Исследование регенерации безрубцовой ткани в эмбриональных раненых роговицах цыплят

Резюме

Настоящий протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Регенерирующая или полностью восстановленная роговица может быть проанализирована на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранения.

Аннотация

Эмбриональные раны роговицы цыплят демонстрируют замечательную способность к полной и быстрой регенерации, тогда как взрослые раненые роговицы испытывают потерю прозрачности из-за фиброзного рубцевания. Тканевая целостность поврежденных эмбриональных роговиц восстанавливается без обнаружения образования рубцов. Учитывая его доступность и простоту манипуляций, эмбрион цыпленка является идеальной моделью для изучения заживления ран роговицы без шрамов. Этот протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте для доступа к глазу. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда формируются три клеточных слоя роговицы. В-третьих, линейные раны роговицы, которые проникают во внешний эпителиальный слой и переднюю строму, изготавливаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования. Исследования, проведенные на сегодняшний день с использованием этой модели, показали, что раненые эмбриональные роговицы демонстрируют активацию дифференцировки кератоцитов, подвергаются скоординированному ремоделированию белков ECM в их родную трехмерную макроструктуру и адекватно реиннервируются сенсорными нервами роговицы. В будущем потенциальное влияние эндогенных или экзогенных факторов на регенеративный процесс может быть проанализировано при заживлении роговицы с использованием методов биологии развития, таких как пересадка тканей, электропорация, ретровирусная инфекция или имплантация бусин. Текущая стратегия определяет эмбрионального цыпленка как важнейшую экспериментальную парадигму для выяснения молекулярных и клеточных факторов, координирующих заживление ран роговицы без шрамов.

Введение

Роговица - это прозрачная, самая внешняя ткань глаза, которая пропускает и преломляет свет, способствующий остроте зрения. Во взрослой роговице повреждение или инфекция стромы роговицы приводит к быстрой и надежной реакции заживления ран, характеризующейся пролиферацией кератоцитов, фиброзом, усилением воспаления, приводящего к цитокин-индуцированному апоптозу, генерацией репарации миофибробластов и общим ремоделированием внеклеточного матрикса (ECM)^1,2 . После травмы такое восстановление ткани роговицы приводит к непрозрачной рубцовой ткани, которая снижает прозрачность роговицы и закупоривает прохождение света, тем самым искажая зрение и, в наиболее тяжелых случаях, приводя к слепоте роговицы³. Таким образом, существует явная необходимость в разработке надежных животных моделей для решения сложных проблем заживления ран и выявления клеточных и молекулярных факторов, ответственных за закрытие раны и регенерацию тканей.

На сегодняшний день в большинстве исследований, изучающих заживление ран роговицы, использовались послеродовые^{модели 4} или взрослых животных ^1,2,5,6,7. Хотя эти исследования привели к значительному прогрессу в понимании реакции заживления раны роговицы и механизмов, лежащих в основе образования рубцов, поврежденные ткани роговицы в этих моделях заживления не могут полностью регенерировать, что ограничивает их полезность для идентификации молекулярных факторов и клеточных механизмов, ответственных за полное повторение морфологии и структуры роговицы после травмы. Напротив, раны плода, полученные ножом в эмбриональной роговице цыпленка, обладают внутренней способностью полностью заживать без шрамов⁸. В частности, эмбриональная роговица цыпленка демонстрирует нефибротическую регенерацию с полной рекапитуляцией структуры внеклеточного матрикса и паттернами иннервации ^8,9.

Настоящий протокол описывает последовательность этапов, участвующих в ранении роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте, чтобы облегчить доступ к эмбриону. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда образуются три клеточных слоя роговицы и желательна ранение. В-третьих, линейные центральные разрезы роговицы, проникающие через эпителий роговицы и в переднюю строму, делаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования.

протокол

Штамм яиц, используемых в этом протоколе, был White Leghorn, и все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Иллинойса Уэслиан.

