdiğini, ECM proteinlerinin doğal üç boyutlu makroyapılarına koordineli bir şekilde yeniden şekillendiğini ve kornea duyu sinirleri tarafından yeterince yeniden innerve edildiğini ortaya koymuştur. Gelecekte, endojen veya eksojen faktörlerin rejeneratif süreç üzerindeki potansiyel etkisi, doku aşılama, elektroporasyon, retroviral enfeksiyon veya boncuk implantasyonu gibi gelişimsel biyoloji teknikleri kullanılarak iyileşen kornealarda analiz edilebilir. Mevcut strateji, embriyonik civcivleri, skarsız kornea yara iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için çok önemli bir deneysel paradigma olarak tanımlamaktadır.

Giriş

Kornea, görme keskinliğine elverişli ışığı ileten ve kıran gözün şeffaf, en dıştaki dokusudur. Yetişkin korneada, kornea stromasına verilen hasar veya enfeksiyon, keratosit proliferasyonu, fibroz, sitokin kaynaklı apoptozise yol açan inflamasyon artışı, onarım miyofibroblastlarının oluşumu ve hücre dışı matriksin (ECM) genel olarak yeniden şekillenmesi ile karakterize hızlı ve sağlam bir yara iyileşme yanıtına yol ^açar1,2 . Yaralanmayı takiben, bu tür kornea dokusu onarımı, kornea saydamlığını azaltan ve ışığın geçişini engelleyen, böylece görüşü bozan ve en ciddi vakalarda kornea körlüğüne yol açan opak skar dokusu ile sonuçlanır³. Bu nedenle, yara iyileşmesinin karmaşıklığını ele almak ve yara kapanması ve doku yenilenmesinden sorumlu hücresel ve moleküler faktörleri tanımlamak için güvenilir hayvan modelleri geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır.

Bugüne kadar, kornea yarasının iyileşmesini inceleyen çoğu çalışmada doğum sonrası⁴ veya yetişkin hayvan modelleri 1,2,5,6,7 kullanılmıştır. Bu çalışmalar kornea yarası iyileşme yanıtının ve skar oluşumunun altında yatan mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir ilerlemeye yol açmış olsa da, bu iyileşme modellerindeki hasarlı kornea dokuları tam olarak yenilenememekte, böylece kornea morfolojisinin ve yaralanma sonrası yapının tam olarak özetlenmesinden sorumlu moleküler faktörlerin ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasındaki yararlılıklarını sınırlamaktadır. Buna karşılık, embriyonik civciv korneasında bıçakla oluşturulan fetal yaralar, yarasız bir şekilde tamamen iyileşmek için içsel bir kapasiteye sahiptir⁸. Spesifik olarak, embriyonik civciv korneası, hücre dışı matriks yapısının ve innervasyon paternlerinin tam özetlenmesiyle fibrotik olmayan rejenerasyon sergiler ^8,9.

Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında rol oynayan bir dizi adımı tanımlamaktadır. İlk olarak, embriyoya erişimi kolaylaştırmak için yumurtalar erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu ve yaralanmanın istendiği zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncü olarak, kornea epitelinden ve anterior stroma içine nüfuz eden lineer santral kornea insizyonları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.

Protokol

Bu protokolde kullanılan yumurta suşu Beyaz Leghorn idi ve tüm hayvan prosedürleri Illinois Wesleyan Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Civciv yumurtalarının kuluçkalanması

1. Yumurtaları, gelişimi durdurmak için serildikten sonra 1 haftaya kadar ~ 10 ° C'de tutun. Civciv embriyosu gelişimini başlatmaya hazır olduğunuzda, kir ve kalıntıları temizlemek için tüm yumurta kabuğunu oda sıcaklığında suya doyurulmuş tüy bırakmayan mendillerle ( Malzeme Tablosuna bakınız) silin.
2. Yumurta kabuğunun sterilize edildiğinden emin olun. Tüm yumurta yüzeyini% 70 etanol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle silin. Yumurtayı kurutmak için etanolün hızla silin ve yumurta kabuğundan embriyoya etanol emilimini önleyin.
3. Yumurtaları yatay olarak bir tepsiye yerleştirin. Embriyonun beklenen pozisyonunu belirtmek için yumurtanın üstünü işaretleyin. Yumurtaları yatay olarak, sallama fonksiyonu etkinleştirildiğinde, 38 °C nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.

