Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Настоящий протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Регенерирующая или полностью восстановленная роговица может быть проанализирована на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранения.
Эмбриональные раны роговицы цыплят демонстрируют замечательную способность к полной и быстрой регенерации, тогда как взрослые раненые роговицы испытывают потерю прозрачности из-за фиброзного рубцевания. Тканевая целостность поврежденных эмбриональных роговиц восстанавливается без обнаружения образования рубцов. Учитывая его доступность и простоту манипуляций, эмбрион цыпленка является идеальной моделью для изучения заживления ран роговицы без шрамов. Этот протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте для доступа к глазу. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда формируются три клеточных слоя роговицы. В-третьих, линейные раны роговицы, которые проникают во внешний эпителиальный слой и переднюю строму, изготавливаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования. Исследования, проведенные на сегодняшний день с использованием этой модели, показали, что раненые эмбриональные роговицы демонстрируют активацию дифференцировки кератоцитов, подвергаются скоординированному ремоделированию белков ECM в их родную трехмерную макроструктуру и адекватно реиннервируются сенсорными нервами роговицы. В будущем потенциальное влияние эндогенных или экзогенных факторов на регенеративный процесс может быть проанализировано при заживлении роговицы с использованием методов биологии развития, таких как пересадка тканей, электропорация, ретровирусная инфекция или имплантация бусин. Текущая стратегия определяет эмбрионального цыпленка как важнейшую экспериментальную парадигму для выяснения молекулярных и клеточных факторов, координирующих заживление ран роговицы без шрамов.
Роговица - это прозрачная, самая внешняя ткань глаза, которая пропускает и преломляет свет, способствующий остроте зрения. Во взрослой роговице повреждение или инфекция стромы роговицы приводит к быстрой и надежной реакции заживления ран, характеризующейся пролиферацией кератоцитов, фиброзом, усилением воспаления, приводящего к цитокин-индуцированному апоптозу, генерацией репарации миофибробластов и общим ремоделированием внеклеточного матрикса (ECM)1,2 . После травмы такое восстановление ткани роговицы приводит к непрозрачной рубцовой ткани, которая снижает прозрачность роговицы и закупоривает прохождение света, тем самым искажая зрение и, в наиболее тяжелых случаях, приводя к слепоте роговицы3. Таким образом, существует явная необходимость в разработке надежных животных моделей для решения сложных проблем заживления ран и выявления клеточных и молекулярных факторов, ответственных за закрытие раны и регенерацию тканей.
На сегодняшний день в большинстве исследований, изучающих заживление ран роговицы, использовались послеродовыемодели 4 или взрослых животных 1,2,5,6,7. Хотя эти исследования привели к значительному прогрессу в понимании реакции заживления раны роговицы и механизмов, лежащих в основе образования рубцов, поврежденные ткани роговицы в этих моделях заживления не могут полностью регенерировать, что ограничивает их полезность для идентификации молекулярных факторов и клеточных механизмов, ответственных за полное повторение морфологии и структуры роговицы после травмы. Напротив, раны плода, полученные ножом в эмбриональной роговице цыпленка, обладают внутренней способностью полностью заживать без шрамов8. В частности, эмбриональная роговица цыпленка демонстрирует нефибротическую регенерацию с полной рекапитуляцией структуры внеклеточного матрикса и паттернами иннервации 8,9.
Настоящий протокол описывает последовательность этапов, участвующих в ранении роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте, чтобы облегчить доступ к эмбриону. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда образуются три клеточных слоя роговицы и желательна ранение. В-третьих, линейные центральные разрезы роговицы, проникающие через эпителий роговицы и в переднюю строму, делаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования.
Штамм яиц, используемых в этом протоколе, был White Leghorn, и все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Иллинойса Уэслиан.
1. Инкубация куриных яиц
2. Оконная обработка яиц для подготовки к рассечению мембраны
3. Микродиссекции внеэмбриональных мембран
4. Ранение роговицы
После более раннего рассечения ACM и CAM на E5.5 для обнажения черепной области развивающегося эмбриона, серия рваных ран, которые охватывали центральную роговицу E7, была сделана в ovo (рисунок 1). Идеальная рана для изучения регенерации роговицы происходит после трех рва?...
Цыпленок является идеальной модельной системой для изучения заживления ран роговицы плода без шрамов. В отличие от млекопитающих, птенец легко доступен на протяжении всего развития, используя стратегии ovo8 или ex ovo 24. Эмбриональная роговица цыпленка ?...
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов в отношении информации, представленной в этой рукописи.
Эта работа была поддержана грантом на художественное и научное развитие через Иллинойский Уэслианский университет TS и частично финансировалась NIH-R01EY022158 (PL).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
Chicken egg trays | GQF | O246 | |
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены