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要約

この記事では、 ペポカボチャ と モシャタ菌の種間交配に由来する未熟胚の再生のための胚救助プロトコルについて説明しています。プロトコルは簡単に複製でき、スカッシュ繁殖プログラムの重要なリソースになります。

要約

ククルビタ作物(スカッシュ)における種間ハイブリダイゼーションは、遺伝的変異の拡大および有用な対立遺伝子の侵入のために望ましい。これらの広い交配から生成された未熟胚は、適切な胚救助技術を使用して再生する必要があります。この技術は多くの作物で十分に確立されていますが、その日常的な適用を可能にするスカッシュの適切な方法論の詳細な説明は不足しています。ここでは、C. pepoとC. moschataの種間ハイブリダイゼーションに有用な胚レスキュープロトコルについて述べる。胚救助のための実行可能な組み合わせを特定するために、24の種間交雑が実施された。結実は22の交配から得られ、92%の成功率を示した。しかし、得られた果実のほとんどは単為結実であり、種子には胚(空の種子)が含まれていませんでした。1つの交雑組み合わせのみが、基礎植物成長培地を使用して再生できる未熟胚を含んでいました。種間F1果実から合計10個の胚が救出され、胚救助の成功率は80%であった。ここで開発された胚救助プロトコルは、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションに役立ちます。

概要

ウリ科(2n = 40)は、ウリ科の非常に多様な属であり、27の異なる種を含み、そのうち5種は家畜化されています1。これらの中で、ククルビタモシャタ、C.ペポ、 およびC.マキシマは世界で最も経済的に重要です。米国では、C. moschataとC. pepoが農業生産において最も重要な2つの種です。C. pepoは、クルックネック、ストレートネック、ドングリ、ホタテ、ココゼル、野菜骨髄、ズッキーニ、カボチャの夏と冬のカボチャの両方の品種グループを含む4つの亜種(オビフェラ、ペポ、兄弟、およびグマラ)で構成されています2,3,4,5。C. moschataは主に、バターナッツ、ディキンソン、チーズグループ1などの冬カボチャ市場タイプで構成されています。2種は形態学的にも表現型的にも多様であり、C. pepoは収量、早さ、茂みの成長習慣、果実の形、果実の大きさ、果色、皮の模様などの多様な果実形質が評価されています。一方、C. moschataは、熱と湿度、および病害虫抵抗性への適応で高く評価されています6,7。C. moschataとC. pepoの間の種間交雑は、2つの種間の望ましい特性の導入のための重要な戦略であるだけでなく、育種プログラムにおける遺伝的基盤の拡大も可能にします7,8。

C. moschataとC. pepoの初期の交配は、それらの適合性および/または分類学的障壁を決定するために行われました9,10,11、その後の研究は主に望ましい形質の伝達に焦点を当てていました12,13,14。2つの種間の種間交配は、病害抵抗性、非生物的ストレスへの適応性、およびC. moschataからの活力の増加とともに、ブッシュまたはセミブッシュの成長習慣などの新しい形質の伝達とC.ペポからの収量の改善を標的としています14,15,16。例えば、C. pepo(P5)とC. moschata(MO3)の間の特定の交配は、より高い果実収量をもたらしました13が、C. moschataアクセッション(ナイジェリアローカルおよびメニーナ)は、栽培されたC.ペポ栽培品種のポチウイルスに対する耐性の主要な供給源として広く使用されています17,18。