2. Membran diseksiyonuna hazırlanmak için yumurtaların pencerelenmesi

1. Embriyonik gelişimin üçüncü gününde (E3) kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın. Yumurtaların üst kısmını% 70 etanol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle sterilize edin. Etanolün yumurta kabuğu yüzeylerinden kurutulması.
   NOT: Pencereleme prosedürü sırasında gelişimin gecikmemesini sağlamak için, 6-12 yumurta çıkarıldı ve kalan yumurtalar inkübatörde bırakılırken prosedür bunlar üzerinde hızlı bir şekilde gerçekleştirildi.
2. Bir yumurtayı güvenli bir yumurta tutucuya yatay olarak yerleştirin (bkz. Diseksiyon makasının keskin ucunu kullanarak, yumurta kabuğunun tepesinde, yumurtanın sivri ucuna yakın küçük bir delik oluşturun.
   NOT: Bu delik, yumurta sarısını ve embriyoyu iç yumurta kabuğu yüzeyinden uzağa bırakmak için gerekli olan albüminin çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. Yumurta tutucular için, yumurtaların sevk edildiği kağıt-kağıt hamuru yumurta dolgu daireleri kullanılmıştır.
3. Delikten (Adım 2.2.), 18 G eğimli hipodermik bir iğne yerleştirin. İğne yumurtanın alt iç yüzeyine itildiğinde ve iğnenin eğim tarafı yumurtanın sivri ucuna baktığında (örneğin, yumurta sarısının ve embriyonun yumurtanın ortasına yakın beklenen yerinden uzakta), tavuk yumurtasından 2-3 mL albümen çıkarın ve atın.
   NOT: Bu adım sırasında kişinin iğnesi embriyoyu veya ilişkili vaskülatürünü keserse, albümen ile kanın aspire edilmesine neden olur. Bu embriyo ölümü ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, yumurta sarısı bu adımda albümen ile birlikte yanlışlıkla aspire edilirse, embriyo canlı olmayacaktır. Her iki durumda da, embriyo hemen başka amaçlar için kullanılamıyorsa, yumurta atılmalıdır.
4. Deliği çevreleyen yumurta kabuğu yüzeyini% 70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle temizleyin ve kurulayın. Albümeni çıkarmak için yapılan deliği şeffaf bantla kapatın.
5. Diseksiyon makasının keskin ucuyla, işaretleme bölgesinde yumurta kabuğunun tepesinde ikinci bir "pencere" deliği açın (Adım 1.3.). Makasların, embriyoya veya embriyonik vaskülatüre temas etmekten ve zarar vermekten kaçınmak için yumurta kabuğuna çok fazla uzanmadığından emin olun, bu da genellikle yumurtanın içinde ikinci deliğin bulunduğu yerin hemen altına yerleştirilir.
6. Kavisli iris forseps kullanarak, "pencere" deliğini ~ 2-3 cm çapında olacak şekilde genişletin ve kabuğun altındaki gelişmekte olan embriyoya bir "pencere" görevi görür.
   1. Forsepslerin bir ucunu deliğe yerleştirin, yumurta kabuğuna paralel ve yakından yan yana koyun. Diğer forseps ucu yumurta kabuğunun dışına yerleştirildiğinde, iki forseps ucunu dikkatlice sıkıştırarak yumurta kabuğunun küçük parçalarını kırmalarını ve çıkarmalarını sağlar. Embriyoyu doğrudan kaplayan 2-3 cm'lik bir pencere kalana kadar yumurta kabuğu parçalarını kırmaya ve çıkarmaya devam edin.
      NOT: Embriyoların Adım 2.6'da yapılan deliğin hemen altına yatmadığı yumurtalar. Yaklaşan membran diseksiyonlarının tamamlanması zor olacağından kullanılmamalıdır. Yumurtaların yatay olarak sallanmasıyla bile, embriyonun zayıf konumlandırılması nedeniyle yumurtaların yaklaşık% 10'u kullanılamaz. Bu embriyolar başka amaçlar için kullanılabilir.
7. Bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için, pencere deliğinden (örneğin yumurtaya) ~100-200 μL Ringer çözeltisi (8 g NaCl, 0.37 g KCl ve damıtılmış H_{2 0'ın}L başına 0.23 g CaCl _{2.2H 2}0) içeren Penisilin / Streptomisin antibiyotikleri (50 U / mL Penisilin ve 50 μg / mL Streptomisin, Bkz. Malzeme Tablosu).
8. Pencere deliğini şeffaf yapışkan bant kullanarak kapatın. Bandın bir köşesini deliğin uzun ekseni üzerinde hizalayarak ve bandı deliğin kenarından ~ 1-2 cm uzaktaki kabuğa bastırarak yumurta sızdırmazlığını gerçekleştirin.
   1. Bir tarafta asılı bir bant kapağı kalana kadar açıklığın etrafında sızdırmazlık sağlamaya devam edin. İki bant parçasını birbirine bastırın, deliğin üzerinde kubbeli bir şekil oluşturun ve yumurtayı kapatmayı bitirmek için asılı bant kapağını kabuğa bastırın.
      NOT: Yumurtaların E2 veya E3'te pencerelenmesi gerekir. Deneyimlere göre, E2'den önce pencereleme düşük embriyo canlılığı ile sonuçlanır. Dahası, E4 ile, embriyo ve ekstraembriyonik zarlar yumurta kabuğu^10'a bağlanır ve E4'te veya daha sonra pencereleme girişimleri genellikle embriyo hasarı veya ekstraembriyonik kan damarlarının yırtılması ile sonuçlanır ve her iki olay da embriyo ölümünün sonucuna yol açar.
9. Daha fazla gelişme için "pencereli" yumurtaları inkübatöre iade edin. Yumurtaları yatay tuttuğunuzdan ve inkübatörün sallanma işlevini kapattığınızdan emin olun.
10. 2.2.-2.9 numaralı adımları yineleyin. her yumurta için.

