Embryonenrettungsprotokoll für interspezifische Hybridisierung in Kürbis

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt ein Embryonenrettungsprotokoll zur Regeneration unreifer Embryonen, die aus der interspezifischen Hybridisierung von Cucurbita pepo und Cucurbita moschata stammen. Das Protokoll kann leicht repliziert werden und wird eine wichtige Ressource für Kürbiszuchtprogramme sein.

Zusammenfassung

Interspezifische Hybridisierung in Cucurbita-Kulturen (Kürbis) ist wünschenswert, um die genetische Variation zu erweitern und nützliche Allele zu introgressivieren. Unreife Embryonen, die aus diesen breiten Kreuzungen erzeugt werden, müssen mit geeigneten Embryonenrettungstechniken regeneriert werden. Obwohl diese Technik für viele Kulturen gut etabliert ist, fehlt eine detaillierte Beschreibung der geeigneten Methodik für Kürbis, die ihre routinemäßige Anwendung ermöglichen würde. Hier beschreiben wir ein Embryonenrettungsprotokoll, das für die interspezifische Hybridisierung von C. pepo und C . moschata nützlich ist. Um praktikable Kombinationen für die Embryonenrettung zu identifizieren, wurden 24 interspezifische Kreuzungen durchgeführt. Der Fruchtsatz wurde aus zweiundzwanzig Kreuzungen gewonnen, was auf eine Erfolgsquote von 92% hinweist. Die meisten der erhaltenen Früchte waren jedoch parthenocarpisch, mit Samen ohne Embryonen (leere Samen). Nur eine Kreuzung enthielt unreife Embryonen, die mit basalen Pflanzenwachstumsmedien regeneriert werden konnten. Insgesamt wurden 10 Embryonen aus der interspezifischen F_1-Frucht gerettet, und die Erfolgsrate der Embryonenrettung betrug 80%. Das hier entwickelte Embryonenrettungsprotokoll wird für die interspezifische Hybridisierung in Kürbiszuchtprogrammen nützlich sein.

Einleitung

Cucurbita (2n = 40) ist eine sehr vielfältige Gattung in der Familie der Kürbisgewächse (Cucurbitaceae), die 27 verschiedene Arten umfasst, von denen fünf domestiziert sind¹. Unter diesen sind Cucurbita moschata, C. pepo und C. maxima die wirtschaftlich wichtigsten weltweit. In den USA sind C. moschata und C. pepo die beiden wichtigsten Arten in der landwirtschaftlichen Produktion. C. pepo besteht aus vier Unterarten (Ovifera, Pepo, Bruderschaft und Gumala), die sowohl Sommer- als auch Winterkürbis-Sortengruppen von Krummhals, Straightneck, Eichel, Jakobsmuschel, Kokosnuss, Gemüsemark, Zucchini und Kürbis 2,3,4,5 enthalten. C. moschata besteht hauptsächlich aus Winterkürbismarkttypen wie Butternut, Dickinson und Käsegruppe¹. Die beiden Arten sind morphologisch und phänotypisch vielfältig, wobei C. pepo für seinen Ertrag, seine Frühigkeit, seine Buschwachstumsform und verschiedene Fruchtmerkmale wie Fruchtform, Fruchtgröße, Fleischfarbe und Rindenmuster angesehen wird. Auf der anderen Seite wird C. moschata für seine Anpassung an Hitze und Feuchtigkeit sowie für seine Krankheits- und Schädlingsresistenz geschätzt ^6,7. Die interspezifische Hybridisierung zwischen C. moschata und C. pepo ist nicht nur eine wichtige Strategie zur Introgression wünschenswerter Eigenschaften zwischen den beiden Arten, sondern ermöglicht auch die Erweiterung der genetischen Basis in Zuchtprogrammen ^7,8.

Frühe Kreuzungen zwischen C. moschata und C. pepo wurden gemacht, um ihre Kompatibilität und/oder taxonomischen Barrieren zu bestimmen 9,10,11, während spätere Studien sich hauptsächlich auf die Übertragung wünschenswerter Merkmale^{konzentrierten 12,13,14}. Die interspezifische Hybridisierung zwischen den beiden Arten hat auf die Übertragung neuer Merkmale wie eine Busch- oder Halbbuschwachstumsgewohnheit und einen verbesserten Ertrag von C. pepo zusammen mit Krankheitsresistenz, Anpassungsfähigkeit an abiotischen Stress und erhöhter Vitalität von C. moschata abzielt ^14,15,16. Zum Beispiel haben spezifische Kreuzungen zwischen C. pepo (P₅) und C. moschata (MO₃) zu einem höheren Fruchtertrag geführt 13, während C. moschata-Akzessionen (Nigerian Local und Menina) häufig als primäre Quelle der Resistenz gegen Potyviren in kultivierten C. pepo-Sorten verwendet wurden^17,18.

