Protocolo de Resgate de Embriões para Hibridização Interespecífica em Abóbora

Resumo

O artigo descreve um protocolo de resgate embrionário para a regeneração de embriões imaturos derivados da hibridização interespecífica de Cucurbita pepo e Cucurbita moschata. O protocolo pode ser facilmente replicado e será um recurso importante para os programas de melhoramento de abóbora.

Resumo

A hibridação interespecífica em culturas de Cucurbita (abóbora) é desejável para ampliar a variação genética e para a introgressão de alelos úteis. Os embriões imaturos gerados a partir desses cruzamentos largos devem ser regenerados usando técnicas apropriadas de resgate embrionário. Embora esta técnica esteja bem estabelecida para muitas culturas, falta uma descrição detalhada da metodologia apropriada para a abóbora que permita sua aplicação de rotina. Aqui, descrevemos um protocolo de resgate embrionário útil para hibridização interespecífica de C. pepo e C . moschata. Para identificar combinações viáveis para o resgate embrionário, foram realizados 24 cruzamentos interespecíficos. A frutificação foi obtida a partir de vinte e dois cruzamentos, indicando uma taxa de sucesso de 92%. No entanto, a maioria dos frutos obtidos foi partenocárpica, com sementes desprovidas de embriões (sementes vazias). Apenas uma combinação cruzada continha embriões imaturos que poderiam ser regenerados usando meios basais de crescimento de plantas. Um total de 10 embriões foram resgatados do fruto interespecífico F₁ , e a taxa de sucesso do resgate embrionário foi de 80%. O protocolo de resgate de embriões aqui desenvolvido será útil para hibridização interespecífica em programas de melhoramento de abóbora.

Introdução

Cucurbita (2n = 40) é um género botânico pertencente à família Cucurbitaceae, que contém 27 espécies diferentes, das quais cinco são domesticadas¹. Entre estes, Cucurbita moschata, C. pepo e C. maxima são os mais importantes economicamente em todo o mundo. Nos EUA, C. moschata e C. pepo são as duas espécies mais importantes na produção agrícola. C. pepo consiste em quatro subespécies (ovifera, pepo, fraternal e gumala) que contêm grupos de cultivares de abóbora de verão e inverno de crookneck, straightneck, bolota, vieira, cocozelle, medula vegetal, abobrinha e abóbora^2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente em tipos de mercado de abóbora de inverno, incluindo butternut, Dickinson e queijo do grupo¹. As duas espécies são morfologicamente e fenotipicamente diversas, com C. pepo considerado por seu rendimento, precocidade, hábito de crescimento do arbusto e diversas características da fruta, incluindo forma do fruto, tamanho do fruto, cor da polpa e padrão da casca. Por outro lado, C. moschata é valorizada por sua adaptação ao calor e à umidade, bem como à resistência a doenças e pragas ^6,7. A hibridação interespecífica entre C. moschata e C. pepo não é apenas uma importante estratégia para a introgressão de características desejáveis entre as duas espécies, mas também permite a ampliação da base genética em programas de melhoramento ^7,8.

Os primeiros cruzamentos entre C. moschata e C. pepo foram feitos para determinar sua compatibilidade e/ou barreiras taxonômicas 9,10,11, enquanto estudos posteriores se concentraram principalmente na transferência de características desejáveis ^12,13,14. A hibridação interespecífica entre as duas espécies tem como alvo a transferência de novas características, como um hábito de crescimento de arbustos ou semi-arbustos e melhora do rendimento de C. pepo, juntamente com a resistência a doenças, adaptabilidade ao estresse abiótico e aumento do vigor de C. moschata^14,15,16. Por exemplo, cruzamentos específicos entre C. pepo (P₅) e C. moschata (MO₃) resultaram em maior produtividade de frutos 13, enquanto os acessos de C. moschata (Nigerian Local e Menina) têm sido amplamente utilizados como fonte primária de resistência a potyvirus em cultivares de C. pepo ^{cultivadas 17,18}.

Estudos prévios mostraram que a hibridação entre C. moschata e C. pepo é possível, mas difícil ^8,15. Os cruzamentos interespecíficos podem resultar em nenhum conjunto de frutos (aborto), frutos partenocárpicos desprovidos de sementes viáveis (sementes vazias), frutos sem sementes onde os embriões imaturos não se desenvolvem (estenospermocarpia) ou frutos com poucos embriões imaturos que podem ser resgatados em plantas maduras por meio do resgate embrionário^15,16. Por exemplo, não foram obtidas sementes viáveis pelo cruzamento de C. pepo (rainha de mesa, maternal) com C. moschata (queijo grande, paterno), no entanto, o cruzamento recíproco resultou em 57 sementes viáveis de 134 polinizações⁹. A Hayase obteve sementes viáveis dos cruzamentos de C. moschata e C. pepo somente quando os cruzamentos foram feitos às 04:00 da manhã, utilizando pólen armazenado a 10 °C durante a noite¹⁹. Baggett cruzou oito variedades diferentes de C. moschata com C. pepo (delicata) e relatou que, de 103 polinizações totais, foram obtidos 83 frutos que pareciam normais, mas nenhum deles continha sementes viáveis⁸. Em um cruzamento entre C. pepo (S179) e C. moschata (NK), Zhang et al. obtiveram 15 frutos com 2.994 sementes, mas apenas 12 dessas sementes eram viáveis, enquanto as restantes apresentavam apenas desenvolvimento rudimentar. Esses estudos sugerem que, embora o cruzamento interespecífico entre C. moschata e C. pepo seja altamente benéfico, a obtenção de frutos com sementes viáveis a partir dos cruzamentos é exigente¹⁶.

O resgate embrionário tem sido sugerido como um método apropriado para superar problemas decorrentes de aborto precoce ou embriões pouco desenvolvidos e é uma das primeiras e mais bem-sucedidas técnicas de cultura in vitro para regeneração de embriões imaturos^16,20. O resgate embrionário envolve a cultura in vitro de embriões subdesenvolvidos/imaturos, seguida de transferência para um meio nutriente estéril para facilitar a recuperação de plântulas e, finalmente, de plantas maduras²¹. Embora o resgate de embriões seja comumente usado na criação de abóbora, falta uma descrição detalhada da metodologia apropriada que permita sua aplicação de rotina. O uso da técnica de resgate embrionário para superar barreiras de hibridização interespecíficas em espécies de Cucurbita foi relatado já em 1954²². No entanto, o sucesso do resgate de embriões nos primeiros estudos não foi relatado ou muito baixo. Metwally et al. relataram uma taxa de sucesso de 10% (regeneração em plantas maduras) entre 100 embriões híbridos interespecíficos resgatados de um cruzamento entre C. pepo e C. martinezii²³. Sisko et al. relataram uma taxa variável de sucesso de regeneração embrionária entre embriões obtidos a partir de diferentes combinações cruzadas: a taxa de regeneração de híbridos obtidos pelo cruzamento de C. maxima (Bos. Max) e C. pepo (Corrida do Ouro) foi de 15,5%, para C. pepo (abobrinha) e C. moschata (Hokaido) foi de 20%, enquanto para C. pepo (Corrida do Ouro) e C. moschata (Dolga) foi de 37,5%²⁴. Além do genótipo, as condições do meio e da cultura in vitro são fatores importantes para o sucesso da técnica^25,26. No presente estudo, várias combinações cruzadas entre C. moschata e C. pepo foram testadas, e uma metodologia simples para utilizar a técnica de resgate embrionário em abóbora foi desenvolvida. O desenvolvimento de uma técnica de resgate embrionário simples e facilmente reprodutível facilitará a hibridização interespecífica e o aprimoramento do germoplasma em programas de melhoramento de abóbora.

Protocolo

1. Plantio e polinização

NOTA: É importante identificar genótipos compatíveis cuja hibridização resultaria em frutificação e produção de embriões viáveis.

1. Condições de plantio e manutenção
   1. Obter sementes de genótipos de abóbora (cultivares/acessos) para hibridização (Tabela 1).
   2. Encher 50 planos de partida de células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) com meio de envasamento alterado com fertilizante NPK completo contendo 1,38 g/kg de N, 1,38 g/kg de P e 1,38 g/kg de K.
   3. Semeie as sementes a uma profundidade igual ao seu comprimento e cubra com meio de envasamento. Regue as planícies sem criar água parada. Depois, mantenha a mídia úmida regando-a à mão uma vez por dia.
   4. No segundo estágio de folha verdadeira, transplante as plântulas para vasos de 25 cm a 30 cm de diâmetro alterados com um fertilizante NPK completo a 3 colheres de sopa/pote. Adubar as plantas uma vez por semana com 500 mL/vaso de fertilizante líquido contendo NPK 20:20:20 adicionado a uma concentração de 1 g por galão de água.
   5. Manter as plantas na estufa a temperaturas entre 22-28 °C sob regime de luz natural. Para genótipos de vinha, fornecer uma treliça de suporte na estufa (Figura 1).
2. Realização de polinizações
   1. Normalmente, a floração em abóbora começa em 6 a 8 semanas a partir da semeadura, dependendo da cultivar (Figura 2A,B). Comece a fazer hibridação controlada (cruzamentos) assim que as plantas começarem a florescer. Em condições de estufa, a polinização pode ser feita durante todo o ano.
   2. Identificar flores masculinas e femininas das cultivares C. pepo e C. moschata que estarão prontas para polinização no dia seguinte. Para identificar essas flores, verifique se há flores cujas pétalas tenham uma tonalidade amarela, mas não estejam abertas. Cole suavemente as flores fechadas no topo usando fita adesiva para evitar a polinização acidental de insetos (Figura 2C,D).
   3. Na manhã do dia seguinte, as flores estão prontas para polinizar. Realizar a polinização antes das 10:00 da manhã para melhorar a taxa de sucesso da hibridização²⁷.
   4. Abra as flores femininas e masculinas removendo suavemente a parte superior colada das pétalas. Remova as pétalas da flor masculina e transfira o pólen esfregando suavemente a antera no estigma da flor feminina (Figura 3A).
   5. Após a polinização, feche imediatamente a flor feminina polinizada com fita adesiva. Use uma etiqueta para registrar a data da polinização e indicar os pais paternos e maternos utilizados na cruz (Figura 3B).
   6. Um cruzamento bem-sucedido é indicado por um ovário expandido que forma rapidamente um pequeno fruto dentro de 1 semana (Figura 4A). A planta está então pronta para a colheita 45-55 dias após a polinização²⁸ (Figura 4B).

2. Técnica de resgate embrionário

1. Preparação para a mídia
   1. Preparar estoques de antibióticos: Para cefotaxima (sal de sódio), dissolver o antibiótico em 4 mL de água deionizada ou destilada, filtrar através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm e fazer alíquotas de 0,5 mL. Conservar a -20 °C. A solução-mãe resultante terá uma concentração de 250 mg/ml.
   2. Para ampicilina (sal de sódio), dissolver o pó em 10 ml de água, filtrar através de um filtro de seringa estéril de 0,22 μm e alíquota em caldo de 1 ml com uma concentração final de 100 mg/ml. Conservar a -20 °C.
   3. Fazer Murashige e Skoog (MS) meio dissolvendo 2,45 g de meio (concentração de 4,91 g/L) em 500 mL de água destilada em uma garrafa de 1 L. Adicionar 1,5 g de goma gelana e autoclave a 121 °C durante 20 minutos. A goma gelana dissolve-se completamente durante a autoclavagem.
   4. Após a autoclavagem, arrefecer o meio colocando a garrafa em banho-maria a 50 °C. Retire os estoques de antibióticos do freezer e descongele-os no gabinete de fluxo laminar.
   5. Transfira o frasco médio para o exaustor de fluxo laminar. Adicionar 0,6 ml de solução-mãe de cefotaxima (250 mg/ml) e 0,25 ml de caldo de ampicilina (100 mg/ml) ao frasco médio e misturar bem. Despeje cerca de 7 mL do meio em uma placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm).
   6. Deixe o meio solidificar nas placas de Petri por aproximadamente 15-20 min. Feche as placas de Petri com um embrulho de vedação e coloque-as em uma caixa de armazenamento. Armazenar à temperatura ambiente.
2. Resgate de embriões
   1. Antes de começar, limpe e esterilize o armário de fluxo de ar laminar com álcool etílico a 70%.
   2. Colha o fruto da abóbora quebrando/cortando-o da videira principal e desinfete a superfície do fruto lavando com detergente líquido (por exemplo, cloroxilenol a 0,3%) na pia do laboratório até que toda a sujeira solta seja removida (Figura 5A).
   3. Enxaguar com água da torneira ampla. Seque a fruta com toalhas de papel limpas. Mova a fruta para o gabinete de fluxo de ar laminar (Figura 5B).
   4. Esterilizar superficialmente o fruto pulverizando etanol a 70% sobre o fruto no armário estéril de fluxo de ar laminar. Bissecte o fruto com uma faca estéril (Figura 5C) e extraia as sementes.
   5. Utilizar pinça estéril para abrir assepticamente o revestimento da semente e expor os embriões imaturos (Figura 6). Colocar cuidadosamente os embriões imaturos em uma placa de Petri contendo meio MS suplementado com cefotaxima e ampicilina (Figura 7A). Feche a placa de Petri e lacre com filme de embrulho.
      NOTA: Dependendo do tamanho do embrião, é possível encaixar cinco ou seis embriões em uma placa de Petri.
   6. Colocar as placas de Petri seladas com embriões numa câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 h a 25 °C e 70% de humidade relativa. Se ocorrer contaminação, subcultura imediatamente os embriões não contaminados em uma nova placa com o mesmo meio.
   7. Os cotilédones começarão a se expandir após 4 dias e ficarão verdes em 10 dias (Figura 7B). Neste ponto, se necessário, realize a subcultura em novas placas contendo o mesmo meio para permitir a expansão do tecido. As raízes começarão a aparecer aos 14 dias (Figura 7C) e, aos 21 dias, as plântulas terão raízes e cotilédones estendidos (Figura 7D).
      NOTA: O meio de cultura utilizado no protocolo é apropriado para diferenciação em parte aérea e raízes sem reguladores de crescimento suplementares.
   8. Nesta fase, retire as plântulas das placas de Petri e lave suavemente o meio das raízes com água da torneira (Figura 8). Coloque as plântulas em um recipiente plástico (14 cm x 9 cm x 4 cm) e cubra as raízes com toalhas de papel molhadas (Figura 9A). Cubra o recipiente e reumedeça as toalhas de papel conforme necessário.
   9. Mantenha os recipientes à temperatura ambiente (25-28 °C) e com um fotoperíodo de 16 h. Esta etapa irá aclimatar as plântulas. Após a aclimatação por 7-10 dias no recipiente, as mudas terão aproximadamente 3-4 de comprimento. Durante este período, reumedeça as toalhas de papel conforme necessário.
   10. Transferir as plântulas para 50 planos de partida de células (25 cm de largura x 50 cm de comprimento) emendados com adubo conforme descrito anteriormente e movê-los para a estufa (Figura 9B). Não regue demais as mudas para evitar o apodrecimento; adicionar aproximadamente 10-20 mL por célula, conforme necessário.
   11. Na segunda a terceira etapa de folha verdadeira, transplante as plântulas para vasos de 30 cm de diâmetro preenchidos com meio de envasamento alterado com adubo conforme descrito anteriormente (Figura 10A). Fornecer suporte de treliça para plantas vinicultura e realizar hibridização controlada quando as plantas iniciarem a floração, conforme descrito anteriormente (Figura 10B).
   12. Manter as plantas na estufa a temperaturas entre 22-28 °C sob regime de luz natural. Avaliar as plantas quanto às características dos frutos e sementes.

Resultados

Frutificação e viabilidade das sementes
Um teste inicial foi realizado para determinar o conjunto de frutos e a viabilidade das sementes em uma variedade de combinações cruzadas. Foram escolhidos 15 genótipos de abóbora, quatro de C. pepo e 11 de C. moschata (Tabela 1). Das 24 combinações cruzadas interespecíficas tentadas, obteve-se um conjunto de frutos para 22 (Tabela 2), representando um sucesso global de >92% no fruto. Nenhum fruto madu...

Discussão

Existem dois gargalos principais para uma hibridização interespecífica bem-sucedida entre C. moschata e C. pepo: a barreira de compatibilidade cruzada, que é determinada pela capacidade de resposta do genótipo para produzir embriões híbridos, e as barreiras pós-fertilização, que dificultam o desenvolvimento de embriões híbridos para sementes normais. Conforme relatado anteriormente para a abóbora, o teste de compatibilidade cruzada no presente estudo revelou que a maioria dos frutos se dese...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
autoclave	Steris	AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime	Sigma Alfrich	C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml)	Sigma Alfrich	T9661
detergent
ethanol, 95%	Decon Labs	2805HC
forceps	VWR	82027-408
gellan gum	Caisson Laboratories	G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet	The Baker Company, Inc	Edgegard
masking tape	Uline	S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium	Research Products International	M10200
NPK fertilizer (20-20-20)	BWI Companies, Inc	PR200
Osmocote Plus fertilizer	BWI Companie,s Inc	OS90590
Parafilm M	Sigma Alfrich	P7793
Petri dish (60 x 15 mm)	USA Scientific, Inc	8609-0160
plant pots	BWI Companies, Inc	NP4000BXL
plastic food containers, reused	Oscar Mayer	4470003330
plastic hang tags	Amazon	B07QTZRY6T
potting mix	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
seedling starter trays	BWI Companies Inc	GPPF128S4
syringe filter (0.22 um )	ExtraGene	B25CA022-S
trellis support	The Home Depot	2A060006
water bath