蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

要約

本プロトコルは、膜タンパク質に対して蛍光サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)を実行して、下流の機能的および構造的分析のためにそれらの品質を評価する手順を説明しています。界面活性剤可溶化および界面活性剤フリー条件下でいくつかのGタンパク質共役受容体(GPCR)について収集された代表的なFSEC結果が提示されています。

要約

膜タンパク質の構造解明と生物物理学的特性評価では、膜からの抽出後に凝集しないものを見つけるために、異なるタグ、切り捨て、欠失、融合パートナーの挿入、および安定化変異を含む多数のタンパク質構築物を試すのが一般的です。さらに、膜タンパク質に最も安定化条件を提供する界面活性剤、添加剤、リガンド、またはポリマーを決定するためのバッファースクリーニングは重要な慣行です。蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質の品質の早期特性評価は、タンパク質精製を必要とせずにさまざまなコンストラクトや条件を評価およびランク付けするための強力なツールを提供し、このツールはサンプル要件も最小限に抑えます。膜タンパク質は、通常、GFPタグなどで発現させることにより、蛍光タグを付ける必要があります。タンパク質は全細胞から直接可溶化し、遠心分離によって粗く清澄化することができます。続いて、タンパク質をサイズ排除カラムに流し、蛍光トレースを収集します。ここでは、スフィンゴシン-1リン酸受容体(S1PR1)およびセロトニン受容体(5HT2AR)を標的とするGPCRに関するFSECおよび代表的なFSECデータを実行するための方法が提示される。

概要

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、ゲルろ過クロマトグラフィーとも呼ばれ、タンパク質科学で一般的に使用されています¹。SEC中、タンパク質は、タンパク質のサイズと形状²の関数である流体力学的半径に基づいて分離されます。簡単に言えば、この分離は、分子ふるいとして機能する多孔質ビーズの充填床に流動下のタンパク質サンプルを適用することによって達成される。使用されるビーズは、多くの場合、タンパク質がビーズの細孔に入るか、または細孔から排除されることを可能にするために、定義された範囲の細孔サイズを有する架橋アガロースである³、⁴、^5、6、7。流体力学的半径が小さいタンパク質は、細孔内でより多くの時間を費やすため、充填層をゆっくりと流れるのに対し、大きいタンパク質はビーズの外側(除外された体積)の時間の割合が高く、充填層内をより速く移動します。SECは、分取カラムを使用する場合のタンパク質精製ステップとして使用できます¹。分析カラムを使用する場合、SECを使用してタンパク質の品質と特性を分析できます²。例えば、サンプル中に存在し、質の悪いタンパク質を示すタンパク質凝集体は非常に大きくなる傾向があり、除外された体積でのみ移動するため、最も早い時点でカラムから溶出されます。このボリュームは、カラムボイドまたはボイドボリュームと呼ばれます。さらに、分子量標準物質を使用してカラムを校正することができ、目的タンパク質の推定分子量を標準曲線から補間することができます。

通常、280 nmでのタンパク質吸光度は、サイズ排除カラムからのタンパク質溶出をモニターするために使用されます。これにより、例えばタンパク質精製の最終ステップで、目的のタンパク質に汚染タンパク質がほとんどなくなるまで、分析ツールとしてのSECの使用が制限されます。しかしながら、蛍光SEC(FSEC)は、蛍光標識された目的のタンパク質を利用する。したがって、蛍光シグナルを使用して、他のタンパク質または粗混合物の存在下での目的のタンパク質の溶出を特異的にモニターすることができる^8、9。さらに、蛍光シグナルは高感度であるため、タンパク質量が極めて少ないサンプルでも分析を成功させることができます。目的のタンパク質は、緑色蛍光タンパク質(GFP)または増強GFP(eGFP)タグを発現構築物に含めることによって蛍光標識されることがよくあります。次いで、蛍光シグナルは、395nmまたは488nmでの励起、およびGFPまたはeGFPについてそれぞれ509nmまたは507nmでの蛍光発光を検出することによってモニターすることができる¹⁰。

蛍光シグナルを使用してSECカラムからのタンパク質溶出をモニタリングする利点があるため、FSECは、可溶性タンパク質と比較して発現レベルが特に低い場合に、膜タンパク質サンプルを分析するための貴重なツールとなります。重要なのは、膜タンパク質の品質と特性を、精製プロセスを最適化する必要なしに、粗ライセートからの可溶化の直後に分析できることです^11,12。これらの理由から、FSECは、溶液中の膜タンパク質の挙動を改善するために必要となる可能性のあるさまざまな要因を探索しながら、膜タンパク質の品質を迅速に分析するために使用できます。例えば、膜からの抽出後に凝集しないものを見出すために、異なるタグ、切り捨て、欠失、融合パートナーの挿入、および安定化変異を含む多数の構築物を試すのが一般的である^13、14。さらに、膜タンパク質に最も安定化条件を提供する界面活性剤、添加剤、リガンド、またはポリマーを決定するためのバッファースクリーニングは、タンパク質精製に最適なバッファー組成物を定義するか、生物物理学的アッセイや構造特性評価などのダウンストリーム用途に安定性を提供するためのバッファー組成物を定義できます。