3. Ekstraembriyonik membranların mikrodiseksiyonları

1. Bir E5.5 pencereli yumurtayı inkübatörden çıkarın. Bandı sterilize edilmiş diseksiyon makası ile pencereden keserek embriyoyu ortaya çıkarın.
2. Embriyoyu ve ekstraembriyonik zarlarını pencereden gözlemlemek için diseksiyon mikroskobu kullanın. Gerekirse, pencereyi genişletmek için makas veya kavisli iris forseps kullanın, böylece embriyo pencerenin altına iyi yerleştirilmiştir ve embriyonik vaskülatüre zarar vermemeye özen gösterin.
   1. Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için iki damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.
3. Embriyonun uygun gelişim aşamasında olduğundan emin olmak için diseksiyon mikroskobu kullanın (Hamburger Hamilton evre 27, ~ E5.5)^11,12 ve amniyotoryonik membranın (ACM) ve koryoalantoik membranın (CAM) konumlarını bulun.
   NOT: Bu aşamada, embriyo, embriyonun bağırsak bölgesinden uzanan ve CAM^11,12'yi oluşturmak için üst üste binen koryon ile kaynaşan ve kısmen yüksek vaskülarize allantoz ile kaynaşmış amniyotik membran ve üstteki koryonik membrandan oluşan ACM ile çevrilidir. ACM ağır vaskülarize değildir, bu da kan damarlarına zarar vermeden ve embriyoya zarar vermeden embriyoyu açığa çıkarmak için bu zarların disseke edilmesini sağlar.
4. Bu aşamada ekstraembriyonik membran diseksiyonları yapın (E5.5).
   NOT: E5.5, ekstraembriyonik membran diseksiyonlarını gerçekleştirmek için ideal zamandır. TAT oluşumundan önce membranların daha erken diseke edilmesi (örneğin, E4'te) daha sonraki aşamalarda embriyo erişilebilirliğini azaltır¹¹. Dahası, E5.5'te, embriyo sadece kısmen yüksek vaskülarize CAM tarafından kaplanır, ancak önümüzdeki 1-2 gün boyunca, TAT embriyo^11,12'ye daha fazla erişimi hızla sarar^, engeller. Bu nedenle, E6 veya daha sonra membran diseksiyonu, kan damarlarının yırtılma riski arttıkça zordur.
   1. ACM'yi nazikçe kavramak ve embriyodan uzaklaştırmak için bir çift sterilize edilmiş ince forseps kullanın. Daha sonra, ACM'de ön ayağın hemen üstünde, ön ayağın üzerindeki zardan başın üzerindeki zara kadar uzanan bir delik açmak için sterilize edilmiş mikro diseksiyon makası kullanın.
      NOT: Bu adım, koryon ve amniyon membranlarını gevşetir, böylece sonraki adımlarda forseps ile tutulmalarını ve daha fazla diseksiyon yapmalarını kolaylaştırır. Membranların yumurta kabuğu penceresinden nasıl diseke edildiğine dair yararlı bir şema için Şekil 1'e bakın.
5. Amniyonu, ACM ve CAM arasındaki iki bitişik pozisyonda nazikçe tutmak için iki çift ince, steril forseps kullanın (örneğin, ön ayağın üzerinde yapılan kesim ile CAM'ın en yakın kenarı arasındaki bir alan).
   1. Her ikisi de amniyotik zarı sıkıca kavrayan her bir forseps çiftini birbirinden uzaklaştırın, bir çift dorsal olarak embriyoya ve diğeri ventralal olarak hareket eder.
      NOT: Bu hareket, amniyonun daha da yırtılmasına hizmet ederken, aynı zamanda ACM'yi (embriyoya göre dorsal yönde bir çift forseps tarafından çekilir) ve TAT (diğer forseps çifti tarafından embriyoya göre ventral yönde çekilir) ayırır.
   2. TAT artık embriyoyu örtmediğinde ve embriyonik bağırsaktan CAM'a yayılan allantoik arter ve venin kolayca görülebildiğinden membranların ayrıldığından emin olun.
6. Embriyoyu kaplayan kalan amniyon zarını diseke etmek ve çıkarmak için sterilize edilmiş ince forseps kullanın. En yaygın olarak, kalan amniyonun embriyonun kaudal yarısını kısmen kapsayacağı gözlenir.
   1. Sterilize forseps kullanarak, embriyonun orta kraniyal bölgesinin yakınındaki amniyonu kavrayın ve amniyonu, embriyoya göre daha önce yer değiştirmiş CAM'a doğru kaudal bir yönde dikkatlice çekin. Embriyo şimdi tamamen açığa çıkacak ve TAT'ın daha da büyümesi esas olarak gelişmekte olan embriyodan uzakta gerçekleşecektir.
      NOT: Membran diseksiyonunu takiben maruz kalan embriyonun nasıl görüneceğine dair yararlı bir şema için Şekil 1'e bakınız. Ayrıca, Adım 3.3.-3.6'nın yararlı şematik diyagramları için daha önce yayımlanmış bir rapor^11'e bakın.
7. Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için birkaç damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.
8. Adım 2.8'de açıklandığı gibi şeffaf bant kullanarak pencere deliğini yeniden kapatın. Daha fazla gelişme için yumurtayı inkübatöre geri verin, yumurtayı yatay tutun ve inkübatörün sallanma işlevini devre dışı bırakın.
9. 3.1.-3.8 arasındaki adımları yineleyin. her yumurta için.
   NOT: Yukarıda tarif edilen E5.5'teki ekstraembriyonik membran diseksiyonları, embriyoya E7 yoluyla erişim sağlayacaktır, bu da yaralamanın ^8,9 yapılabileceği zamandır. E8 ile, TAT dokusunun devam eden büyümesi embriyonun kraniyal bölgesini örtmeye başlar, böylece korneaya daha fazla erişimi engeller. Daha yaşlı E8-E9 kornealarında yaralama yapmak istenirse, büyüyen TAT ventrallisini embriyoya göre yeniden konumlandırmak mümkündür (Adım 3.10.). E7'de yara almak istenirse, Adım 3.10. gerçekleştirmek gerekli değildir ve kişi Adım 4, kornea yaralanmasına devam edebilir.
10. Ekstraembriyonik membranları daha önce E5.5'te diseke edilmiş olan inkübatörden bir E7 yumurtasını çıkarın (Adım 3.1.-3.8.). CAM ile kaynaşmış mevcut amniyon membran dokularını sterilize forseps ile kavrayın ve amniyon zarını embriyoya göre ventral yönde embriyonun kafatası bölgesinden yavaşça çekin.
    NOT: Embriyodan uzaklaşan amniyonik membran CAM ile kaynaştırıldığından, büyüyen ve yüksek oranda vaskülarize olmuş TAT amniyon kavrayan forsepsleri takip edecek ve kraniyal bölgeden uzaklaşacaktır. Embriyo yaralanma için istenen yaşa gelene kadar TAT'ı embriyodan sürekli olarak uzaklaştırmak için bu adımı günlük olarak tekrarlayın.

