Avaliação Rápida da Qualidade de Proteínas de Membrana por Cromatografia de Exclusão de Tamanho Fluorescente

Resumo

O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de cromatografia fluorescente de exclusão por tamanho (FSEC) em proteínas de membrana para avaliar sua qualidade para análise funcional e estrutural a jusante. Resultados representativos de FSEC coletados para vários receptores acoplados à proteína G (GPCRs) em condições solubilizadas e livres de detergente são apresentados.

Resumo

Durante a elucidação estrutural de proteínas de membrana e caracterização biofísica, é comum testar inúmeras construções proteicas contendo diferentes tags, truncamentos, deleções, inserções de parceiros de fusão e mutações estabilizadoras para encontrar uma que não seja agregada após a extração da membrana. Além disso, a triagem tampão para determinar o detergente, aditivo, ligante ou polímero que fornece a condição mais estabilizadora para a proteína de membrana é uma prática importante. A caracterização precoce da qualidade de proteínas de membrana por cromatografia fluorescente de exclusão de tamanho fornece uma ferramenta poderosa para avaliar e classificar diferentes construções ou condições sem a necessidade de purificação de proteínas, e essa ferramenta também minimiza a necessidade de amostra. As proteínas de membrana devem ser marcadas fluorescentemente, geralmente expressando-as com uma etiqueta GFP ou similar. A proteína pode ser solubilizada diretamente de células inteiras e depois clarificada cruamente por centrifugação; Posteriormente, a proteína é passada por uma coluna de exclusão de tamanho, e um traço fluorescente é coletado. Aqui, um método para executar FSEC e dados representativos de FSEC sobre os alvos GPCR receptor de esfingosina-1-fosfato (S1PR₁) e receptor de serotonina (5HT_2AR) são apresentados.

Introdução

A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), também conhecida como cromatografia de filtração em gel, é comumente usada na ciência de proteínas¹. Durante a SEC, as proteínas são separadas com base em seu raio hidrodinâmico, que é uma função do tamanho e da forma^{da proteína 2}. Em resumo, essa separação é obtida aplicando-se as amostras de proteína sob fluxo em um leito embalado de esferas porosas que atuam como uma peneira molecular. As esferas utilizadas são frequentemente agarose reticuladas com uma gama definida de tamanhos de poros para permitir que as proteínas entrem ou sejam excluídas dos poros das esferas 3,4,5,6,7. Proteínas com raios hidrodinâmicos menores passam uma proporção maior de tempo dentro dos poros e, portanto, fluem através do leito empacotado a uma taxa mais lenta, enquanto proteínas maiores passam uma proporção maior de tempo fora das esferas (o volume excluído) e se movem através do leito empacotado em um ritmo mais rápido. SEC pode ser usado como uma etapa de purificação de proteínas quando uma coluna preparativa é usada¹. Quando uma coluna analítica é usada, SEC pode ser usado para analisar a qualidade e as propriedades da proteína². Por exemplo, agregados proteicos que podem estar presentes em uma amostra e indicam proteína de má qualidade tendem a ser muito grandes, o que significa que eles só viajam no volume excluído e, portanto, são eluídos da coluna no ponto mais inicial; Este volume é referido como o volume vazio ou vazio da coluna. Além disso, padrões de peso molecular podem ser usados para calibrar a coluna, permitindo que uma massa molecular estimada da proteína de interesse seja interpolada a partir de uma curva padrão.

Normalmente, a absorbância da proteína a 280 nm é usada para monitorar a eluição da proteína a partir de uma coluna de exclusão de tamanho. Isso restringe o uso de SEC como uma ferramenta de análise até que a proteína de interesse esteja amplamente livre de proteínas contaminantes, por exemplo, na última etapa da purificação da proteína. No entanto, a SEC fluorescente (FSEC) utiliza uma proteína de interesse que é marcada fluorescentemente. Portanto, um sinal fluorescente pode ser usado para monitorar especificamente a eluição da proteína de interesse na presença de outras proteínas ou mesmo misturas brutas ^8,9. Além disso, como os sinais fluorescentes são altamente sensíveis, análises bem-sucedidas podem ser realizadas em amostras com quantidades extremamente baixas de proteína. A proteína de interesse é frequentemente marcada fluorescentemente pela inclusão de uma proteína fluorescente verde (GFP) ou etiqueta GFP melhorada (eGFP) na construção da expressão. O sinal fluorescente pode então ser monitorado por excitação a 395 nm ou 488 nm e detecção da emissão fluorescente a 509 nm ou 507 nm para GFP ou eGFP, respectivamente¹⁰.