したがって、FSEC法の全体的な目標は、目的の標的膜タンパク質のSECカラム溶出プロファイルを収集することです。さらに、蛍光が使用されるため、このSECトレースは、長時間の精製の前に、コンストラクトと条件の最適化の可能な限り早い時点で収集されます。FSECトレースは、異なるバッファー条件または膜タンパク質構築物で膜タンパク質の精製が成功する可能性を判断するための比較ツールとして使用できます。このように、FSECプロファイルの収集は、他の分析方法に必要な量の純粋なタンパク質を生成する労力を費やす前に、最適な構築設計とバッファー組成に到達するための迅速な反復プロセスとして使用できます。

プロトコル

1. FSEC用の洗剤およびバッファー調製

1. 洗剤原液を調製します。
   1. 20 mLのストック溶液を調製するには、4 gのドデシルマルトシド(DDM)粉末と0.4 gのコレステリルヘミコハク酸(CHS)粉末を量り、実験室グレードの蒸留H₂Oで20 mLにします。
   2. すべての成分を添加した後、成分が完全に可溶になるまで4°Cでエンドオーバーエンド反転で混合します。4°Cで一晩のエンドオーバーエンド混合をお勧めします。
   3. 洗剤ストックを分注し、使用するまで-20°Cで保管します。ストックをすぐに使用する必要がある場合は、洗剤ストックを氷の上に保管してください。
      注意: この作業で使用された標準的な洗剤ストックは、20%(w / v)DDMと2%(w / v)CHS混合物でした( 材料の表を参照)。異なる洗剤を使用することができる(例えば、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール;LMNG)、またはスチレン - マレイン酸(SMA)などのポリマーによる洗剤フリー抽出の使用を試験することができる。これは、テストする実験条件を設計するときに決定する必要があります。
2. 可溶化バッファーを調製します。
   1. ビーカーで100 mM HEPES、200 mM NaCl、20 %(v/v)グリセロール、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル( 材料の表を参照)を達成するために、成分の正しい重量または容量を組み合わせて可溶化バッファーを調製します。
      注:本研究では、50 mLの可溶化バッファーの調製で5つのサンプルを処理するのに十分でした。
   2. 実験室グレードの蒸留_H2Oの0.7容量(例えば、50mLのバッファーを作る場合は35mL)をビーカーに加える。
   3. マグネチックスターラーで混合し、pHメーターを用いて、濃NaOHを滴下することにより緩衝液pHを7.5に調整する。
   4. 測定シリンダーを使用して、実験室グレードの蒸留H₂Oでバッファーを最終的に必要な量まで補充します。
3. SEC 実行バッファを準備します。
   1. ビーカー中の最終濃度100 mM HEPES、150 mM NaCl、および10%(v/v)グリセロールを達成するために、成分の正しい重量または体積を組み合わせてSECランニングバッファーを準備します。
      注:本研究では、600 mLのSECバッファーを調製するだけで、5つのサンプルを実行するのに十分でした。
   2. 実験室グレードの蒸留H₂Oの0.7容量(たとえば、600 mLのバッファーを作成する場合は420 mL)をビーカーに追加します。
   3. マグネチックスターラーで混合し、pHメーターを用いて、濃NaOHを滴下することにより緩衝液pHを7.5に調整する。
   4. 測定シリンダーを使用して、実験室グレードの蒸留H₂Oでバッファーを最終的に必要な量まで補充します。
   5. SECバッファーをボトルトップの0.45 μmポアフィルターで真空下でろ過します(材料表を参照)。
   6. バッファーがフィルターを通過したら、振とうしたときに気泡が現れなくなるまで真空下に置いて脱気します。
   7. ステップ1で調製した洗剤ストックの必要量(例えば、600 mLのSECバッファーを作成する場合は0.9 mL)を加えて、最終濃度0.03%(w / v)DDMおよび0.003%(w / v)CHSをSECバッファーに追加します。
   8. 使用前にバッファーを事前に冷やしてください。
      注: テストする条件に応じて、異なるバッファーを使用できます。例えば、目的のタンパク質に対する異なる界面活性剤の効果をテストする場合、タンパク質の可溶化に使用したのと同じ界面活性剤を含むバッファーを作るのが理想的です。SMAで洗剤を含まない条件をテストする場合は、洗剤をSECバッファーから完全に省略する必要があります。ただし、洗剤スクリーニングのプロトコル変更の詳細については、説明セクションを参照してください。

