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요약

이 기사는 Cucurbita pepo와 Cucurbita moschata의 종간 교잡에서 파생 된 미성숙 배아의 재생을위한 배아 구조 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 복제 할 수 있으며 스쿼시 육종 프로그램에 중요한 자원이 될 것입니다.

초록

Cucurbita 작물 (스쿼시)에서의 종간 교잡은 유전 적 변이를 확대하고 유용한 대립 유전자의 침입에 바람직합니다. 이러한 넓은 십자가에서 생성 된 미성숙 배아는 적절한 배아 구조 기술을 사용하여 재생되어야합니다. 이 기술은 많은 작물에 대해 잘 확립되어 있지만 일상적인 적용을 허용하는 스쿼시에 대한 적절한 방법론에 대한 자세한 설명이 부족합니다. 여기에서는 C. pepo와 C. moschata의 종간 교잡에 유용한 배아 구조 프로토콜을 설명합니다. 배아 구조를위한 실행 가능한 조합을 확인하기 위해, 24 개의 종간 교차가 수행되었다. 과일 세트는 22 개의 십자가에서 얻어졌으며 92 %의 성공률을 나타냅니다. 그러나 얻은 과일의 대부분은 배아가없는 씨앗 (빈 씨앗)이있는 단과피였습니다. 단 하나의 교차 조합만이 기초 식물 성장 배지를 사용하여 재생될 수 있는 미성숙 배아를 포함했습니다. 종간F1 열매에서 총 10 개의 배아가 구출되었으며, 배아 구조 성공률은 80 %였다. 여기에서 개발 된 배아 구조 프로토콜은 스쿼시 육종 프로그램에서 종간 교잡에 유용 할 것입니다.

서문

Cucurbita (2n = 40)는 27 종의 다른 종을 포함하는 Cucurbitaceae 계통의 매우 다양한 속이며 그 중 5 종은 길 들여집니다1. 이 중 Cucurbita moschata, C. pepo 및 C. maxima는 전 세계적으로 경제적으로 가장 중요합니다. 미국에서 C. moschata와 C. pepo는 농업 생산에서 가장 중요한 두 종입니다. C. pepo는 여름과 겨울 호박 품종 그룹을 모두 포함하는 4 개의 아종 (ovifera, pepo, fraternal 및 gumala)으로 구성됩니다. C. moschata는 주로 버터넛, 디킨슨, 치즈 그룹1을 포함한 겨울 스쿼시 시장 유형으로 구성됩니다. 두 종은 형태 학적으로나 표현형적으로 다양하며 C. pepo는 수확량, 얼얼함, 덤불 성장 습관 및 과일 모양, 과일 크기, 과육 색상 및 껍질 패턴을 포함한 다양한 과일 특성으로 간주됩니다. 반면에 C. moschata는 열과 습도, 질병 및 해충 저항성 6,7에 대한 적응으로 높이 평가됩니다. C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교잡은 두 종 사이의 바람직한 특성을 침해하는 중요한 전략 일뿐만 아니라 육종 프로그램 7,8에서 유전 적 기반을 넓힐 수 있습니다.

C. moschata와 C. pepo 사이의 초기 교배는 호환성 및 / 또는 분류 학적 장벽 9,10,11을 결정하기 위해 이루어졌지만 후기 연구는 주로 바람직한 특성12,13,14를 전달하는 데 중점을 두었습니다. 두 종 간의 종간 교잡은 질병 저항성, 비 생물 적 스트레스에 대한 적응성 및 C. moschata14,15,16의 활력 증가와 함께 부시 또는 반 부시 성장 습관 및 C. pepo의 수확량 향상과 같은 새로운 특성의 전달을 목표로했습니다. 예를 들어, C. pepo (P5)와 C. moschata (MO3) 사이의 특정 교배는 더 높은 과일 수확량 13을 초래 한 반면, C. moschata 가입 (나이지리아 지역 및 메니나)은 재배 된 C. pepo 품종17,18에서 포티 바이러스에 대한 내성의 주요 원천으로 널리 사용되었습니다.

이전 연구에 따르면 C. moschata와 C. pepo 사이의 교잡은 가능하지만 어렵습니다 8,15. 종간 교배는 과일 세트 없음 (낙태), 생존 가능한 씨앗이없는 단과피 과일 (빈 씨앗), 미성숙 배아가 발달하지 않는 씨없는 과일 (stenospermocarpy) 또는 배아 구조를 통해 성숙한 식물로 구출 될 수있는 미성숙 배아가 거의없는 과일15,16. 예를 들어, C. pepo (테이블 퀸, 모계)와 C. moschata (큰 치즈, 부계)를 교배하여 생존 가능한 종자를 얻지 못했지만, 상호 교배는 134 개의 수분에서 57 개의 생존 가능한 종자를 산출했습니다9. 하야세는 10°C에서 밤새 보관된 꽃가루를 사용하여 오전 04:00에 교배를 한 경우에만 C. moschata 및 C. pepo 교배종으로부터 생존 가능한 종자를 얻었다19. Baggett는 8 개의 다른 C. moschata 품종을 C. pepo (delicata)와 교배했으며 총 103 개의 수분 중 83 개의 과일이 정상으로 보였지만 그 중 어느 것도 생존 가능한 종자를 포함하지 않았다고보고했습니다8. C. pepo (S179)와 C. moschata (NK)의 교배에서 Zhang 등은 2,994 개의 종자로 15 개의 과일을 얻었지만 그 중 12 개만 생존 할 수 있었고 나머지는 초보적인 발달 만 보였습니다. 이 연구는 C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교배가 매우 유익하지만 십자가에서 생존 가능한 씨앗으로 과일을 얻는 것은16을 요구한다는 것을 시사합니다.

배아 구조는 조기 낙태 또는 잘 발달되지 않은 배아에서 발생하는 문제를 극복하기 위한 적절한 방법으로 제안되었으며 미성숙 배아의 재생을 위한 가장 초기의 가장 성공적인 시험관 배양 기술 중 하나입니다16,20. 배아 구조는 저개발 / 미성숙 배아의 시험관 내 배양에 이어 묘목 및 궁극적으로 성숙한 식물21의 회복을 촉진하기 위해 멸균 영양 배지로 옮기는 것을 포함합니다. 배아 구조는 일반적으로 스쿼시 육종에 사용되지만 일상적인 적용을 허용하는 적절한 방법론에 대한 자세한 설명이 부족합니다. Cucurbita 종에서 종간 교잡 장벽을 극복하기 위해 배아 구조 기술을 사용하는 것은 이미 195422 년에보고되었습니다. 그러나 초기 연구에서 배아 구조의 성공은보고되지 않았거나 매우 낮았다. Metwally et al. C. pepo와 C. martinezii23 사이의 교배에서 구출 된 100 개의 종간 잡종 배아 중 10 %의 성공률 (성숙한 식물로의 재생)을보고했습니다. Sisko et al. 서로 다른 교차 조합으로부터 얻은 배아 중 배아 재생의 다양한 성공률을보고했다 : C. maxima (Bos. Max)와 C. pepo (Gold Rush)를 교배하여 얻은 잡종의 재생률은 15.5 % 였고, C. pepo (Zucchini)와 C. moschata (Hokaido)는 20 % 였고, C. pepo (Gold Rush)와 C. moschata (Dolga)는 37.5 % 24였다. 유전자형 이외에, 배지 및 시험관 내 배양 조건은 기술25,26의 성공을위한 중요한 요소입니다. 현재 연구에서는 C. moschata와 C. pepo 사이의 다양한 교차 조합을 테스트하고 스쿼시에서 배아 구조 기술을 활용하기위한 간단한 방법론을 개발했습니다. 간단하고 쉽게 재현 가능한 배아 구조 기술의 개발은 스쿼시 육종 프로그램에서 종간 교잡 및 생식질 향상을 촉진할 것입니다.