以前の研究では、C. moschataとC. pepoの間のハイブリダイゼーションは可能であるが困難であることが示された8,15。種間交配は、結実なし(流産)、生存可能な種子のない単為結実の果実(空の種子)、未熟胚が発達しない種なし果実(狭窄精子)、または胚救助によって成熟植物に救助できる未熟胚がほとんどない果実をもたらす可能性があります15,16。例えば、C. pepo(テーブルクイーン、母方)とC. moschata(大きなチーズ、父方)を交配しても生存可能な種子は得られませんでしたが、相互交配は134の受粉から57の生存可能な種子を生み出しました9。早瀬は、10°Cで一晩保存した花粉を用いて、午前4:00に交配を行った場合にのみ、C. moschataおよびC. pepo交配から生存種子を得た19。バゲットは、8つの異なるC. moschata品種をC. pepo(デリカタ)と交配し、103の総受粉のうち、正常に見える83の果実が得られましたが、それらのどれにも生存可能な種子が含まれていなかったと報告しました8。C. pepo (S179) と C. moschata (NK) の交配では、Zhangらは2,994個の種子を含む15個の果実を得たが、そのうち12個のみが生存可能であり、残りは初歩的な発達しか示さなかった。これらの研究は、C. moschataとC. pepoの間の種間交配が非常に有益であるにもかかわらず、交配から生存可能な種子を持つ果実を得ることが要求されていることを示唆しています16。

胚レスキューは、早期流産または発達不良の胚から生じる問題を克服するための適切な方法として提案されており、未熟胚の再生のための最も早く、最も成功した体外培養技術の1つです16,20。胚救助には、未発達/未熟な胚のin vitro培養とそれに続く無菌栄養培地への移植が含まれ、実生の回復を促進し、最終的には成熟した植物21。胚レスキューはスカッシュ育種で一般的に使用されていますが、その日常的な適用を可能にする適切な方法論の詳細な説明は不足しています。Cucurbita種における種間ハイブリダイゼーション障壁を克服するための胚救助技術の使用は、早くも1954年に報告された22。しかし、初期の研究における胚救助の成功は、報告されていないか、非常に低かった。Metwallyらは、C. pepoとC. martinezii23の交配から救出された100個の種間雑種胚のうち、10%の成功率(成熟した植物への再生)を報告した。Siskoらは、異なる交配の組み合わせから得られた胚の間で胚再生の成功率がばらつきがあることを報告しました:C. maxima(Bos. Max)とC. pepo(ゴールドラッシュ)を交配することによって得られた雑種の再生率は15.5%、C. pepo(ズッキーニ)とC. moschata(北海道)は20%、C. pepo(ゴールドラッシュ)とC. moschata(ドルガ)は37.5%でした24。 遺伝子型に加えて、培地およびインビトロ培養条件は、技術の成功のための重要な要素である25,26。本研究では、C. moschataとC. pepoの様々な交雑組み合わせをテストし、スカッシュにおける胚救助技術を利用するための簡単な方法論を開発した。シンプルで容易に再現可能な胚救助技術の開発は、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションと生殖質増強を促進するでしょう。

プロトコル

1.植栽と受粉

注:ハイブリダイゼーションが結実と生存可能な胚の生産をもたらす互換性のある遺伝子型を特定することが重要です。

  1. 植栽条件とメンテナンス
    1. ハイブリダイゼーションのためにスカッシュ遺伝子型(品種/アクセッション)の種子を入手します(表1)。
    2. 50セルの開始フラット(幅25 cmx長さ50 cm)に、1.38 g / kg N、1.38 g / kg P、および1.38 g / kg Kを含む完全なNPK肥料で修正した培養土を満たします。
    3. 種子をその長さに等しい深さまで播種し、培養土で覆います。立っている水を作らずに干潟に水をまきます。その後、1日1回手で水をやり、メディアを湿らせてください。
    4. 2番目の本葉段階で、苗を直径25cmから30cmの鉢に移植し、大さじ3杯/鉢で完全なNPK肥料で修正します。NPK 20:20:20を含む液体肥料500 mL /ポットを水1ガロンあたり1 gの濃度で添加して、週に1回植物に肥料を与えます。
    5. 自然光の下で22〜28°Cの温度で温室内の植物を維持します。ブドウの遺伝子型については、温室内に支持トレリスを用意します(図1)。
  2. 受粉の実行
    1. 通常、カボチャの開花は、品種によって異なりますが、播種から6〜8週間で始まります(図2A、B)。植物が開花し始めたらすぐに制御された交配(交配)を始めます。温室条件下では、受粉は一年中行うことができます。
    2. 翌日受粉の準備が整うC. ペポ および C.モシャタ 品種の雄花と雌花を特定します。そのような花を識別するには、花びらが黄色の色合いを持っているが開いていない花をチェックします。偶発的な昆虫の受粉を防ぐために、マスキングテープを使用して上部で閉じた花をそっとテープで留めます(図2C、D)。
    3. 翌日の朝、花は受粉する準備ができています。ハイブリダイゼーションの成功率を向上させるために、午前10:00までに受粉を実施します27。
    4. 花びらのテープで留められた上部をそっと取り除き、雌花と雄花を開きます。雄花から花びらを取り除き、雌花の柱頭に葯をそっとこすって花粉を移します(図3A)。
    5. 受粉後、直ちに受粉した雌花をマスキングテープで閉じます。タグを使用して、受粉の日付を記録し、十字架で使用される父方と母方の両親を示します(図3B)。
    6. 交配が成功した場合、卵巣が拡張され、1週間以内に小さな果実がすぐに形成されます(図4A)。その後、植物は受粉28 の45〜55日後に収穫の準備が整います(図4B)。