2. FSECのためのサンプル調製

1. セルペレットを準備します。
   注:アッセイの開始点は、目的のGFPタグ付き(または他の蛍光標識)タンパク質の浮遊細胞発現培養物から細胞ペレットを採取することです。採取の正確なタイミングと条件は、発現されるタンパク質、使用される細胞株、増殖した細胞の条件、およびタンパク質発現が誘導された方法によって異なります。これらの詳細は、このプロトコルの範囲を超えています。この研究では、試験する条件ごとに0.5〜1 gのSf21細胞ペレットを使用し、P2バキュロウイルスの1:20希釈の約4 x 10⁶ 生細胞/ mLの感染後25〜50 mLの培養液に相当します。ここに記載されているプロトコルはテスト済みであり、他の真核細胞株(HEK293Eなど)からの細胞ペレットの同様の湿重量でも同様にうまく機能することがわかっていることに注意してください。
   1. 浮遊培養液からの細胞を回収する準備ができたら、25〜50 mLの培養アリコートを50 mLのコニカルチューブに移します。
   2. チューブをカウンターバランスし、スイングアウトバケット( 材料表を参照)でベンチトップ遠心分離機を2,000 x g で室温で15分間使用して、細胞をペレット化します。
   3. 培養上清を軽く傾けて取り出して廃棄するか、細胞ペレットが特に緩い場合は、ピペットフィラーを含む50 mLピペットを使用します。
   4. 細胞をすぐに分析に使用する場合は、細胞ペレットを氷上に置き、ステップ5に直接進みます。細胞を後の段階で使用するために保存する場合は、細胞を-80°Cに置いて凍結します。
   5. 細胞ペレットが-80°Cで保存されている場合は、室温で15分間、またはサンプルが凍結しなくなるまでインキュベートして急速に解凍します。この手順に従って、サンプルをすぐに氷に移動します。
2. サンプルを再懸濁して可溶化します。
   1. 2 mLの可溶化バッファーを細胞ペレットに加えます(ステップ1.2)。
   2. エンドオーバーエンド反転状態で4°Cで15〜30分間均質になるまでインキュベートします。
   3. 最終濃度が1%DDM / 0.1%CHSになるまで、プレミックス洗剤ストック(ステップ1.1)(例:100 μLの20%DDM / 2%CHSストック)を追加します。
   4. 4°Cでエンドオーバーエンド反転しながら30分間可溶化します。
      注:必要に応じて、複数の条件を並行してテストできます。一度に処理できる並列サンプルの数は、SEC実験を実行するために利用可能なシステムによって異なります。ここで説明するセットアップでは、一度に最大5つのサンプルを処理することができました。
3. 低速遠心分離工程を行う。
   1. サンプルをプレチルド(4°C)ベンチトップ遠心分離機でスイングアウトバケットで2,000 x g で15分間遠心分離します。
4. 高速遠心分離工程を行う。
   1. 低速スピンによるペレットの乱れないように注意しながら、5mLシリンジに取り付けられた鈍端針を使用して、低速遠心分離から超遠心チューブ(0.5〜2 mLチューブなど)に上清を慎重に移します。
   2. チューブのペアを0.05 g以内にバランスさせ、固定角度の超遠心分離ローターに入れます( 材料の表を参照)。
   3. 4°Cで250,000 x gで30分間遠心分離します。

3. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)

1. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを調製し、カラムを平衡化します。
   1. たとえば、システムにSECバッファーを充填し、ポンプから空気をパージすることにより、製造元の指示に従ってシステムを準備します( 材料表を参照)。
   2. SECカラムをFPLCに接続し、カラムに空気が入らないようにします。これは、FPLCシステムの流路とのドロップツードロップ接続を実行するために、水で満たされたシリンジ(カラムの底部に取り付けられている)でSECカラムに背圧を加えることによって達成されます。
   3. SECカラムを最初に実験室グレードの蒸留およびろ過された_H2Oの1.5カラム容量(24 mLカラムの場合は36 mL)で洗浄し、次にカラムに推奨される流量と圧力で1.5カラム容量のSECバッファーで洗浄することにより、SECカラムを事前平衡化します( 材料表を参照)。
      注:この研究でFSECを実行するために使用されたFPLCシステムは、寒い環境にあり、5ポジションループバルブと6ポジションプレートフラクションコレクターが取り付けられていました。この設定により、5つのサンプルをロードし、実行間に手動で介入することなく、同じカラムに自動で順番に実行できます。SEC実験を実行するために、10〜600 kDaの分子量範囲のタンパク質を分解できる樹脂を含む市販のプレパック24 mLカラムを使用しました( 材料の表を参照)。目的のタンパク質が特に大きい場合は、代わりに代替カラムマトリックスを使用して、分子量5,000 kDaまでのタンパク質を分離することができます。界面活性剤/脂質ミセルの存在は、使用するタンパク質と界面活性剤に応じて、膜タンパク質の全体的なサイズが>150 kDa増加することに注意してください。
2. サンプルを列に適用し、SEC 実験を実行します。
   1. シリンジに取り付けられた鈍端針を使用して、高速遠心分離ステップから1 mLシリンジに上清を移します。これにより、ペレットを乱すことなく遠心分離管からサンプルを回収することができます。
   2. サンプルループをロードするように設定します。シリンジから600〜700 μLのサンプルをローディングポートに注入することにより、500 μLのサンプルループをオーバーフィルします。使用するシステムに応じて、このロードステップをメソッドにプログラムして、間違いがないことを保証することができます。
   3. メソッドの際、カラムの推奨流量と圧力で4 mLのSECバッファーでサンプルを空にして、ループからカラムに注入します( 材料の表を参照)。
   4. バッファーの 1.5 カラム容量 (24 mL カラムの場合は 36 mL) が通過するまで、同じ流速でカラムを実行します。
   5. カラム容量の0.25(24 mLカラムの場合は6 mL)で、90フラクションを収集するために0.2 mLフラクションの収集を開始します。
      注:カラムのボイド容量は0.3カラム容量と予想されるため、この直前にフラクションの収集を開始すると、ボイドボリュームに存在するタンパク質を含むすべてのタンパク質の溶出が確実に監視されます。