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프로토콜

1. 심기 및 수분

참고: 교잡이 과일 세트와 생존 가능한 배아의 생산을 초래할 수 있는 호환 가능한 유전자형을 식별하는 것이 중요합니다.

  1. 심기 조건 및 유지 관리
    1. 교잡화를 위해 호박 유전자형(품종/가입)의 종자를 얻습니다(표 1).
    2. 50 셀 시작 플랫 (25cm 너비 x 50cm 길이)을 1.38g / kg N, 1.38g / kg P 및 1.38g / kg K를 포함하는 완전한 NPK 비료로 수정 된 화분 배지로 채 웁니다.
    3. 씨앗을 길이와 같은 깊이로 뿌리고 화분 매체로 덮으십시오. 고인 물을 만들지 않고 평지에 물을주십시오. 그런 다음 하루에 한 번 손으로 물을 주어 미디어를 촉촉하게 유지하십시오.
    4. 두 번째 진정한 잎 단계에서 묘목을 직경 25cm에서 30cm 화분에 이식하고 3 큰술 / 화분에 완전한 NPK 비료로 수정합니다. 물 갤런 당 500g 농도에 NPK 20:20:20을 함유 한 액체 비료 1mL / 냄비로 일주일에 한 번 식물을 비옥하게합니다.
    5. 자연 채광 체제에서 22-28 ° C 사이의 온도에서 온실에 식물을 유지하십시오. 유전자형 덩굴의 경우 온실에서지지 격자를 제공하십시오 (그림 1).
  2. 수분 수행
    1. 일반적으로 스쿼시의 개화는 품종에 따라 파종 후 6-8 주에 시작됩니다 (그림 2A, B). 식물이 개화하기 시작하자마자 제어 된 교잡 (십자가)을 시작하십시오. 온실 상태에서 수분은 일년 내내 할 수 있습니다.
    2. 다음날 수분 준비가 될 C. pepo 및 C . moschata 품종의 수꽃과 암꽃을 확인하십시오. 그러한 꽃을 식별하려면 꽃잎이 노란색 색조를 띠지 만 열리지 않은 꽃을 확인하십시오. 우발적 인 곤충 수분을 방지하기 위해 마스킹 테이프를 사용하여 상단에서 닫힌 꽃을 부드럽게 테이프로 붙입니다 (그림 2C, D).
    3. 다음날 아침, 꽃은 수분 할 준비가되었습니다. 교잡 성공률을 높이기 위해 오전 10:00 이전에 수분을 수행하십시오27.
    4. 꽃잎의 테이프 상단 부분을 부드럽게 제거하여 암꽃과 수꽃을 엽니 다. 수꽃에서 꽃잎을 제거하고 암꽃의 암술머리에 꽃밥을 부드럽게 문질러 꽃가루를 옮깁니다(그림 3A).
    5. 수분 후 즉시 마스킹 테이프로 수분 된 암화를 닫습니다. 태그를 사용하여 수분 날짜를 기록하고 십자가에 사용 된 부계 및 모계 부모를 나타냅니다 (그림 3B).
    6. 성공적인 교배는 1 주일 이내에 빠르게 작은 열매를 형성하는 확장 된 난소로 표시됩니다 (그림 4A). 그런 다음 식물은 수분 후 45-55 일 후에 수확 할 준비가됩니다28 (그림 4B).

2. 배아 구조 기술

  1. 미디어 준비
    1. 항생제 스톡 준비: 세포탁심(나트륨염)의 경우 항생제를 탈이온수 또는 증류수 4mL에 녹이고 멸균된 0.22μm 주사기 필터로 여과한 다음 0.5mL 분취량을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. 생성 된 저장 용액의 농도는 250 mg / mL입니다.
    2. 암피실린(나트륨염)의 경우 분말을 물 10mL에 녹이고 멸균된 0.22μm 주사기 필터로 여과한 다음 최종 농도가 100mg/mL인 1mL 스톡에 분취합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
    3. 1L 병에 증류수 500mL에 2.45g의 배지(4.91g/L 농도)를 용해시켜 무라시게와 스쿠그(MS) 배지를 만듭니다. 젤란 검 1.5g을 넣고 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 젤란 검은 오토 클레이브 중에 완전히 용해됩니다.
    4. 오토클레이빙 후, 병을 50°C의 수조에 넣어 배지를 냉각시킨다. 냉동실에서 항생제 스톡을 제거하고 층류 캐비닛에서 해동하십시오.
    5. 중간 병을 층류 후드로 옮깁니다. 0.6mL의 세포탁심 원액(250mg/mL)과 0.25mL의 암피실린 원액(100mg/mL)을 중간 병에 넣고 잘 섞습니다. 약 7mL의 배지를 멸균 페트리 접시 (60mm x 15mm)에 붓습니다.
    6. 배지가 페트리 접시에서 약 15-20분 동안 굳도록 합니다. 밀봉 랩으로 페트리 접시를 닫고 보관 상자에 넣으십시오. 실온에서 보관하십시오.
  2. 배아 구조
    1. 시작하기 전에 층류 공기 흐름 캐비닛을 70 % 에틸 알코올로 청소하고 살균하십시오.
    2. 호박 열매를 주 포도나무에서 부수거나 잘라 수확하고 느슨한 먼지가 모두 제거될 때까지 실험실 싱크대에서 액체 세제(예: 0.3% 클로록시레놀)로 세척하여 과일 표면을 소독합니다(그림 5A).
    3. 충분한 수돗물로 헹굽니다. 깨끗한 종이 타월로 과일을 말리십시오. 과일을 층류 캐비닛으로 옮깁니다(그림 5B).
    4. 표면은 멸균 층류 공기 흐름 캐비닛의 과일에 70 % 에탄올을 뿌려 과일을 살균합니다. 멸균 칼 (그림 5C)로 과일을 이등분하고 씨앗을 추출하십시오.
    5. 멸균 겸자를 사용하여 종자 코트를 무균 적으로 열고 미성숙 배아를 노출시킵니다 (그림 6). 미성숙 배아를 세포탁심과 암피실린이 보충된 MS 배지가 들어 있는 페트리 접시에 조심스럽게 놓습니다(그림 7A). 페트리 접시를 닫고 포장 필름으로 밀봉하십시오.
      참고: 배아의 크기에 따라 페트리 접시에 5개 또는 6개의 배아를 넣을 수 있습니다.
    6. 배아와 함께 밀봉된 페트리 접시를 25°C 및 70% 상대 습도에서 16시간 광주기 하에 성장 챔버에 놓습니다. 오염이 발생하면 오염되지 않은 배아를 동일한 배지로 새 판에 즉시 계대 배양하십시오.
    7. 자엽은 4 일 후에 팽창하기 시작하고 10 일 후에 녹색으로 변합니다 (그림 7B). 이 시점에서 필요한 경우 조직 확장을 허용하기 위해 동일한 배지를 포함하는 새 플레이트로 계대 배양을 수행하십시오. 뿌리는 14 일에 나타나기 시작하고 (그림 7C), 21 일에 묘목은 확장 된 뿌리와 자엽을 갖게됩니다 (그림 7D).
      참고: 프로토콜에 사용된 배양 배지는 보충 성장 조절제 없이 새싹과 뿌리로 분화하는 데 적합합니다.
    8. 이 단계에서 페트리 접시에서 묘목을 제거하고 수돗물로 뿌리에서 미디어를 부드럽게 씻어냅니다 (그림 8). 묘목을 플라스틱 용기 (14cm x 9cm x 4cm)에 넣고 젖은 종이 타월로 뿌리를 덮습니다 (그림 9A). 용기를 덮고 필요에 따라 종이 타월을 다시 적십니다.
    9. 용기를 실온(25-28°C) 및 16시간 광주기로 보관하십시오. 이 단계는 묘목을 순응시킵니다. 용기에 7-10 일 동안 순응 한 후, 묘목의 길이는 약 3-4 개입니다. 이 기간 동안 필요에 따라 종이 타월을 다시 적시십시오.
    10. 묘목을 이전에 설명한대로 비료로 수정 된 50 개의 셀 시작 플랫 (너비 25cm x 길이 50cm)으로 옮기고 온실로 옮깁니다 (그림 9B). 썩지 않도록 묘목에 물을 너무 많이 주지 마십시오. 필요에 따라 셀당 약 10-20mL를 추가합니다.
    11. 두 번째에서 세 번째 진정한 잎 단계에서 묘목을 앞서 설명한대로 비료로 수정 된 화분 배지로 채워진 직경 30cm 화분에 이식합니다 (그림 10A). 덩굴 식물에 대한 격자 지지대를 제공하고 이전에 설명한 대로 식물이 개화하기 시작할 때 제어된 교잡화를 수행합니다(그림 10B).
    12. 자연 채광 체제에서 22-28 ° C 사이의 온도에서 온실의 식물을 유지하십시오. 과일과 종자 특성에 대해 식물을 평가하십시오.