Frühere Studien zeigten, dass eine Hybridisierung zwischen C. moschata und C. pepo möglich, aber schwierig ist ^8,15. Die interspezifischen Kreuzungen könnten dazu führen, dass keine Früchte angesetzt werden (Abort), parthenocarpische Früchte ohne lebensfähige Samen (leere Samen), kernlose Früchte, bei denen sich die unreifen Embryonen nicht entwickeln (Stenospermocarpy), oder Früchte mit wenigen unreifen Embryonen, die durch Embryonenrettung in reife Pflanzen gerettet werden können^15,16. Zum Beispiel wurden keine lebensfähigen Samen durch Kreuzung von C. pepo (Tischkönigin, mütterlich) mit C. moschata (großer Käse, väterlicherseits) erhalten, aber die wechselseitige Kreuzung ergab 57 lebensfähige Samen aus 134 Bestäubungen⁹. Hayase erhielt lebensfähige Samen von C. moschata und C. pepo Kreuzungen nur, wenn Kreuzungen um 04:00 Uhr mit Pollen gemacht wurden, die über Nacht bei 10 °C gelagert wurden¹⁹. Baggett kreuzte acht verschiedene C. moschata-Sorten mit C. pepo (delicata) und berichtete, dass von insgesamt 103 Bestäubungen 83 Früchte erhalten wurden, die normal erschienen, aber keine von ihnen lebensfähige Samen enthielt⁸. In einer Kreuzung zwischen C. pepo (S179) und C. moschata (NK) erhielten Zhang et al. 15 Früchte mit 2.994 Samen, aber nur 12 dieser Samen waren lebensfähig, während die restlichen nur rudimentäre Entwicklung zeigten. Diese Studien deuten darauf hin, dass, obwohl die interspezifische Kreuzung zwischen C. moschata und C. pepo sehr vorteilhaft ist, die Gewinnung von Früchten mit lebensfähigen Samen aus den Kreuzungen anspruchsvoll ist¹⁶.

Die Embryonenrettung wurde als geeignete Methode zur Überwindung von Problemen vorgeschlagen, die sich aus einem frühen Abbruch oder schlecht entwickelten Embryonen ergeben, und ist eine der frühesten und erfolgreichsten In-vitro-Kulturtechniken zur Regeneration unreifer Embryonen^16,20. Die Embryonenrettung umfasst die In-vitro-Kultur von unterentwickelten/unreifen Embryonen, gefolgt von der Überführung auf ein steriles Nährmedium, um die Gewinnung von Sämlingen und schließlich reifen Pflanzen zu erleichtern²¹. Obwohl die Embryonenrettung häufig in der Kürbiszucht verwendet wird, fehlt eine detaillierte Beschreibung der geeigneten Methodik, die ihre routinemäßige Anwendung ermöglichen würde. Die Verwendung von Embryonenrettungstechniken zur Überwindung interspezifischer Hybridisierungsbarrieren bei Cucurbita-Arten wurde bereits 1954 berichtet²². Der Erfolg der Embryonenrettung in den frühen Studien war jedoch entweder nicht oder sehr gering. Metwally et al. berichteten über eine Erfolgsrate von 10% (Regeneration zu reifen Pflanzen) unter 100 interspezifischen Hybridembryonen, die aus einer Kreuzung zwischen C. pepo und C. martinezii gerettet wurden ²³. Sisko et al. berichteten über eine variable Erfolgsrate der Embryonenregeneration zwischen Embryonen, die aus verschiedenen Kreuzkombinationen gewonnen wurden: Die Regenerationsrate von Hybriden, die durch Kreuzung von C. maxima (Bos. Max) und C. pepo (Goldrausch) erhalten wurden, betrug 15,5%, für C. pepo (Zucchini) und C. moschata (Hokaido) 20%, während sie für C. pepo (Goldrausch) und C. moschata (Dolga) 37,5% betrug24. Neben dem Genotyp sind Medien und In-vitro-Kulturbedingungen wichtige Faktoren für den Erfolg der Technik^25,26. In der aktuellen Studie wurden verschiedene Kreuzungskombinationen zwischen C. moschata und C. pepo getestet und eine einfache Methodik zur Anwendung der Embryonenrettungstechnik im Kürbis entwickelt. Die Entwicklung einer einfachen und leicht reproduzierbaren Embryonenrettungstechnik wird die interspezifische Hybridisierung und Keimplasmaverstärkung in Kürbiszuchtprogrammen erleichtern.