4. 蛍光トレースの収集と分析

1. サンプルをフラクションコレクターから96ウェルプレートに移し(ステップ3.2.5)、蛍光シグナルを読み取ります。
   1. 蛍光測定値を取得する前に、収集したサンプルを希釈してください。マルチチャンネルピペットを使用して、90 μLの実験室グレードの蒸留H₂Oをリザーバーから不透明な平底96ウェルプレートの各ウェルに移します( 材料表を参照)。
   2. ステップ3.2.5でフラクションを96ウェルブロックに回収した場合は、マルチチャンネルピペットを使用して、10 μLのSECフラクションをブロックから不透明な平底96ウェルプレートに移し、上下にピペッティングして混合します。それ以外の場合、ステップ3.2.5中にSECフラクションを個々のチューブに収集した場合は、各フラクションの10 μLを不透明な平底96ウェルプレートに1つずつ移し、毎回上下にピペッティングしてサンプルを混合します。
   3. 不透明な平底96穴プレートをプレートリーダーに入れ、蛍光を測定する。GFPが蛍光標識体(ここで使用する場合)の場合は、励起をできるだけ488 nmに近づけ、507 nmにできるだけ近い蛍光発光を検出します。
      注:蛍光読み取りを行う前に必要な希釈は、発現培養物に存在する目的タンパク質の総量と、使用するプレートリーダーの感度によって異なります。この研究で示された例では、サンプルを水で10倍希釈しました。出発点の提案として、画分は検出前に水またはバッファーで5〜10倍希釈する必要があります。記録されたFSECトレースシグナルが特に低い場合は、代わりに、より小さな希釈液または希釈されていないサンプルを使用できます。この研究で検出に使用したデバイスは、488 nmで励起し、507 nmで蛍光発光を検出できるプレートリーダーでした( 材料の表を参照)。
2. FSEC トレースをプロットします。
   1. プレートリーダーからデータを生の形式(生のテキストまたはカンマ区切り値ファイル)でエクスポートします。これらの生データは、FSECトレースのY軸にプロットされます。
   2. X軸については、各フラクションが収集された体積を計算します。最初のウェルは、分画遅延を考慮するために最初のフラクションが収集された溶出量である必要があります(この例では6 mL)。この後のフラクションは、収集されたフラクション容量(この例では0.2 mL)だけ順次増加する必要があります。
   3. X軸とY軸のデータが計算されたら、データをコピーしてグラフ作成ソフトウェア( 材料表を参照)に貼り付け、各ウェルの蛍光シグナルをカラムから溶出した体積に対してプロットします。
      注: 図 1 は、FSEC 実験を実行するために必要な手順の概略 図 を示しています。
3. FSEC トレースを分析します。
   1. 空隙量(24 mLカラムで約8 mL)でのタンパク質溶出量を評価します。これは、タンパク質のサイズが非常に大きく、折りたたまれていない/凝集している可能性が高いことを示しています。
   2. 折り畳まれたタンパク質を示す後続のピークで溶出するタンパク質の量を評価します。これは、タンパク質サイズに応じて、24 mLカラムで10 mL〜16 mLになると予想されます(界面活性剤/脂質ミセルに関連する場合)。ピーク形状、特に3〜4 mLを超えるブロードまたはスプリットピーク(24 mLカラムの場合)は、多分散サンプルを示すため、ピーク形状に細心の注意を払ってください。
   3. モノマーピークに記録された最大信号をボイドピークの最大信号で割ることにより、モノマーピーク高さとボイドピーク高さとの比を算出する。
      注:この値は単分散度指数を表し、タンパク質の品質を定量的に測定できます。値が大きいほど可能な限り最高の品質を示し、1未満の値は折り畳まれたタンパク質よりも凝集したタンパク質が多いため、問題のあるサンプルを示します。
   4. 複数のFSECランを比較する場合、最も重要な特徴がそれぞれの場合のモノマーの量である場合、プレートリーダー(RFUなど)によって記録された生信号としてトレースをプロットします。
      注:アンフォールディングタンパク質と比較したモノマー量の比較がより重要な場合は、トレースの最小測定値と最大測定値を使用してシグナルを全シグナルのパーセンテージに正規化する必要があり、トレース間の凝集タンパク質とモノマータンパク質の比率の違いが強調されます。

図1:FSEC実験を実行するために必要なステップの概略図。 (1)目的の蛍光タグ付きタンパク質を発現する細胞を可溶化する。(2)粗可溶化は、最初に低速スピンで清澄化し、次に(3)高速スピンで清澄化する。(4)清澄化されたサンプル上清をロードして適切なSECカラムに流し、(5)フラクションを収集します。(6)フラクションのサンプルを96ウェルプレートに移し、プレートリーダーを使用してGFP蛍光シグナルを検出して、(7)FSECトレースをプロットします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