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결과

과일 세트 및 종자 생존력
다양한 교차 조합에서 과일 세트와 종자 생존력을 결정하기 위해 초기 테스트가 수행되었습니다. 총 15 개의 스쿼시 유전자형, 4 개의 C. pepo 및 11 개의 C. moschata가 선택되었습니다 (표 1). 시도된 24개의 종간 교차 조합 중 22개에 대해 과일 세트가 얻어졌으며(표 2), 과일 세트에서 전체 >92%의 성공을 나타냅니다. O와 M, E?...

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토론

C. moschata와 C. pepo 사이의 성공적인 종간 교잡을위한 두 가지 주요 병목 현상이 있습니다 : 하이브리드 배아를 생산하기위한 유전자형 반응성에 의해 결정되는 교차 호환성 장벽과 정상 종자에 대한 하이브리드 배아의 발달을 방해하는 수정 후 장벽. 스쿼시에 대해 이전에보고 된 바와 같이, 현재 연구의 교차 호환성 테스트는 대부분의 과일이 parthenocarpically 발달했으며 대부분의 씨앗...

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공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 USDA 국립 식량 농업 연구소, NRS 프로젝트 번호의 지원을 받았습니다. FLA-TRC-006176 및 플로리다 대학교 식품 및 농업 과학 연구소.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ampicillinFisher ScientificBP1760-5
autoclaveSterisAMSCO LAB 250
balance
cefotaximeSigma AlfrichC 7039
centrifuge tubes (1.5 ml)Sigma AlfrichT9661
detergent
ethanol, 95%Decon Labs2805HC
forcepsVWR82027-408
gellan gumCaisson LaboratoriesG024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinetThe Baker Company, IncEdgegard
masking tapeUlineS-11735
media bottle
Murashige & Skoog MediumResearch Products InternationalM10200
NPK fertilizer (20-20-20)BWI Companies, Inc PR200
Osmocote Plus fertilizerBWI Companie,s IncOS90590
Parafilm MSigma AlfrichP7793
Petri dish (60 x 15 mm)USA Scientific, Inc8609-0160
plant potsBWI Companies, IncNP4000BXL
plastic food containers, reusedOscar Mayer4470003330
plastic hang tagsAmazonB07QTZRY6T
potting mixJolly GardenerPro-Line C/B
seedling starter traysBWI Companies IncGPPF128S4
syringe filter (0.22 um )ExtraGeneB25CA022-S
trellis supportThe Home Depot 2A060006
water bath

참고문헌

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