4. Kornea yaralanması

1. İstenilen embriyonik yaşta, E7-E9'da yaralama için inkübatörden bir yumurta alın. Bandı sterilize edilmiş diseksiyon makası ile pencereden keserek embriyoyu ortaya çıkarın. Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için birkaç damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.
2. Koroid fissüre paralel ve onunla aynı doğrultuda olan sağ gözün korneasının derecesini kapsayan bir kesi yapmak için mikro diseksiyon bıçağı kullanın (embriyonun yumurtada nasıl yattığına bağlı olarak, sol göze erişilemez, ancak yaralanmamış bir kontrol görevi görebilir) (Şekil 1). İlk kesim kornea epitelini geçecektir.
   1. Korneayı ilk kesi ile aynı noktada 2 kat daha fazla bağlamak için mikro diseksiyon bıçağını kullanın (örneğin; toplam üç kesik, kesilmiş 2 ve kesilmiş 3, korneada kesilmiş ¹⁾11 ile aynı pozisyonda meydana gelir. İkinci yırtılma bazal membrandan geçecek ve üçüncüsü anterior stromaya nüfuz edecektir.
      NOT: Embriyo disseke edilmiş CAM'ın altına yerleşmişse, kafayı CAM'ın altından dikkatlice hareket ettirmek için sterilize edilmiş kavisli iris forseps kullanılabilir. Kavisli iris forsepslerini başın altına yerleştirin ve başın sol tarafıyla temas ettirin. Tüm kafayı kapalı kavisli iris forsepslerinin üzerine yerleştirin ve kafayı yavaşça CAM'ın etrafına ve üstüne kaldırın. Canlılığa yardımcı olmak için, CAM'ın düzgün büyümesini teşvik etmek için ameliyattan sonra embriyoyu TAT'ın altına geri çekmek için kavisli iris forseps ile benzer bir teknik kullanın.
3. Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için Penisilin / Streptomisin antibiyotikleri içeren 3-4 damla Ringer çözeltisi ekleyin.
4. Pencere deliğini şeffaf bantla tekrar kapatın ve yumurtayı yatay bırakarak inkübatöre geri dönün. Embriyonun gelişmesine ve kornea yarasının istenen bir süre boyunca iyileşmesine izin verin (örneğin, 0.5-11 gün) ve daha sonra embriyoyu dekapitasyon yoluyla insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
5. Ringer'ın salin çözeltisinin Petri kabında yüzen ötenazi embriyosundan gözü toplamak için kavisli iris forseps kullanın, gözü göz ve yüz dokusunun buluştuğu arka tarafında hafifçe kavrayarak ve tüm gözü dikkatlice kaldırarak yüz dokusundan kurtarın.
   1. Tüm gözün arkasında küçük bir delik (3-5 cm) dürtmek için ince forseps kullanın ve tüm gözü hafif ajitasyonla gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

Sonuçlar

Gelişmekte olan embriyonun kraniyal bölgesini ortaya çıkarmak için E5.5'te ACM ve TAT'ın daha önce diseksiyonunu takiben, ovo'da E7 merkezi korneasını kapsayan bir dizi yırtılma yapıldı (Şekil 1). Kornea rejenerasyonunu incelemek için ideal bir yara, her biri korneanın aynı yerinde yapılan üç yırtılmayı takiben ortaya çıkar. İlk yırtılma kornea epitelini geçerken, ikinci ve üçüncü yırtıklar sırasıyla altta yatan bazal membrana ve anterior stromay...

Tartışmalar

Civciv, fetal, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir model sistemdir. Memelilerin aksine, civciv, ovo ⁸ veya ex ovo stratejileri²⁴ kullanılarak gelişim boyunca kolayca erişilebilir. Embriyonik civciv korneası, kemirgen kornealarından çok daha büyüktür, kafatası hacminin yaklaşık% 50'si göze^25'e adanmıştır ve bu da onu yaralama gibi fiziksel manipülasyonlara oldukça uygun hale getirir. Dahası,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a