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Protokoll

1. Anpflanzung und Bestäubung

HINWEIS: Es ist wichtig, kompatible Genotypen zu identifizieren, deren Hybridisierung zum Fruchtansatz und zur Produktion lebensfähiger Embryonen führen würde.

1. Pflanzbedingungen und Wartung
   1. Samen von Kürbis-Genotypen (Sorten / Akzessionen) für die Hybridisierung erhalten (Tabelle 1).
   2. Füllen Sie 50 Zellenausgangsflächen (25 cm Breite x 50 cm Länge) mit Topfmedium, das mit vollständigem NPK-Dünger mit 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P und 1,38 g/kg K ergänzt wird.
   3. Säen Sie Samen bis zu einer Tiefe aus, die ihrer Länge entspricht, und bedecken Sie sie mit einem Blumenerdemedium. Bewässern Sie die Wohnungen, ohne stehendes Wasser zu erzeugen. Danach halten Sie das Medium feucht, indem Sie es einmal täglich von Hand gießen.
   4. Im zweiten True-Leaf-Stadium verpflanzen Sie die Sämlinge in Töpfe mit einem Durchmesser von 25 cm bis 30 cm, die mit einem vollständigen NPK-Dünger bei 3 Esslöffeln / Topf ergänzt wurden. Düngen Sie die Pflanzen einmal pro Woche mit 500 ml / Topf Flüssigdünger, der NPK 20: 20: 20 enthält, hinzugefügt zu einer Konzentration von 1 g pro Gallone Wasser.
   5. Pflegen Sie die Pflanzen im Gewächshaus bei Temperaturen zwischen 22-28 ° C unter natürlichem Licht. Für Vining-Genotypen ist ein unterstützendes Spalier im Gewächshaus bereitzustellen (Abbildung 1).
2. Durchführung von Bestäubungen
   1. Typischerweise beginnt die Blüte in Kürbis je nach Sorte 6 bis 8 Wochen nach der Aussaat (Abbildung 2A,B). Beginnen Sie mit der kontrollierten Hybridisierung (Kreuzungen), sobald die Pflanzen zu blühen beginnen. Unter Gewächshausbedingungen kann die Bestäubung das ganze Jahr über erfolgen.
   2. Identifizieren Sie männliche und weibliche Blüten von C. pepo und C. moschata Sorten, die am nächsten Tag zur Bestäubung bereit sind. Um solche Blumen zu identifizieren, suchen Sie nach Blumen, deren Blütenblätter einen gelben Farbton haben, aber nicht geöffnet sind. Kleben Sie die oben verschlossenen Blüten vorsichtig mit Klebeband ab, um eine versehentliche Insektenbestäubung zu verhindern (Abbildung 2C,D).
   3. Am Morgen des folgenden Tages sind die Blüten bereit zur Bestäubung. Führen Sie die Bestäubung vor 10:00 Uhr durch, um die Erfolgsrate der Hybridisierung zu verbessern²⁷.
   4. Öffnen Sie die weiblichen und männlichen Blüten, indem Sie den geklebten oberen Teil der Blütenblätter vorsichtig entfernen. Entfernen Sie die Blütenblätter von der männlichen Blüte und übertragen Sie den Pollen, indem Sie den Staubbeutel sanft an der Narbe der weiblichen Blüte reiben (Abbildung 3A).
   5. Nach der Bestäubung sofort die bestäubte weibliche Blüte mit Abdeckband verschließen. Verwenden Sie eine Markierung, um das Datum der Bestäubung aufzuzeichnen und die väterlichen und mütterlichen Eltern anzugeben, die im Kreuz verwendet wurden (Abbildung 3B).
   6. Eine erfolgreiche Kreuzung wird durch einen erweiterten Eierstock angezeigt, der innerhalb von 1 Woche schnell eine kleine Frucht bildet (Abbildung 4A). Die Pflanze ist dann 45-55 Tage nach der Bestäubung²⁸ zur Ernte bereit (Abbildung 4B).