2.胚救助技術

  1. メディアの準備
    1. 抗生物質ストックの準備:セフォタキシム(ナトリウム塩)の場合、抗生物質を4 mLの脱イオン水または蒸留水に溶解し、滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、0.5 mLのアリコートを作ります。-20°Cで保存してください。 得られたストック溶液の濃度は250 mg/mLになります。
    2. アンピシリン(ナトリウム塩)の場合は、粉末を10 mLの水に溶解し、滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、最終濃度100 mg / mLの1 mLストックに分注します。-20°Cで保存してください。
    3. 1Lボトルに2.45gの培地(濃度4.91g/L)を蒸留水500mLに溶解してムラシゲ・スクーグ(MS)培地を作ります。ジェランガム1.5 gを加え、オートクレーブを121°Cで20分間加えます。ジェランガムはオートクレーブ中に完全に溶解します。
    4. オートクレーブ処理後、ボトルを50°Cの水浴に入れて培地を冷却する。 冷凍庫から抗生物質ストックを取り出し、層流キャビネットで解凍します。
    5. ミディアムボトルを層流フードに移します。0.6 mLのセフォタキシムストック溶液(250 mg / mL)と0.25 mLのアンピシリンストック(100 mg / mL)を培地ボトルに加え、よく混ぜます。約7 mLの培地を滅菌ペトリ皿(60 mm x 15 mm)に注ぎます。
    6. 培地をペトリ皿で約15〜20分間固化させます。ペトリ皿をシーリングラップで閉じ、収納ボックスに入れます。室温で保管してください。
  2. 胚レスキュー
    1. 開始する前に、層流キャビネットを70%エチルアルコールで洗浄および滅菌します。
    2. カボチャの果実をメインのつるから壊したり切り取ったりして収穫し、緩んだ汚れがすべて取り除かれるまで、ラボシンクで液体洗剤(0.3%クロロキシレノールなど)で洗浄して果物の表面を消毒します(図5A)。
    3. 十分な水道水ですすいでください。清潔なペーパータオルで果物を乾かします。果物を層流キャビネットに移動します(図5B)。
    4. 滅菌層流キャビネット内の果物に70%エタノールを噴霧することにより、果物を表面滅菌します。滅菌ナイフで果実を二等分し(図5C)、種子を抽出します。
    5. 滅菌鉗子を使用して種皮を無菌的に開き、未熟な胚を露出させます(図6)。未熟胚を、セフォタキシムとアンピシリンを添加したMS培地を含むシャーレに注意深く入れます(図7A)。ペトリ皿を閉じ、ラッピングフィルムで密封します。
      注:胚のサイズに応じて、5つまたは6つの胚をペトリ皿に入れることができます。
    6. 胚の入った密封されたペトリ皿を、25°C、相対湿度70%の16時間日長以下の成長チャンバーに入れます。汚染が発生した場合は、汚染されていない胚をすぐに同じ培地で新しいプレートに継代培養します。
    7. 子葉は4日後に拡大し始め、10日後に緑色に変わります(図7B)。この時点で、必要に応じて、組織増殖を可能にするために、同じ培地を含む新しいプレートに継代培養を実行します。根は14日目に現れ始め(図7C)、21日目に子葉に根と子葉が伸びます(図7D)。
      注:プロトコルで使用される培地は、補助的な成長調節剤なしで新芽および根への分化に適しています。
    8. この段階で、ペトリ皿から小植物を取り除き、水道水で根から培地をそっと洗い流します(図8)。小植物をプラスチック容器(14 cm x 9 cm x 4 cm)に入れ、根を濡れたペーパータオルで覆います(図9A)。容器を覆い、必要に応じてペーパータオルを再び湿らせます。
    9. 容器を室温(25〜28°C)で16時間の日長で保管してください。このステップは苗を順応させるでしょう。コンテナ内で7〜10日間順応した後、実生の長さは約3〜4になります。この間、必要に応じてペーパータオルを湿らせ直します。
    10. 前述のように肥料で修正した50セルの開始フラット(幅25 cmx長さ50 cm)に苗を移し、温室に移動します(図9B)。腐敗を防ぐために苗に水をやりすぎないでください。必要に応じて、細胞あたり約10〜20 mLを追加します。.
    11. 2〜3回目の本葉の段階で、前述のように肥料を修正した培養土で満たされた直径30cmの鉢に苗を移植します(図10A)。前述のように、ブドウの木にトレリスサポートを提供し、植物が開花し始めたときに制御されたハイブリダイゼーションを実行します(図10B)。
    12. 温室内の植物を自然光下で22〜28°Cの温度に維持します。果物と種子の特性について植物を評価します。

結果

結実と種子の生存率
さまざまな交配の組み合わせで結実と種子の生存率を決定するために、最初のテストが実施されました。合計15のスカッシュ遺伝子型、4つのC. ペポ と11の C.モシャタが選択されました(表1)。試みられた24の種間交差の組み合わせのうち、22のフルーツセットが得られ(表2)、フルーツセット全体で>92%の成功を表していま?...

ディスカッション

C. moschataとC. pepoの種間ハイブリダイゼーションを成功させるには、ハイブリッド胚を生成するための遺伝子型応答性によって決定される交差適合性障壁と、正常な種子への雑種胚の発生を妨げる受精後障壁の2つの主要なボトルネックがあります。スカッシュについて以前に報告されたように、現在の研究の相互適合性試験では、ほとんどの果実が単為結実で発達し、ほとんどの...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この作業は、USDA国立食品農業研究所、NRSプロジェクト番号によってサポートされました。FLA-TRC-006176およびフロリダ大学食品農業科学研究所。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ampicillinFisher ScientificBP1760-5
autoclaveSterisAMSCO LAB 250
balance
cefotaximeSigma AlfrichC 7039
centrifuge tubes (1.5 ml)Sigma AlfrichT9661
detergent
ethanol, 95%Decon Labs2805HC
forcepsVWR82027-408
gellan gumCaisson LaboratoriesG024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinetThe Baker Company, IncEdgegard
masking tapeUlineS-11735
media bottle
Murashige & Skoog MediumResearch Products InternationalM10200
NPK fertilizer (20-20-20)BWI Companies, Inc PR200
Osmocote Plus fertilizerBWI Companie,s IncOS90590
Parafilm MSigma AlfrichP7793
Petri dish (60 x 15 mm)USA Scientific, Inc8609-0160
plant potsBWI Companies, IncNP4000BXL
plastic food containers, reusedOscar Mayer4470003330
plastic hang tagsAmazonB07QTZRY6T
potting mixJolly GardenerPro-Line C/B
seedling starter traysBWI Companies IncGPPF128S4
syringe filter (0.22 um )ExtraGeneB25CA022-S
trellis supportThe Home Depot 2A060006
water bath

参考文献

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