まず、本研究で用いたプレートリーダーのeGFP検出のダイナミックレンジと下限を調査した。既知濃度の精製eGFP標準物質を最終容量50 μLで50 ng・μL−1、25 ng・μL−1、12.5 ng・μL−1、6.25 ng・μL−1、3.125 ng・μL−1、1.5625 ng・μL−1、0.78125 ng・μL−1、および0.390625 ng・μL⁻¹に希釈し、488 nmの励起と507 nmの発光を用いて蛍光を読み取りました(図2).この実験は、プレートリーダーの検出限界がウェルあたり30 ngのeGFP標識タンパク質の下限と、シグナル飽和前のウェルあたり最大500 ngのeGFP標識タンパク質のダイナミックレンジを有することを示しました。下限の値を使用し、タンパク質溶出がカラム容量の0.33に制限されていると仮定すると、検出可能なFSECシグナルを観察するために、目的のeGFP標識タンパク質をSECカラムローディングに必要なeGFP標識タンパク質はわずか1.28 μgです。

図2:eGFP標準曲線。50 ng·μL⁻¹, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125, および0.390625 ng·μL⁻¹に希釈した精製eGFP標準物質の蛍光シグナルの散布図。(A)飽和信号を含むすべての希釈液が表示されます。(B)プレートリーダーのダイナミックレンジに入る標準のみを含むズームイン散布図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

次に、この研究に使用した24 mLカラムを分子量標準で校正しました。FSEC分析に用いたのと同じバッファーと実行条件を用いて、分子量スタンダードのブルーデキストラン(>2,000 kDa)、フェリチン(440 kDa)、アルドラーゼ(158 kDa)、コンアルブミン(75 kDa)、およびオボアルブミン(43 kDa)を個別に注入してカラムに通し、280 nmの吸収で溶出痕跡を収集しました。記録された溶出量は、それぞれ8.9 mL、12.4 mL、15.2 mL、16.9 mL、および18 mLでした。これらの溶出量を_Kav (式1)に変換し、対数分子量に対してプロットすると、標準曲線を当てはめることができました。これにより、この研究でテストしたGPCRの分子量を標準曲線の補間によって推定することができました(図3)。例えば、界面活性剤DDMへの可溶化後のGPCRセロトニン受容体2A(_5HT2AR)のFSECトレースは、13.4mLの溶出量を示した。この5HT_2AR溶出量は、フェリチンおよびアルドラーゼについて記録された溶出量の間にあり、約300kDaの推定分子量を提供する。この研究で使用された5HT_2ARコンストラクトは約50 kDa(eGFPタグを含む)であり、5HT_2ARが単量体であると仮定すると、250 kDaの分子量がDDM界面活性剤/脂質ミセルに起因する可能性があることを意味します。溶出量の換算式は以下の通りである(式1)。

(式1)

ここで、_Veは溶出量、_V0はカラムボイド量、_Vcは総カラム容量です。

図3:分子量標準を使用したSECカラムの検量線。 (A)DDMに可溶化された5HT_2ARの代表的なFSECトレースで、分子量標準ブルーデキストラン(Void)、フェリチン、アルドラーゼ、コンアルブミン、およびオボアルブミンの相対溶出位置にマークを付けます。フェリチン、アルドラーゼ、コンアルブミン、およびオボアルブミンは、それぞれ緑、紫、赤、およびシアンに着色されています。(b)_Kavへの変換後の標準物質の溶出位置を用いて検量線(式1)を対数分子量_(Mir)に対してプロットした分子量。DDMにおける5HT2AR_のMirを_Kavを用いて曲線から補間し、曲線上(青四角)上に表示する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

次に、FSECを使用して、GPCRスフィンゴシン-1-リン酸受容体(S1PR₁)¹⁵の品質と特性を評価しました。GFPタグ付きヒトS1PR1を発現する昆虫細胞を、プロトコル(図1)に記載されるようにFSECについて処理した。

まず、界面活性剤DDMおよびLMNGをSMAによる洗剤フリー抽出に対してテストすることにより、最適な膜抽出条件を調査しました(図4A)。単分散度指数を使用して、タンパク質サンプルの品質、および単分散サンプル(14-15 mLカラム保持)と比較した空隙中のタンパク質の比率(~8 mLカラム保持)を評価しました。LMNGで可溶化されたサンプルは、より良いモノマーピーク形状とより低いタンパク質凝集ピークを備えた優れたFSECプロファイルを示し、LMNGでの可溶化と精製がこの膜タンパク質の最も安定化条件であることを示しています。対照的に、DDMで可溶化されたサンプルは、FSECプロファイルが比較的悪く、凝集ピークが大きく、モノマーピークが広く、サンプル中の多分散性を示しました。