2. Technik zur Rettung von Embryonen

1. Medienvorbereitung
   1. Antibiotikabrühen vorbereiten: Für Cefotaxim (Natriumsalz) das Antibiotikum in 4 ml entionisiertem oder destilliertem Wasser lösen, durch einen sterilen 0,22 μm Spritzenfilter filtern und 0,5 ml Aliquots herstellen. Bei -20 °C lagern. Die resultierende Stammlösung hat eine Konzentration von 250 mg/ml.
   2. Für Ampicillin (Natriumsalz) wird das Pulver in 10 ml Wasser gelöst, durch einen sterilen 0,22 μm Spritzenfilter filtriert und in 1 ml Brühe mit einer Endkonzentration von 100 mg/ml aliquot. Bei -20 °C lagern.
   3. Machen Sie Murashige und Skoog (MS) Medium, indem Sie 2,45 g Medium (4,91 g / L Konzentration) in 500 ml destilliertem Wasser in einer 1 L Flasche auflösen. 1,5 g Gellangummi zugeben und Autoklav bei 121 °C für 20 min geben. Der Gellangummi löst sich während des Autoklavierens vollständig auf.
   4. Nach dem Autoklavieren kühlen Sie das Medium ab, indem Sie die Flasche in ein Wasserbad bei 50 °C stellen. Nehmen Sie die Antibiotikavorräte aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie im Laminar-Flow-Schrank auf.
   5. Füllen Sie die mittlere Flasche in die Laminar-Flow-Haube. 0,6 ml Cefotaxim-Stammlösung (250 mg/ml) und 0,25 ml Ampicillinbrühe (100 mg/ml) in die mittlere Flasche geben und gut mischen. Gießen Sie ca. 7 ml des Mediums in eine sterile Petrischale (60 mm x 15 mm).
   6. Lassen Sie das Medium in den Petrischalen ca. 15-20 min erstarren. Verschließen Sie die Petrischalen mit Siegelfolie und legen Sie sie in eine Aufbewahrungsbox. Bei Raumtemperatur lagern.
2. Embryonenrettung
   1. Vor dem Start reinigen und sterilisieren Sie den Laminar-Air-Flow-Schrank mit 70% Ethylalkohol.
   2. Ernten Sie die Kürbisfrüchte, indem Sie sie von der Hauptrebe brechen/abschneiden, und desinfizieren Sie die Fruchtoberfläche durch Waschen mit Flüssigwaschmittel (z. B. 0,3% Chloroxylenol) in der Laborspüle, bis der gesamte lose Schmutz entfernt ist (Abbildung 5A).
   3. Mit reichlich Leitungswasser abspülen. Trocknen Sie die Früchte mit sauberen Papiertüchern. Bringen Sie die Frucht in den Laminar-Luftstromschrank (Abbildung 5B).
   4. Oberflächensterilisieren Sie die Frucht, indem Sie 70% Ethanol auf die Frucht im sterilen Laminar-Air-Flow-Schrank sprühen. Die Früchte mit einem sterilen Messer halbieren (Abbildung 5C) und die Samen extrahieren.
   5. Verwenden Sie sterile Pinzetten, um die Samenhülle aseptisch zu öffnen und die unreifen Embryonen freizulegen (Abbildung 6). Legen Sie die unreifen Embryonen vorsichtig in eine Petrischale mit MS-Medium, ergänzt mit Cefotaxim und Ampicillin (Abbildung 7A). Petrischale verschließen und mit Wickelfolie verschließen.
      HINWEIS: Je nach Größe des Embryos ist es möglich, fünf oder sechs Embryonen in eine Petrischale zu passen.
   6. Legen Sie die verschlossenen Petrischalen mit Embryonen in eine Wachstumskammer unter 16 h Photoperiode bei 25 °C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit. Wenn eine Kontamination auftritt, subkultivieren Sie die nicht kontaminierten Embryonen umgehend in eine neue Platte mit dem gleichen Medium.
   7. Die Keimblätter beginnen sich nach 4 Tagen auszudehnen und werden in 10 Tagen grün (Abbildung 7B). Führen Sie an diesem Punkt bei Bedarf eine Subkulturierung in neue Platten durch, die das gleiche Medium enthalten, um eine Gewebeexpansion zu ermöglichen. Die Wurzeln beginnen nach 14 Tagen zu erscheinen (Abbildung 7C), und nach 21 Tagen haben die Pflänzchen verlängerte Wurzeln und Keimblätter (Abbildung 7D).
      HINWEIS: Das im Protokoll verwendete Kulturmedium eignet sich zur Differenzierung in Triebe und Wurzeln ohne zusätzliche Wachstumsregulatoren.
   8. Entfernen Sie in diesem Stadium die Pflänzchen aus der Petrischalen und waschen Sie das Medium vorsichtig mit Leitungswasser von den Wurzeln ab (Abbildung 8). Legen Sie die Pflänzchen in einen Kunststoffbehälter (14 cm x 9 cm x 4 cm) und decken Sie die Wurzeln mit nassen Papiertüchern ab (Abbildung 9A). Decken Sie den Behälter ab und befeuchten Sie die Papiertücher nach Bedarf.
   9. Bewahren Sie die Behälter bei Raumtemperatur (25-28 °C) und mit einer Photoperiode von 16 h auf. Dieser Schritt wird die Pflänzchen akklimatisieren. Nach der Akklimatisierung für 7-10 Tage im Behälter werden die Sämlinge ungefähr 3-4 in lang sein. Während dieser Zeit die Papierhandtücher nach Bedarf neu befeuchten.
   10. Die Sämlinge werden wie zuvor beschrieben in 50 Zellstartflächen (25 cm Breite x 50 cm Länge) überführt, die mit Dünger bearbeitet wurden, und in das Gewächshaus gebracht (Abbildung 9B). Sämlinge nicht übergießen, um Fäulnis zu vermeiden; Fügen Sie nach Bedarf ca. 10-20 ml pro Zelle hinzu.
   11. Im zweiten bis dritten True-Leaf-Stadium werden die Sämlinge in Töpfe mit einem Durchmesser von 30 cm verpflanzt, die mit Blumenerde gefüllt sind, die wie zuvor beschrieben mit Dünger ergänzt wurden (Abbildung 10A). Bieten Sie Spalierunterstützung für Weinpflanzen und führen Sie eine kontrollierte Hybridisierung durch, wenn die Pflanzen zu blühen beginnen, wie zuvor beschrieben (Abbildung 10B).
   12. Pflegen Sie die Pflanzen im Gewächshaus bei Temperaturen zwischen 22-28 °C unter natürlichem Licht. Bewerten Sie die Pflanzen auf Frucht- und Sameneigenschaften.