O benefício de usar um sinal fluorescente para monitorar a eluição de proteínas de uma coluna SEC torna o FSEC uma ferramenta valiosa para analisar amostras de proteínas de membrana quando os níveis de expressão são particularmente pobres em comparação com proteínas solúveis. Crucialmente, a qualidade e as propriedades das proteínas de membrana podem ser analisadas diretamente após a solubilização a partir de lisados brutos, sem a necessidade de otimizar primeiro o processo de purificação^11,12. Por essas razões, o FSEC pode ser usado para analisar rapidamente a qualidade da proteína de membrana enquanto explora os diferentes fatores que podem ser necessários para melhorar o comportamento da proteína de membrana em solução. Por exemplo, é comum testar vários construtos contendo diferentes tags, truncamentos, deleções, inserções de parceiros de fusão e mutações estabilizadoras para encontrar um que não seja agregado após a extração da membrana^13,14. Além disso, a triagem tampão para determinar o detergente, aditivo, ligante ou polímero que fornece a condição mais estabilizadora para a proteína de membrana pode definir a melhor composição tampão para purificação da proteína ou para fornecer estabilidade para usos a jusante, como ensaios biofísicos ou caracterização estrutural.

Assim, o objetivo geral do método FSEC é coletar um perfil de eluição da coluna SEC para uma proteína de membrana alvo de interesse. Além disso, como a fluorescência é usada, esse traço SEC é coletado no ponto mais cedo possível na otimização das construções e condições antes de qualquer purificação prolongada. O traço de FSEC pode ser usado como uma ferramenta comparativa para julgar a probabilidade de sucesso da purificação de uma proteína de membrana com diferentes condições de tampão ou construções de proteínas de membrana. Desta forma, a coleta de perfis FSEC pode ser usada como um processo iterativo rápido para chegar ao projeto de construção ideal e à composição do buffer antes de gastar esforço gerando as quantidades de proteína pura necessárias para outros métodos de análise.

Protocolo

1. Detergente e preparação tampão para FSEC

1. Prepare uma solução de estoque de detergente.
   1. Para preparar uma solução-mãe de 20 mL, pesar 4 g de dodecil maltosídeo (DDM) em pó e 0,4 g de colesterol hemisuccinato (CHS) em pó e chegar a 20 mL com H₂O destilado de grau laboratorial.
   2. Depois de adicionar todos os componentes, misturar com inversão end-over-end a 4 °C até que os componentes estejam completamente solubilizados. Recomenda-se a mistura de ponta a ponta durante a noite a 4 °C.
   3. Aliquot e conservar as existências de detergente a -20 °C até à utilização. Se o estoque precisar ser usado imediatamente, armazene o estoque de detergente no gelo.
      NOTA: O estoque padrão de detergente utilizado neste trabalho foi uma mistura de 20% (p/v) de DDM e 2% (p/v) de CHS (ver Tabela de Materiais). Diferentes detergentes podem ser usados (por exemplo, lauril maltose neopentilglicol; LMNG), ou o uso de extração livre de detergente com polímeros como o ácido estireno-maleico (SMA) pode ser testado. Isso precisa ser decidido ao projetar as condições experimentais a serem testadas.
2. Prepare um tampão de solubilização.
   1. Prepare um tampão de solubilização combinando o peso ou volume correto dos componentes para atingir uma concentração final de 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glicerol e 1x cocktail inibidor de protease (ver Tabela de Materiais) num copo.
      NOTA: No presente estudo, a preparação de 50 mL de tampão de solubilização foi suficiente para o processamento de cinco amostras.
   2. Adicione um volume de 0,7 (por exemplo, 35 mL se fizer 50 mL de tampão) de H₂O destilado de grau laboratorial ao copo.
   3. Misture em um agitador magnético e, usando um medidor de pH, ajuste o pH do tampão para 7,5 pela adição gota a gota de NaOH concentrado.
   4. Usando um cilindro de medição, completar o tampão até o volume final necessário com H₂O destilado de grau laboratorial.
3. Prepare o buffer de execução do SEC.
   1. Prepare o tampão de funcionamento SEC combinando o peso ou volume correto dos componentes para atingir uma concentração final de 100 mM HEPES, 150 mM NaCl e 10% (v/v) de glicerol em um béquer.
      NOTA: No presente estudo, o preparo de 600 mL de tampão SEC foi suficiente para a execução de cinco amostras.
   2. Adicione um volume de 0,7 (por exemplo, 420 mL se fizer 600 mL de tampão) de H₂O destilado de grau laboratorial ao copo.
   3. Misture em um agitador magnético e, usando um medidor de pH, ajuste o pH do tampão para 7,5 pela adição gota a gota de NaOH concentrado.
   4. Usando um cilindro de medição, completar o tampão até o volume final necessário com H₂O destilado de grau laboratorial.
   5. Filtre o tampão SEC através de um filtro de poros de 0,45 μm sob vácuo (consulte a Tabela de Materiais).
   6. Uma vez que o tampão tenha passado pelo filtro, desgaseie-o, deixando-o sob o vácuo até que não apareçam mais bolhas quando agitado.
   7. Adicione uma concentração final de 0,03% (p/v) de DDM e 0,003% (p/v) de CHS ao tampão SEC adicionando o volume necessário do estoque de detergente preparado na etapa 1 (por exemplo, 0,9 mL se fizer 600 mL de tampão SEC).
   8. Pré-resfriar o tampão antes de usar.
      Observação : buffers diferentes podem ser usados dependendo das condições testadas. Por exemplo, se testar o efeito de diferentes detergentes sobre a proteína de interesse, idealmente seria necessário fazer um tampão com o mesmo detergente usado para solubilizar a proteína. Se testar condições livres de detergente com SMA, o detergente deve ser omitido completamente do tampão SEC. No entanto, consulte a seção de discussão para obter mais detalhes sobre as modificações de protocolo para triagem de detergente.