次に、可溶化中にサンプルにスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)を添加することにより、FSECプロファイルに対するリガンド添加の効果を調べました。この場合、可溶化試薬としてDDMを使用し、S1Pの存在下と非存在下でのS1PR₁ のFSECトレースを比較しました(図4B)。S1Pの存在下で可溶化されたサンプルは、凝集が減少した優れたFSECトレースを示しました。このことから、リガンド存在下での精製は、溶液中で受容体を安定化させることでタンパク質試料の品質を向上させるのに有利であると同時に、タンパク質が正しく折り畳まれ、リガンド結合能力があることが示唆されたため、タンパク質活性の代理マーカーとしても有利であることが示された。

図4:最適な膜抽出条件およびリガンド結合を示すS1PR1の粗抽出物を用いたFSEC。 (A)スチレン-マレイン酸共重合体(SMA;青)、ラウリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG;赤)、またはドデシルマルトシド(DDM;黒)に可溶化されたS1PR1の微量のFSECの比較。(B)アゴニストスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の存在下(赤)または非存在下(黒)でDDMに可溶化されたS1PR1の痕跡のFSECの比較。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

FSECは、さまざまな条件下での5HT_2ARの長期安定性を調査するためにも使用されました。GFPタグ付きヒト5HT 2A Rを昆虫細胞膜から界面活性剤(DDM)または_SMAポリマーのいずれかに可溶化し、4°Cまたは室温で保存した後の数時点でFSECによって分析しました(図5)。数日間のインキュベーション後、DDM中の5HT_2ARは、いずれかの温度でモノマーピーク高さの有意な低下を示し、凝集ピークの有意な増加が観察されました。対照的に、SMA脂質粒子(SMALP)中の5HT_2ARは、実験の過程で単量体ピーク高さの有意な低下を示さず、SMALP中のタンパク質が不利な温度でもより長く安定していることを示しています。これは、表面プラズモン共鳴(SPR)実験など、結合実験を正常に完了するためにサンプルが長期間にわたって安定して活性であることが要求される下流の生物物理学的アプリケーション用のタンパク質調製を検討する場合に重要になる可能性があります。

図5:FSECによって分析された、DDMまたはSMALPのいずれかを使用して膜から抽出された5HT_2ARの品質に対する時間と温度の影響 。 (A)DDMに可溶化し、室温で1日(灰色)、2日(緑)、または5日間(青)保存した5HT_2ARの代表的なFSECトレース。(B)4°C(青)またはRT(緑)で保存されたDDMサンプルの正規化されたモノマーピーク高さのヒストグラムと、4°C(灰色)またはRT(黒)で保存されたSMALPサンプルの比較。エラーバーはSEMの代表です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで紹介するFSECによる条件スクリーニングのための一般的な系統的アプローチにより、膜タンパク質の生産のための可溶化および精製パラメータの迅速な最適化が可能になります。これは、生物物理学的および構造的研究のために、安定で機能的に活性な膜タンパク質を迅速に生産できることを意味します。さらに、FSECは、膜タンパク質ラボにすでに設置されている可能性が高い実験装置を使用して実行できるため、アッセイを実行するための専門機器を購入する必要はありません。

重要な手順
界面活性剤中の細胞からの可溶化点からサンプルがSECカラムを通過する時点(ステップ2.1.5-3.2.5)までの時間は時間的に重要であり、これらのステップの間に一時停止があってはなりません。すべてのステップは4°Cまたは氷上で実施する必要があり、これらのステップの実行にかかる時間は可能な限り最小限に抑える必要があります。これらの時間と温度の制約は、潜在的なアンフォールディングまたは分解の前に膜タンパク質のFSECプロファイルを記録するために必要です。膜タンパク質が可溶化された後は、4°Cでもアンフォールディング、凝集、分解のリスクが高くなります。理想的には、FSECトレースを比較するサンプルは、可溶化ステップ後同じ時間でSECカラムを通過させる必要があります。実際には、特にサンプルが単一の列を順番に通過する場合、これは困難ですが、互いに3時間以内に最大5つのSECトレースを収集することは可能であり、この時間枠では大幅な劣化はないはずです。

トラブルシューティング
FSEC実験を行った上で、蛍光シグナルが低いかまったくない場合、目的の膜タンパク質が選択された細胞株を発現していないか、選択された細胞株の発現が非常に低いか、または選択された界面活性剤に可溶化されていない可能性があります。蛍光シグナルを収集してFSECトレースを記録する前にサンプルを希釈した場合、簡単な最初のステップは、SEC画分の希釈率を下げるか、希釈しないことです。それでも解釈可能なFSECトレースが得られない場合は、タンパク質の発現と可溶化を確認する必要があります。

タンパク質発現の分析は、ステップ2.2.2の後にサンプルの蛍光をチェックすることによって達成することができる。このサンプルからの蛍光シグナルが非常に低いかまったくない場合(例えば、バックグラウンドに非常に近いシグナル)、タンパク質発現に問題がある可能性があります。膜タンパク質の発現レベルを改善するためのステップは、代替細胞株への切り替え、増殖条件の調整、発現誘導、誘導/感染/トランスフェクションから回収までの時間などです。しかしながら、特に貧弱なタンパク質発現は、不安定な膜タンパク質を示し、したがって、貧弱な構築物の選択を示す可能性がある。