1. Инкубация куриных яиц

1. Держите яйца при ~ 10 ° C в течение 1 недели после их откладывания, чтобы остановить развитие. Когда вы будете готовы начать развитие эмбриона цыпленка, протрите всю яичную скорлупу безворсовыми салфетками (см. Таблицу материалов), насыщенными водой комнатной температуры, чтобы удалить грязь и мусор.
2. Убедитесь, что яичная скорлупа продезинфицирована. Протрите всю поверхность яйца безворсовыми салфетками, смоченными 70% этанолом. Быстро вытрите этанол, чтобы высушить яйцо и избежать поглощения этанола через яичную скорлупу эмбрионом.
3. Расположите яйца горизонтально на подносе. Отметьте верхнюю часть яйцеклетки, чтобы обозначить ожидаемое положение эмбриона. Инкубируйте яйца горизонтально, с включенной функцией раскачивания, в увлажненном инкубаторе при температуре 38 °C.

2. Оконная обработка яиц для подготовки к рассечению мембраны

1. Вынимайте яйца из инкубатора на третий день эмбрионального развития (Е3). Стерилизуйте верхнюю часть яиц безворсовыми салфетками, смоченными 70% этанолом. Высушите этанол с поверхности яичной скорлупы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать, что развитие не задерживалось во время процедуры окна, было удалено 6-12 яиц, и процедура была быстро проведена на них, в то время как оставшиеся яйца были оставлены в инкубаторе.
2. Расположите яйцо горизонтально в надежном держателе для яиц (см. Таблицу материалов). Используя острый конец рассекающих ножниц, создайте небольшое отверстие в верхней части яичной скорлупы возле заостренного конца яйца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это отверстие облегчит удаление белка, который необходим для удаления желтка и эмбриона от внутренней поверхности яичной скорлупы. Для держателей яиц использовались бумажные целлюлозные наполнители для яиц, в которые отправляются яйца.
3. Через отверстие (Этап 2.2.) вставьте скошенную иглу для подкожных инъекций весом 18 г. Прижав иглу к нижней внутренней поверхности яйца и конической стороне иглы, обращенной к заостренному концу яйца (например, вдали от ожидаемого расположения желтка и эмбриона около середины яйца), удалите 2-3 мл белка из куриного яйца и выбросьте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла проткнет эмбрион или связанную с ним сосудистую систему во время этого этапа, это приведет к аспирации крови с белком. Это приведет к гибели эмбриона. Кроме того, если желток непреднамеренно аспирируется вместе с белком во время этой стадии, эмбрион не будет жизнеспособным. В любом случае яйцеклетка должна быть выброшена, если эмбрион не может быть немедленно использован для других целей.
4. Очистите поверхность яичной скорлупы, окружающую отверстие, безворсовыми салфетками, слегка смоченными 70% этанолом, и вытрите насухо. Запечатайте отверстие, предназначенное для удаления белка, прозрачной лентой.
5. Острым концом рассечения ножницами сделайте второе «оконное» отверстие в верхней части яичной скорлупы на месте маркировки (Шаг 1.3.). Убедитесь, что ножницы не простираются слишком далеко в яичную скорлупу, чтобы избежать контакта и повреждения эмбриона или эмбриональной сосудистой системы, которая часто будет расположена внутри яйца непосредственно под местом второго отверстия.
6. Используя изогнутые щипцы радужной оболочки, расширьте «оконное» отверстие до ~2-3 см в диаметре и послужит «окном» для развивающегося эмбриона под оболочкой.
   1. Вставьте один конец щипцов в отверстие, удерживая его параллельно и близко сопоставляя с яичной скорлупой. Когда конец других щипцов расположен за пределами яичной скорлупы, осторожно зажмите два конца щипцов вместе, позволяя им сломать и удалить небольшие кусочки яичной скорлупы. Продолжайте разбивать и удалять фрагменты яичной скорлупы до тех пор, пока не останется окно размером 2-3 см, которое непосредственно накладывается на эмбрион.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца, в которых эмбрионы не лежат непосредственно под отверстием, сделанным на этапе 2.6. не должны использоваться, поскольку предстоящие мембранные вскрытия будут сложными для завершения. Даже при раскачивании яиц горизонтально около 10% яиц непригодны для использования из-за плохого позиционирования эмбриона. Эти эмбрионы могут быть использованы и для других целей.
7. Чтобы ограничить бактериальное загрязнение, добавьте через оконное отверстие (например, в яйцо) ~100-200 мкл раствора Рингера (8 г NaCl, 0,37 г KCl и 0,23 г CaCl_{2,2H 2}0 на л дистиллированного_H20), содержащего антибиотики пенициллина/стрептомицина (50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, см. Таблицу материалов).
8. Закройте отверстие в окне с помощью прозрачной клейкой ленты. Выполните герметизацию яйца, выровняв угол ленты по длинной оси отверстия и прижав ленту к скорлупе ~1-2 см от края отверстия.
   1. Продолжайте герметизацию вокруг отверстия до тех пор, пока с одной стороны не останется висячий клапан ленты. Прижмите два куска ленты вместе, создав куполообразную форму над отверстием, и прижмите лоскут нависающей ленты к скорлупе, чтобы закончить запечатывание яйца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца должны быть ококулены на E2 или E3. Согласно опыту, окошко до E2 приводит к низкой жизнеспособности эмбриона. Кроме того, к E4 эмбрион и внеэмбрионарные мембраны прикрепляются к яичной скорлупе¹⁰, и любые попытки проникнуть в E4 или позже часто приводят к повреждению эмбриона или разрыву внеэмбриональных кровеносных сосудов, причем любое из этих событий приводит к смерти эмбриона.
9. Верните «оконные» яйца в инкубатор для дальнейшего развития. Убедитесь, что яйца остаются горизонтальными и выключают функцию раскачивания инкубатора.
10. Повторите шаги 2.2.-2.9. за каждое яйцо.