2. Preparação da amostra para FSEC

1. Prepare os pellets de células.
   NOTA: O ponto de partida para o ensaio é a colheita do pellet celular de uma cultura de expressão celular em suspensão da proteína marcada com GFP (ou outra marcada fluorescentemente) de interesse. Os tempos exatos e as condições para a colheita dependerão da proteína que está sendo expressa, da linhagem celular que está sendo usada, das condições em que as células que foram cultivadas e do método pelo qual a expressão proteica foi induzida. Esses detalhes estão além do escopo deste protocolo. Neste estudo, 0,5-1 g de pastilha de células Sf21 foi usado por condição a ser testada, correspondendo a 25-50 mL de cultura 2-3 dias após a infecção com aproximadamente 4 x 10⁶ células viáveis/mL de uma diluição 1:20 do baculovírus P2. Observe que o protocolo descrito aqui foi testado e encontrado para funcionar igualmente bem com pesos úmidos semelhantes de pellets de células de outras linhagens de células eucarióticas (por exemplo, HEK293E).
   1. Quando as células das culturas em suspensão estiverem prontas para a colheita, transferir alíquotas de cultura de 25-50 mL para tubos cônicos de 50 mL.
   2. Contrabalanceie os tubos e use uma centrífuga de bancada em um balde oscilante (consulte Tabela de Materiais) a 2.000 x g por 15 min à temperatura ambiente para peletizar as células.
   3. Remova e descarte o sobrenadante de cultura inclinando-o suavemente, ou use uma pipeta de 50 mL com um enchimento de pipeta se o pellet de célula estiver particularmente solto.
   4. Se as células forem usadas imediatamente para análise, coloque o pellet de células no gelo e prossiga diretamente para a etapa 5. Se as células forem guardadas para utilização numa fase posterior, congele-as colocando-as a -80 °C.
   5. Se o pellet de células tiver sido armazenado a -80 °C, descongele-o rapidamente, incubando-o à temperatura ambiente durante 15 minutos ou até que a amostra deixe de estar congelada. Mova a amostra imediatamente para o gelo após esta etapa.
2. Ressuspender e solubilizar a amostra.
   1. Adicionar 2 ml do tampão de solubilização (passo 1.2) ao pellet de células.
   2. Incubar com inversão término-sobre-terminal a 4 °C durante 15-30 min até ficar homogénea.
   3. Adicionar caldo de detergente pré-misturado (passo 1.1) (por exemplo, 100 μL de 20% DDM/2% CHS) para uma concentração final de 1% DDM/0,1% CHS.
   4. Solubilizar durante 30 minutos com inversão término-sobre-extremidade a 4 °C.
      NOTA: Se desejável, várias condições podem ser testadas em paralelo. O número de amostras paralelas que podem ser processadas de uma só vez dependerá do sistema disponível para executar o experimento SEC. Na configuração descrita aqui, foi possível processar até cinco amostras por vez.
3. Execute uma etapa de centrifugação de baixa velocidade.
   1. Centrifugar a amostra numa centrífuga de bancada pré-refrigerada (4 °C) numa caçamba oscilante a 2.000 x g durante 15 minutos.
4. Execute uma etapa de centrifugação de alta velocidade.
   1. Transfira cuidadosamente o sobrenadante da centrifugação de baixa velocidade para tubos de ultracentrifugação (por exemplo, tubos de 0,5-2 mL) usando uma agulha romba acoplada a uma seringa de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar o pellet a partir do giro de baixa velocidade.
   2. Equilibre pares de tubos até 0,05 g e coloque-os em um rotor de ultracentrifugação de ângulo fixo (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Centrifugar a 4 °C por 30 min a 250.000 x g.

3. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)

1. Prepare o sistema de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e equilibre a coluna.
   1. Prepare o sistema seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais), por exemplo, enchendo o sistema com tampão SEC e purgando as bombas de ar.
   2. Conecte a coluna SEC ao FPLC, garantindo que nenhum ar entre na coluna. Isso é feito aplicando contrapressão na coluna SEC com uma seringa cheia de água (presa à parte inferior da coluna) para realizar uma conexão gota-a-gota com o caminho de fluxo do sistema FPLC.
   3. Pré-equilibre a coluna SEC lavando-a primeiro em volumes de 1,5 coluna (36 mL para uma coluna de 24 mL) de H₂O destilado e filtrado de grau laboratorial, seguido por volumes de 1,5 coluna de tampão SEC na taxa de fluxo e pressão recomendadas para a coluna (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: O sistema FPLC utilizado neste estudo para a realização do FSEC estava em ambiente frio e possuía uma válvula de laço de cinco posições e um coletor de fração de placa de seis posições instalados. Essa configuração permite que cinco amostras sejam carregadas e executadas sequencialmente na mesma coluna de forma automatizada sem a necessidade de intervenção manual entre as execuções. Para a execução dos experimentos de SEC, foi utilizada uma coluna de 24 mL pré-embalada comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais), que continha uma resina que permitia a resolução de proteínas na faixa de peso molecular de 10-600 kDa. Se a proteína de interesse for particularmente grande, uma matriz de coluna alternativa poderia ser usada em seu lugar, permitindo a separação de proteínas de até 5.000 kDa em peso molecular. Observe que a presença de micela de detergente/lipídio aumentará o tamanho total da proteína de membrana em >150 kDa, dependendo da proteína e do detergente usados.
2. Aplique o exemplo à coluna e execute o experimento SEC.
   1. Transfira o sobrenadante da etapa de centrifugação de alta velocidade para uma seringa de 1 mL usando uma agulha romba conectada à seringa. Isso permite a recuperação da amostra do tubo da centrífuga sem perturbar o pellet.
   2. Defina o loop de amostra para carregar. Encher um ciclo de amostra de 500 μL injetando 600-700 μL da amostra da seringa na porta de carregamento. Dependendo do sistema usado, essa etapa de carregamento pode ser programada no método para garantir que nenhum erro seja cometido.
   3. Durante o método, injectar a amostra do laço na coluna esvaziando-a com 4 ml de tampão SEC ao caudal e pressão recomendados para a coluna (ver Tabela de Materiais).
   4. Execute a coluna na mesma taxa de fluxo até que 1,5 volumes de coluna (36 mL para uma coluna de 24 mL) do buffer tenham passado.
   5. A 0,25 do volume da coluna (6 mL para uma coluna de 24 mL), comece a coletar frações de 0,2 mL para coletar 90 frações.
      NOTA: Como o volume vazio da coluna é esperado para ser 0,3 volumes de coluna, iniciar a coleta de frações imediatamente antes disso garante que a eluição de toda a proteína é monitorada, incluindo qualquer proteína presente no volume vazio.

4. Coleta e análise de traços fluorescentes

1. Transfira as amostras do coletor de frações (passo 3.2.5) para uma placa de 96 poços e leia o sinal fluorescente.
   1. Antes de fazer uma leitura de fluorescência, dilua as amostras coletadas. Usando uma pipeta multicanal, transfira 90 μL de H₂O destilado de grau laboratorial de um reservatório para cada poço de uma placa de fundo plano opaco de 96 poços (ver Tabela de Materiais).
   2. Se as frações foram coletadas em um bloco de 96 poços durante a etapa 3.2.5, use uma pipeta multicanal para transferir 10 μL das frações SEC do bloco para a placa de fundo plano opaco de 96 poços e misture pipetando para cima e para baixo. Caso contrário, se as frações SEC foram coletadas em tubos individuais durante a etapa 3.2.5, transfira 10 μL de cada fração para a placa de fundo plano opaco de 96 poços, uma a uma, pipetando para cima e para baixo cada vez para misturar as amostras.
   3. Coloque a placa de fundo plano opaco de 96 poços no leitor de placas e meça a fluorescência. Se GFP for a etiqueta fluorescente (usada aqui), defina a excitação o mais próximo possível de 488 nm, e detecte a emissão fluorescente o mais próximo possível de 507 nm.
      NOTA: A diluição necessária antes de fazer a leitura de fluorescência dependerá da quantidade total de proteína de interesse presente na cultura de expressão e da sensibilidade do leitor de placas que está sendo usado. Nos exemplos apresentados neste estudo, as amostras foram diluídas 10 vezes em água. Como sugestão para um ponto de partida, as frações devem ser diluídas 5-10 vezes em água ou tampão antes da detecção. Se o sinal de traço FSEC registado for particularmente baixo, podem ser utilizadas diluições mais pequenas ou mesmo uma amostra não diluída. O dispositivo utilizado para detecção neste estudo foi um leitor de placas capaz de excitar a 488 nm e detectar emissão fluorescente a 507 nm (ver Tabela de Materiais).
2. Plotar os traços do FSEC.
   1. Exporte os dados do leitor de chapas em um formato bruto (texto bruto ou um arquivo de valores separados por vírgula). Esses dados brutos serão plotados no eixo Y do rastreamento do FSEC.
   2. Para o eixo X, calcule o volume em que cada fração foi coletada. O primeiro poço precisa ser o volume de eluição no qual a primeira fração foi coletada para explicar o atraso de fracionamento (6 mL neste exemplo). As frações posteriores devem aumentar sequencialmente pelo volume da fração coletada (0,2 mL neste exemplo).
   3. Uma vez que os dados dos eixos X e Y tenham sido calculados, copie e cole os dados no software gráfico (veja Tabela de Materiais) para plotar o sinal fluorescente em cada poço contra o volume em que ele eluíu da coluna.
      NOTA: A Figura 1 mostra uma representação esquemática das etapas necessárias para executar um experimento do FSEC.
3. Analise os traços do FSEC.
   1. Avaliar a quantidade de eluição de proteína no volume vazio (aproximadamente 8 mL para uma coluna de 24 mL), o que indica que a proteína é muito grande em tamanho e é provavelmente desdobrada/agregada.
   2. Avalie a quantidade de proteína eluída em quaisquer picos posteriores, que indicam proteína dobrada. Espera-se que seja entre 10 mL e 16 mL para uma coluna de 24 mL, dependendo do tamanho da proteína (quando associada a uma micela detergente/lipídica). Preste muita atenção à forma do pico, particularmente se for um pico largo ou dividido que abranja mais de 3-4 mL (para uma coluna de 24 mL), pois isso indica uma amostra polidispersa.
   3. Calcule a razão entre a altura do pico monomérico e a altura do pico do vazio dividindo o sinal máximo registrado no pico do monômero pelo sinal máximo no pico do vazio.
      NOTA: Este valor representa o índice de monodispersidade e permite uma medida quantitativa da qualidade da proteína; Valores maiores indicam a melhor qualidade possível, enquanto valores abaixo de 1 indicam amostras problemáticas, pois possuem mais proteína agregada do que proteína dobrada.
   4. Se várias execuções FSEC devem ser comparadas e a característica mais importante é a quantidade de monômero em cada caso, plote os traços como o sinal bruto registrado pelo leitor de placas (por exemplo, RFU).
      NOTA: Se uma comparação da quantidade de monômero em comparação com a proteína desdobrada é mais importante, o sinal deve ser normalizado para uma porcentagem do sinal total usando as leituras mínima e máxima no traço, o que acentuará as diferenças na razão entre proteína agregada e monomérica entre os traços.