発現が確認され、FSEC前のバックグラウンドより上に明確な蛍光シグナルがある場合、ステップ2.2.2後のサンプル(総タンパク質)と比較して、ステップ2.4.3後のサンプル(可溶性膜タンパク質)の残りの蛍光シグナルを測定することにより、可溶化効率を確認できます。可溶化効率は20%〜30%であり、膜タンパク質の分析と精製を成功させるのが一般的です。しかしながら、可溶化効率が20%未満の場合、可溶化のための異なる洗浄剤または異なる可溶化条件が必要となることがある。可溶化を改善する試みが成功しない場合、これは膜タンパク質が特に不安定であり、したがって、構築物の選択が不十分であることを示している可能性があります。

非常に遅い溶出ピークがFSECトレース(例えば、18〜24mL)に観察される場合、これは蛍光タンパク質が予想よりもはるかに低いタンパク質分子量を有することを示す。これは、目的の膜タンパク質が分解され、「遊離」GFPが生じることによって引き起こされる可能性があります。ゲル内GFP蛍光を使用して、可溶化の前後にタンパク質が無傷かどうかを確認する必要があります。目的のタンパク質が分解またはタンパク質分解されているように見える場合は、プロテアーゼ阻害剤の量を2倍から4倍に増やすことができます。ただし、可溶化前であってもプロテアーゼまたは分解タンパク質に対する感度が高い場合は、タンパク質が特に不安定であることを示しているため、構築物の選択が不十分である可能性があります。

FSECの変更とさらなる応用
一般に、FSECで使用される蛍光タグは、このプロトコルに記載されているように、GFPまたはeGFPです。しかしながら、多くの異なる蛍光タンパク質タグが利用可能です。使用する蛍光タグの選択は、選択した蛍光タグの蛍光シグナルを記録するための正しい励起および発光パラメータを達成できるプレートリーダーと、さまざまな環境条件で量子収率にほとんどまたはまったく変化のない蛍光色素を備えているかどうかによって異なります。さらに、FSECは蛍光タンパク質に限定されず、蛍光色素で標識されたタンパク質でも同様に機能します。例えば、ヒスチジンタグ付き膜タンパク質構築物に良好に結合するNTA色素を使用することができ、これは好ましい。さらに、蛍光色素で化学的に標識され、目的の膜タンパク質に特異的に結合する蛍光標識抗体、または膜タンパク質構築物に含まれる精製タグのいずれかが、FSECの標的を間接的に標識する可能性があります。

FSECを使用して界面活性剤スクリーニングを行う場合、SECカラムの実行に使用するバッファーに、タンパク質が可溶化された一致する界面活性剤を含めるか、すべての分析で標準界面活性剤を使用するかを選択できます。タンパク質の挙動のより正確な表現は、実験全体が全体を通して一致する界面活性剤で実行される場合に得られます。ただし、各分析を実行する前にカラムを新しい界面活性剤で再平衡化する必要がある場合、時間がかかり、洗浄剤の無駄になる可能性があります。さらに、洗剤スクリーニングの主な目的は痕跡を比較することであるため、条件が理想的でなくても傾向は痕跡に残ります。したがって、タンパク質を目的の界面活性剤に可溶化し、カラムをすべての分析(DDMなど)¹¹にわたって単一の界面活性剤を含む標準バッファー中で分析するという妥協点に達することができ、時間と界面活性剤の消耗品を節約できます。

使用するFLPC機器を変更することにより、FSECプロトコルのスループットを大幅に向上させることができ、サンプル要件を最小限に抑えることができます。例えば、FPLCまたはHPLCシステムには、オートサンプラー、より小さなベッド容量分析カラム(3.2 mL分析SECカラムなど)、およびカラムから直接連続FSECトレースをモニタリングするためのインライン蛍光検出器を装備することができます。結果として得られるセットアップにより、より多くのFSEC実行をより短い期間で実行でき、手動プロットステップが不要になるため、より短い時間枠でより多くの条件をテストできます。さらに、実行ごとに準備してFSECカラムにロードする必要があるサンプルが少なくなるため、サンプル要件がさらに削減されます。これにより、分析に必要な材料がほとんどないため、発現培養をプレートベースのフォーマットに縮小する可能性が開かれます。

他の方法と比較したFSECの長所と短所
FSECの欠点は、蛍光標識を導入するように膜タンパク質構築物を設計する必要があり、導入時に標識の配置が目的の膜タンパク質の機能または折り畳みを妨げる可能性がわずかにあることです。さらに、ここで説明するように、FSECプロトコルは、タンパク質の粗混合物である細胞溶解物の存在下で膜タンパク質の特性をモニターします。この環境における膜蛋白質の挙動は、他の蛋白質から完全に単離された場合に、精製の最後に目的の膜蛋白質を分取SECカラムにかける場合とは異なる可能性があります。さらに、FSECはタンパク質品質のある程度定性的な尺度を提供します。しかしながら、プロトコルのステップ4.3.3に記載されているように、FSECトレースを単分散指数に変換することによって、タンパク質品質の定量的測定値を得ることができる。

