Исследование регенерации безрубцовой ткани в эмбриональных раненых роговицах цыплят

Резюме

Настоящий протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Регенерирующая или полностью восстановленная роговица может быть проанализирована на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранения.

Аннотация

Эмбриональные раны роговицы цыплят демонстрируют замечательную способность к полной и быстрой регенерации, тогда как взрослые раненые роговицы испытывают потерю прозрачности из-за фиброзного рубцевания. Тканевая целостность поврежденных эмбриональных роговиц восстанавливается без обнаружения образования рубцов. Учитывая его доступность и простоту манипуляций, эмбрион цыпленка является идеальной моделью для изучения заживления ран роговицы без шрамов. Этот протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте для доступа к глазу. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда формируются три клеточных слоя роговицы. В-третьих, линейные раны роговицы, которые проникают во внешний эпителиальный слой и переднюю строму, изготавливаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования. Исследования, проведенные на сегодняшний день с использованием этой модели, показали, что раненые эмбриональные роговицы демонстрируют активацию дифференцировки кератоцитов, подвергаются скоординированному ремоделированию белков ECM в их родную трехмерную макроструктуру и адекватно реиннервируются сенсорными нервами роговицы. В будущем потенциальное влияние эндогенных или экзогенных факторов на регенеративный процесс может быть проанализировано при заживлении роговицы с использованием методов биологии развития, таких как пересадка тканей, электропорация, ретровирусная инфекция или имплантация бусин. Текущая стратегия определяет эмбрионального цыпленка как важнейшую экспериментальную парадигму для выяснения молекулярных и клеточных факторов, координирующих заживление ран роговицы без шрамов.

Введение

Роговица - это прозрачная, самая внешняя ткань глаза, которая пропускает и преломляет свет, способствующий остроте зрения. Во взрослой роговице повреждение или инфекция стромы роговицы приводит к быстрой и надежной реакции заживления ран, характеризующейся пролиферацией кератоцитов, фиброзом, усилением воспаления, приводящего к цитокин-индуцированному апоптозу, генерацией репарации миофибробластов и общим ремоделированием внеклеточного матрикса (ECM)^1,2 . После травмы такое восстановление ткани роговицы приводит к непрозрачной рубцовой ткани, которая снижает прозрачность роговицы и закупоривает прохождение све....

протокол

Штамм яиц, используемых в этом протоколе, был White Leghorn, и все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Иллинойса Уэслиан.

1. Инкубация куриных яиц

1. Держите яйца при ~ 10 ° C в течение 1 недели после их откладывания, чтобы остановить развитие. Когда вы будете готовы начать развитие эмбриона цыпленка, протрите всю яичную скорлупу безворсовыми салфетками (см. Таблицу материалов), насыщенными водой комнатной температуры, чтобы удалить грязь и мусор.
2. Убедитесь, что яичная скорлупа продезинфицирована. Протрите ....

Результаты

После более раннего рассечения ACM и CAM на E5.5 для обнажения черепной области развивающегося эмбриона, серия рваных ран, которые охватывали центральную роговицу E7, была сделана в ovo (рисунок 1). Идеальная рана для изучения регенерации роговицы происходит после трех рва?.......

Обсуждение

Цыпленок является идеальной модельной системой для изучения заживления ран роговицы плода без шрамов. В отличие от млекопитающих, птенец легко доступен на протяжении всего развития, используя стратегии ovo⁸ или ex ovo ²⁴. Эмбриональная роговица цыпленка ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a