Figura 1: Representação esquemática das etapas necessárias para executar um experimento FSEC. (1) As células que expressam a proteína fluorescentemente marcada de interesse são solubilizadas. (2) A solubilização bruta é clarificada primeiro com um spin de baixa velocidade, seguido por (3) um spin de alta velocidade. (4) O sobrenadante da amostra clarificada é carregado e executado numa coluna SEC apropriada e (5) as fracções são recolhidas. (6) Amostras das frações são transferidas para uma placa de 96 poços, e um sinal fluorescente de GFP é detectado usando um leitor de placas para (7) plotar o traçado de FSEC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Primeiro, a faixa dinâmica e os limites inferiores de detecção de eGFP para o leitor de placas usado neste estudo foram investigados. Um padrão purificado de eGFP de concentração conhecida foi diluído em um volume final de 50 μL para 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL⁻1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 ng·μL−1 e 0,390625 ng·μL⁻¹, e a fluorescência foi lida usando uma excitação de 488 nm e uma emissão de 507 nm (Figura 2 ). Este experimento indicou que o leitor de placas tinha um limite de detecção inferior de 30 ng de proteína marcada com eGFP por poço e uma faixa dinâmica de até 500 ng de proteína marcada com eGFP por poço antes da saturação do sinal. Usando o valor para o limite inferior e supondo que a eluição da proteína está confinada a 0,33 do volume da coluna, apenas 1,28 μg de proteína marcada com eGFP de interesse é necessária para o carregamento da coluna SEC para que um sinal FSEC detectável seja observado.

Figura 2: Curva padrão da GFPe. Gráfico de dispersão do sinal fluorescente para o padrão purificado eGFP diluído em 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 e 0,390625 ng·μL⁻¹. (A) Todas as diluições são exibidas, incluindo aquelas com o sinal saturado. (B) Um gráfico de dispersão ampliado incluindo apenas os padrões que se enquadram na faixa dinâmica do leitor de placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em segundo lugar, a coluna de 24 mL utilizada para este estudo foi calibrada com padrões de peso molecular. Usando as mesmas condições de tampão e funcionamento utilizadas para a análise de FSEC, os padrões de peso molecular blue dextran (>2.000 kDa), ferritin (440 kDa), aldolase (158 kDa), conalbumina (75 kDa) e ovalbumina (43 kDa) foram injetados individualmente e percorridos através da coluna, e traços de eluição foram coletados na absorção de 280 nm. Os volumes de eluição registrados foram 8,9 mL, 12,4 mL, 15,2 mL, 16,9 mL e 18 mL, respectivamente. Quando esses volumes de eluição foram convertidos em K_av (Equação 1) e plotados contra pesos moleculares logarítmicos, uma curva padrão pôde ser ajustada. Isso permitiu estimar o peso molecular dos GPCRs testados neste estudo por interpolação da curva padrão (Figura 3). Por exemplo, o traço FSEC do receptor de serotonina GPCR 2A (5HT_2AR) após solubilização no detergente DDM indicou um volume de eluição de 13,4 mL. Este volume de eluição de 5HT_2AR situa-se entre os volumes de eluição registados para ferritina e aldolase e fornece um peso molecular estimado de aproximadamente 300 kDa. O construto 5HT 2A R usado neste estudo é de aproximadamente 50 kDa (incluindo a etiqueta eGFP), o que significa que, se 5HT_2AR for assumido como monomérico,₂₅₀kDa de peso molecular poderiam ser atribuídos à micela detergente/lipídica DDM. A equação para a conversão dos volumes de eluição é a seguinte (Equação 1):

(Equação 1)

onde V e é o volume de eluição, V ₀ é o volume vazio da coluna _e V _c é o volume total da coluna.

Figura 3: Curva de calibração da coluna SEC utilizando padrões de peso molecular. (A) Um traço representativo de FSEC de 5HT_2AR solubilizado em DDM, com as posições de eluição relativas dos padrões de peso molecular blue dextran (Void), ferritina, aldolase, conalbumina e ovalbumina marcadas. Ferritina, aldolase, conalbumina e ovalbumina são coloridas em verde, roxo, vermelho e ciano, respectivamente. (B) A curva de calibração da massa molecular utilizando as posições de eluição dos padrões após conversão para K_av (Equação 1) plotada contra o log de massa molecular (M_r). O M_r de 5HT_2AR na DDM foi interpolado a partir da curva usando K_av e é exibido na curva (quadrado azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O FSEC foi então utilizado para avaliar a qualidade e as propriedades do receptor GPCR esfingosina-1-fosfato (S1PR₁)¹⁵. Células de insetos expressando S1PR 1 humano marcado com GFP_foram processadas para FSEC conforme descrito no protocolo (Figura 1).

Primeiramente, as condições ótimas de extração por membrana foram exploradas testando-se os detergentes DDM e LMNG contra a extração livre de detergente com SMA (Figura 4A). O índice de monodispersidade foi usado para avaliar a qualidade da amostra de proteína e a razão entre a proteína no vazio (~8 mL de retenção de coluna) em comparação com a amostra monodispersa (retenção de coluna de 14-15 mL). A amostra solubilizada em LMNG exibiu um perfil FSEC superior com uma melhor forma de pico de monômero e um menor pico de agregado proteico, indicando que a solubilização e purificação em LMNG foram as condições mais estabilizantes para esta proteína de membrana. Em contraste, a amostra solubilizada em DDM apresentou um perfil relativamente mais pobre de FSEC, com um pico agregado maior e um pico monomérico mais amplo, indicando polidispersidade na amostra.