3. Микродиссекции внеэмбриональных мембран

1. Извлеките из инкубатора яйцо с окнами E5.5. Обнажите эмбрион, отрезав ленту от окна стерилизованными рассекающими ножницами.
2. Используйте рассекающий микроскоп для наблюдения за эмбрионом и его внеэмбриональными мембранами через окно. При необходимости используйте ножницы или изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы расширить окно так, чтобы эмбрион хорошо располагался под окном, заботясь о том, чтобы не повредить эмбриональную сосудистую систему.
   1. Добавьте две капли раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина / стрептомицина, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
3. Используйте рассекающий микроскоп, чтобы убедиться, что эмбрион находится на правильной стадии развития (стадия Гамбургера Гамильтона 27, ~ E5.5)^11,12 и определить положения амниохориональной мембраны (ACM) и хориоаллантоической мембраны (CAM).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии эмбрион окружен ACM, который содержит амниотическую мембрану и вышележащую хорионическую мембрану, слитую и частично покрытую высоковаскуляризированным аллантоисом, который простирается от области кишечника эмбриона и сливается с накладным хорионом, образуя CAM^11,12. ACM не сильно васкуляризирован, что позволяет рассечь эти мембраны, чтобы обнажить эмбрион, не повреждая кровеносные сосуды и не нанося вреда эмбриону.
4. На этом этапе выполняют экстраэмбриональные рассечения мембран (Е5.5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: E5.5 является идеальным временем для проведения экстраэмбриональных мембранных рассечений. Рассечение мембран ранее (например, при E4) до образования CAM снижает доступность эмбриона на более поздних стадиях¹¹. Более того, при E5.5 эмбрион лишь частично покрывается высоковаскуляризированным CAM, но в течение следующих 1-2 дней CAM быстро обволакивает и исключает дальнейший доступ к эмбриону^11,12. По этой причине рассечение мембраны при E6 или более позднем уровне является сложной задачей, поскольку риск разрыва кровеносных сосудов увеличивается.
   1. Используйте пару стерилизованных тонких щипцов, чтобы осторожно схватить ACM и оттянуть его от эмбриона. Затем используйте стерилизованные микродиссекции ножницы, чтобы вырезать отверстие в ACM непосредственно над передней конечностью, которое простирается от мембраны, покрывающей переднюю часть, до мембраны, покрывающей голову.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг расслабляет мембраны хориона и амниона, тем самым облегчая их захват и дальнейшее рассечение щипцами на следующих шагах. Смотрите рисунок 1 для полезной схемы того, как мембраны рассекаются через окно яичной скорлупы.
5. Используйте две пары тонких стерильных щипцов, чтобы осторожно захватить амнион в двух соседних положениях между ACM и CAM (например, область между срезом, сделанным над передней конечностью и ближайшим краем CAM).
   1. Осторожно переместите каждую пару щипцов, которые крепко захватывают амниотическую мембрану, подальше друг от друга, причем одна пара движется дорсально к эмбриону, а другая вентрально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это движение служит для дальнейшего разрыва амниона, а также для разделения ACM (который тянется в дорсальном направлении по отношению к эмбриону одной парой щипцов) и CAM (который тянется в вентральном направлении по отношению к эмбриону другой парой щипцов).
   2. Убедитесь, что мембраны разделены, когда CAM больше не покрывает эмбрион, и аллантоидная артерия и вена, которые исходят от эмбрионального кишечника к CAM, легко очевидны.
6. Используйте стерилизованные тонкие щипцы для рассечения и удаления оставшейся амнионной мембраны, покрывающей эмбрион. Чаще всего наблюдается, что оставшийся амнион частично покрывает каудальную половину эмбриона.
   1. Используя стерилизованные щипцы, захватите амнион около средней черепной области эмбриона и осторожно потяните амнион в каудальном направлении по отношению к эмбриону к ранее смещенному CAM. Эмбрион теперь будет полностью обнажен, и дальнейший рост CAM будет в основном происходить вдали от развивающегося эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для полезной схемы о том, как будет выглядеть обнаженный эмбрион после рассечения мембраны. Кроме того, обратитесь к ранее опубликованному отчету¹¹ для получения полезных принципиальных схем шагов 3.3.-3.6.
7. Добавьте несколько капель раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина / стрептомицина, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
8. Повторно запечатайте оконное отверстие с помощью прозрачной ленты, как описано в Шаге 2.8. Верните яйцо в инкубатор для дальнейшего развития, сохраняя яйцо горизонтальным и сохраняя функцию раскачивания инкубатора инактивированной.
9. Повторите шаги 3.1.-3.8. за каждое яйцо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экстраэмбриональные мембранные рассечения на E5.5, описанные выше, обеспечат доступ к эмбриону через E7, то есть при ранении можно проводить ^8,9. К E8 продолжающийся рост ткани CAM начинает покрывать черепную область эмбриона, что исключает дальнейший доступ к роговице. При желании провести ранение в более старых роговицах Е8-Е9 можно перепозиционировать растущую КАМ вентрально по отношению к эмбриону (Шаг 3.10.). Если кто-то хочет замотать на E7, шаг 3.10. нет необходимости выполнять, и можно перейти к шагу 4, ранение роговицы.
10. Извлеките из инкубатора яйцо E7, внеэмбрионные мембраны которого были предварительно рассечены на E5.5 (шаги 3.1.-3.8.). Захватите стерилизованными щипцами любые доступные ткани амнионной мембраны, слитые с КАМ, и осторожно оттяните амнионную мембрану от черепной области эмбриона в вентральном направлении по отношению к эмбриону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку амнионная мембрана, смещаемая от эмбриона, сливается с КАМ, растущая и сильно васкуляризированная КАМ будет следовать за щипцами, хватающими амнионы, и удаляться от черепной области. Повторяйте этот шаг ежедневно, чтобы постоянно вытеснять КАМ от эмбриона до тех пор, пока эмбрион не достигнет желаемого возраста для ранения.

4. Ранение роговицы

1. Получите яйцеклетку из инкубатора для ранения в желаемом эмбриональном возрасте, Е7-Е9. Обнажите эмбрион, отрезав ленту от окна стерилизованными рассекающими ножницами. Добавьте несколько капель раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина / стрептомицина, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
2. Используйте нож для микропарекции, чтобы сделать разрез, который охватывает протяженность роговицы правого глаза (из-за того, как эмбрион откладывается в яйце, левый глаз недоступен, но может служить в качестве нераненого контроля), который параллельен и соответствует трещине сосудистой оболочки (рисунок 1). Первый срез будет пересекать эпителий роговицы.
   1. Используйте нож для микропарирования, чтобы снова разорвать роговицу в том же месте, что и первый разрез в 2 раза больше (например, три разреза всего, с отрубом 2 и разрезом 3, происходящим вместе с тем же положением в роговице, что и разрез 1)¹¹. Вторая рваная рана будет проходить через базальную мембрану, а третья будет проникать в переднюю строму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если эмбрион оседал под рассеченным CAM, можно использовать стерилизованные изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы осторожно вывести головку из-под CAM. Расположите изогнутые щипцы радужки под головой, соприкоснувшись с левой стороной головы. Подложите всю голову поверх закрытых изогнутых щипцов радужной оболочки и осторожно поднимите голову вокруг и над CAM. Чтобы помочь с жизнеспособностью, используйте аналогичную технику с изогнутыми щипцами радужной оболочки, чтобы вернуть эмбрион обратно под CAM после операции, чтобы способствовать правильному росту CAM.
3. Добавьте 3-4 капли раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина/стрептомицина, для гидратации эмбриона и стерилизации яйцеклетки.
4. Запечатайте отверстие в окне прозрачной лентой и вернитесь в инкубатор, оставив яйцо горизонтальным. Дайте эмбриону развиться и ране роговицы зажить в течение желаемого периода (например, 0,5-11 дней), а затем гуманно усыпить эмбрион путем обезглавливания.
5. Используйте изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы извлечь глаз из усыпленного эмбриона, плавающего в чашке Петри с солевым раствором Рингера, осторожно захватив глаз на его заднюю сторону, где встречаются глаз и лицевая ткань, и осторожно подняв весь глаз от ткани лица.
   1. Используйте тонкие щипцы, чтобы просунуть небольшое отверстие (3-5 см) в задней части всего глаза и зафиксировать весь глаз в 4% параформальдегиде при 4 °C на ночь с легким перемешиванием.

Результаты

После более раннего рассечения ACM и CAM на E5.5 для обнажения черепной области развивающегося эмбриона, серия рваных ран, которые охватывали центральную роговицу E7, была сделана в ovo (рисунок 1). Идеальная рана для изучения регенерации роговицы происходит после трех рва?...

Обсуждение

Цыпленок является идеальной модельной системой для изучения заживления ран роговицы плода без шрамов. В отличие от млекопитающих, птенец легко доступен на протяжении всего развития, используя стратегии ovo⁸ или ex ovo ²⁴. Эмбриональная роговица цыпленка ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G hypodermic needle	Fisher Scientific	14-826-5D
30 degree angled microdissecting knife	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes	D1306
5 mL syringe	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor labelled secondary antibodies	Molecular Probes
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20)	Sigma	C8106
Chicken egg trays	GQF	O246
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated	VWR	82027-408
Dissecting scissors, sharp tip	VWR	82027-578
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved	VWR	100494-908
Kimwipes	Sigma	Z188956
Microdissecting Scissors	VWR	470315-228
Mouse anti-fibronectin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	B3/D6
Mouse anti-laminin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a)	Biolegend	801213
Mouse anti-tenascin (IgG1)	Developmental Studies Hybridoma Bank	M1-B4
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P5405
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 egg incubator	GQF	1502
Tear by hand packaging (1.88 inch width)	Scotch	n/a