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Ergebnisse

Fruchtansatz und Lebensfähigkeit des Saatguts
Ein erster Test wurde durchgeführt, um den Fruchtansatz und die Lebensfähigkeit von Samen in einer Vielzahl von Kreuzkombinationen zu bestimmen. Insgesamt wurden 15 Kürbis-Genotypen, vier C. pepo und 11 C. moschata, ausgewählt (Tabelle 1). Von den 24 versuchten interspezifischen Kreuzkombinationen wurde für 22 ein Fruchtansatz erhalten (Tabelle 2), was einem Gesamterfolg von >92% im Fruchtsatz entsp...

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Diskussion

Es gibt zwei Hauptengpässe für eine erfolgreiche interspezifische Hybridisierung zwischen C. moschata und C. pepo: die Kreuzkompatibilitätsbarriere, die durch die Reaktionsfähigkeit des Genotyps bestimmt wird, um Hybridembryonen zu produzieren, und die Barrieren nach der Befruchtung, die die Entwicklung von Hybridembryonen zu normalen Samen behindern. Wie bereits für Kürbis berichtet, ergab der Kreuzkompatibilitätstest in der aktuellen Studie, dass sich die meisten Früchte parthenocarpisch entwi...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
autoclave	Steris	AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime	Sigma Alfrich	C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml)	Sigma Alfrich	T9661
detergent
ethanol, 95%	Decon Labs	2805HC
forceps	VWR	82027-408
gellan gum	Caisson Laboratories	G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet	The Baker Company, Inc	Edgegard
masking tape	Uline	S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium	Research Products International	M10200
NPK fertilizer (20-20-20)	BWI Companies, Inc	PR200
Osmocote Plus fertilizer	BWI Companie,s Inc	OS90590
Parafilm M	Sigma Alfrich	P7793
Petri dish (60 x 15 mm)	USA Scientific, Inc	8609-0160
plant pots	BWI Companies, Inc	NP4000BXL
plastic food containers, reused	Oscar Mayer	4470003330
plastic hang tags	Amazon	B07QTZRY6T
potting mix	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
seedling starter trays	BWI Companies Inc	GPPF128S4
syringe filter (0.22 um )	ExtraGene	B25CA022-S
trellis support	The Home Depot	2A060006
water bath