Em segundo lugar, o efeito da adição de ligante no perfil de FSEC foi investigado pela adição de esfingosina-1-fosfato (S1P) à amostra durante a solubilização. Neste caso, a DDM foi usada como reagente de solubilização, e os traços de FSEC de S1PR₁ na presença e ausência de S1P foram comparados (Figura 4B). A amostra solubilizada na presença de S1P apresentou traço FSEC superior com agregação reduzida. Isso indicou que a purificação na presença de um ligante foi vantajosa para melhorar a qualidade da amostra de proteína pela estabilização do receptor em solução, mas também foi vantajosa também como um marcador substituto da atividade proteica, pois os resultados sugeriram que a proteína foi corretamente dobrada e competente para ligação do ligante.

Figura 4: FSEC usando um extrato bruto de S1PR 1 indicando condições ideais de extração de membrana e ligação do ligante. (A) Comparação dos traços de FSEC de S1PR₁ solubilizados em copolímero de ácido estireno-maleico (SMA; azul), lauril maltose neopentilglicol (LMNG; vermelho) ou dodecil maltosídeo (DDM; preto). (B) Comparação dos traços de FSEC de S1PR 1 solubilizados em DDM na presença (vermelho) ou ausência (preto) do agonista esfingosina-1-fosfato (S1P). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O CEFSE também foi utilizado para investigar a estabilidade a longo prazo do 5HT_2AR sob diferentes condições. 5HT 2A R humano marcado com GFP foi solubilizado a partir de membranas celulares de insetos em detergente (DDM) ou polímero_SMAe analisado por FSEC em vários momentos após o armazenamento a 4 °C ou temperatura ambiente (Figura 5). Após vários dias de incubação, 5HT_2AR em DDM exibiu uma queda significativa na altura do pico monomérico em ambas as temperaturas, e aumentos significativos no pico agregado foram observados. Em contraste, 5HT_{2A R em SMA}lipídio partícula (SMALP) não mostrou uma queda significativa na altura do pico monomérico ao longo do experimento, indicando que a proteína em SMALP permaneceu estável por mais tempo, mesmo em temperaturas desfavoráveis. Isso pode ser importante ao considerar preparações proteicas para aplicações biofísicas a jusante, como experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR), para os quais há um requisito para que a amostra seja estável e ativa por um longo período de tempo para a conclusão bem-sucedida dos experimentos de ligação.

Figura 5: Efeito do tempo e da temperatura na qualidade do 5HT 2A R extraído da membrana usando DDM ou SMALP, analisado por FSEC. (A) Traços representativos de FSEC de 5HT_2AR solubilizados em DDM e armazenados à temperatura ambiente por 1 dia (cinza), 2 dias (verde) ou 5 dias (azul). (B) Histogramas da altura normalizada do pico monomérico para amostras DDM armazenadas a 4 °C (azul) ou RT (verde) em comparação com amostras SMALP armazenadas a 4 °C (cinza) ou RT (preto). As barras de erro são representativas do SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

As abordagens sistemáticas genéricas para triagem de condições com FSEC que são apresentadas aqui permitem a rápida otimização dos parâmetros de solubilização e purificação para a produção de proteínas de membrana. Isso significa que proteínas de membrana estáveis e funcionalmente ativas podem ser rapidamente produzidas para estudos biofísicos e estruturais. Além disso, o FSEC pode ser executado usando equipamentos de laboratório que provavelmente já estão em vigor em laboratórios de proteínas de membrana e, portanto, não há exigência para a compra de um instrumento especializado para executar os ensaios.

Etapas críticas
O tempo decorrido entre o ponto de solubilização das células em detergente e o ponto em que a amostra é passada para a coluna SEC (passos 2.1.5-3.2.5) é crítico em termos de tempo, não devendo haver pausas entre estes passos. Todas as etapas devem ser realizadas a 4 °C ou sobre gelo, e o tempo necessário para executar essas etapas deve ser mantido ao mínimo possível. Essas restrições de tempo e temperatura são necessárias para registrar o perfil de FSEC para a proteína de membrana antes de qualquer potencial desdobramento ou degradação. Após a solubilização da proteína de membrana, há maior risco de desdobramento, agregação e degradação, mesmo a 4 °C. Idealmente, quaisquer amostras para as quais os traços de FSEC devem ser comparados devem passar pela coluna SEC no mesmo período de tempo após a etapa de solubilização. Na prática, isso é difícil, especialmente se as amostras forem passadas sequencialmente por uma única coluna, mas é possível coletar até cinco vestígios de SEC dentro de 3 h um do outro e, nesse período de tempo, não deve haver degradação significativa.