FSECは、膜タンパク質構築物、可溶化条件、および精製バッファー組成の早期分析に使用できる唯一の方法ではありません。代替アプローチには、FSECに比べて長所と短所の両方があります。例えば、蛍光色素ベースの熱安定性アッセイが存在し、特に色素7-ジエチルアミノ-3-(4'-マレイミジルフェニル)-4-メチルクマリン(CPM)の使用があります^16,17。この方法の利点は、タンパク質品質の定性的尺度を提供するFSECとは異なり、熱安定性アッセイが相対融解温度の形で定量的尺度を提供することです。さらに、タンパク質構築物に蛍光タグを導入する必要もない。ただし、FSECと比較した熱安定性アッセイの欠点は、精製タンパク質を使用する必要があること、および折り畳まれたタンパク質中の天然システイン残基の有利な位置に依存するため、アッセイがすべてのタンパク質構築物と互換性がないことです。

FSECおよび蛍光色素ベースの熱安定性アッセイの両方と類似している別の方法は、膜タンパク質の温度感受性を測定するアッセイです。このアッセイでは、タンパク質をさまざまな温度で試し、遠心分離後に溶液中に残っているタンパク質を検出します。この方法における検出は、溶液¹⁸における蛍光、SDS−PAGEゲルバンド¹⁹の蛍光、またはウェスタンブロット²⁰におけるシグナル強度の測定を含む、いくつかの方法で実施されてきた。ただし、これらのアプローチの重大な欠点は、個々の温度ポイントを個別に収集する必要があるため、アッセイが非常に労働集約的であり、結果に高ノイズが発生しやすいことです。

最後に、いくつかのより高度な生物物理学的手法を使用して、FSECと同様の方法で膜タンパク質の品質を評価することができます、例えば、流動誘起分散分析²¹、マイクロスケール熱泳動²²、またはSPR。非常に強力なアプローチですが、これらの方法の欠点は、分析を実行するために高度に専門化された機器が必要なことです。

結論として、FSECは膜タンパク質生産キャンペーンで使用するための非常に貴重なツールを提供し、それが唯一の選択肢ではありませんが、上記のように、他の方法に比べていくつかの明確な利点があります。直交アッセイによる結果の交差検証は常に推奨されており、上記の方法はいずれも相互に排他的ではありません。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL and 5 mL plastic syringes	Generic	-	Syringes for transfer of samples
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail	Abcam	ab201111	Protease inhibitors
15 mL tubes	Generic	-	15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation
2 mL ultra-centrifuge tubes	Beckman Coulter	344625	Tubes for ultra-centrifuge rotor
50 mL tubes	Generic	-	50 mL tubes for cell harvest
96 deep-well blocks	Greiner	15922302	For collecting 0.2 mL SEC fractions
ÄKTA  V9-L loop valve	Cytiva	29011358	5 posiiton loop valve  for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA F9-C fraction collector	Cytiva	29027743	6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC system for running the experiment
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)	Fisher Scientific	15828722	Centrifuge for low-speed spin
Blunt end filling needles	Generic	-	For transfer of samples
Bottle top vacuum filter	Corning	10005490	Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers
Cholesteryl hemisuccinate (CHS)	Generon	CH210-5GM	Additive for detergent solubilisation
Disposable multichannel reseviour	Generic	-	Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate
Dodecyl maltoside (DDM)	Glycon	D97002-C-25g	Detergent for solubilisation
eGFP protein standards	BioVision	K815-100	eGFP standards for fluorescent calibration curve
Glycerol	Thermo Scientific	11443297	Glycerol for buffer preparation
HEPES	Thermo Scientific	10411451	HEPES for buffer preparation
High molecular weight SEC calibration standards kit	Cytiva	28403842	Molecular weight calibration kit for SEC
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)	Generon	NB-19-0055-5G	Detergent for solubilisation
Low molecular  weight SEC calibration standards kit	Cytiva	28403841	Molecular weight calibration kit for SEC
MLA-130 ultra-centrifuge rotor	Beckman Coulter	367114	Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate	Corning	10656853	96-well for reading fluorescent signal in plate reader
Optima MAX-XP ultra-centrifuge	Beckman Coulter	393315	Centrifuge for high-speed spin
pH meter	Generic	-	For adjusting the pH of buffers during preparation
Prism	GraphPad	-	Graphing software for plotting traces
Rotary mixer	Fisher Scientific	12027144	Mixer for end over end mixing in the cold
Sodium chloride	Fisher Scientific	10316943	Sodium chloride for buffer preparation
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	10488790	Sodium hydroxide for buffer preparation
Spectramax ID3 Plate Reader	Molecular Devices	735-0391	Micro-plate reader capable of reading fluorescence
Stirrer plate	Generic	-	For stirring buffers during preparation
Styrene maleic acid (SMA)	Orbiscope	SMALP 300	Polymer for detergent free extraction
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	28990944	SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.
Vacuum pump	Sartorius	16694-2-50-06	For filtering and degassing buffers