Solucionando problemas
Se, ao realizar o experimento com FSEC, houver baixo ou nenhum sinal fluorescente, é possível que a proteína de membrana de interesse não tenha expressado a linhagem celular escolhida, tenha expressão muito baixa da linhagem celular escolhida ou não tenha sido solubilizada no detergente escolhido. Se as amostras fossem diluídas antes de coletar o sinal de fluorescência e registrar o traço de FESEC, um primeiro passo simples seria tentar uma diluição menor ou nenhuma diluição das frações SEC. Se isso ainda não produzir um traço de FSEC interpretável, a expressão e a solubilização da proteína devem ser verificadas.

A análise da expressão proteica pode ser obtida através da verificação da fluorescência da amostra após a etapa 2.2.2. Se houver um sinal fluorescente muito baixo ou nenhum dessa amostra (por exemplo, um sinal muito próximo ao fundo), provavelmente há um problema com a expressão da proteína. Podem ser tomadas medidas para melhorar os níveis de expressão da proteína de membrana, tais como mudar para uma linhagem celular alternativa ou ajustar as condições de crescimento, a indução da expressão e o tempo entre a indução/infecção/transfecção e a colheita. No entanto, a expressão proteica particularmente pobre pode indicar uma proteína de membrana instável e, portanto, uma má escolha de construto.

Se a expressão tiver sido verificada e houver um sinal fluorescente claro acima do fundo antes da FSEC, a eficiência de solubilização pode ser verificada medindo o sinal fluorescente restante da amostra após a etapa 2.4.3 (proteína solúvel de membrana) em comparação com a amostra após a etapa 2.2.2 (proteína total). É comum que a eficiência de solubilização seja de 20%-30% e ainda permita a análise e purificação bem-sucedidas da proteína de membrana. No entanto, se a eficiência de solubilização for inferior a 20%, um detergente diferente para solubilização ou condições de solubilização diferentes podem ser necessárias. Se as tentativas de melhorar a solubilização não forem bem-sucedidas, isso pode indicar uma proteína de membrana particularmente instável e, portanto, uma má escolha de construto.

Se um pico de eluição muito tardio for observado no traço de FSEC (por exemplo, 18-24 mL), isso indica que a proteína fluorescente tem um peso molecular da proteína muito menor do que o esperado. Isso pode ser causado pela degradação da proteína de membrana de interesse, resultando em GFP "livre". Deve-se verificar se a proteína está intacta antes e após a solubilização usando fluorescência em gel GFP. Se a proteína de interesse parecer estar se degradando ou sendo proteolisada, a quantidade de inibidor de protease pode ser aumentada de duas a quatro vezes. No entanto, uma alta sensibilidade a proteases ou proteínas degradadas mesmo antes da solubilização pode indicar uma proteína particularmente instável e, portanto, uma escolha de construção pobre.

Modificações e outras aplicações do FSEC
Comumente, o tag fluorescente usado no FSEC é GFP ou eGFP, conforme descrito neste protocolo. No entanto, muitas etiquetas de proteínas fluorescentes diferentes estão disponíveis. A escolha do tag fluorescente a ser utilizado depende de ter um leitor de placas que possa atingir os parâmetros corretos de excitação e emissão para registrar o sinal fluorescente para o tag fluorescente selecionado e ter um fluoróforo com pouca ou nenhuma alteração no rendimento quântico em diferentes condições ambientais. Além disso, o FSEC não se restringe a proteínas fluorescentes, mas também pode funcionar igualmente bem com uma proteína que foi marcada com um corante fluorescente. Por exemplo, um corante NTA poderia ser usado, o que se ligaria favoravelmente a construções de proteínas de membrana marcadas com histidina. Além disso, um anticorpo marcado fluorescentemente quimicamente marcado com um corante fluorescente e específico para ligar a proteína de membrana de interesse ou uma etiqueta de purificação incluída na construção da proteína de membrana poderia indiretamente rotular um alvo para FSEC.

Ao realizar a triagem de detergente usando FSEC, uma escolha pode ser feita sobre se o tampão usado para executar a coluna SEC deve conter o detergente correspondente no qual a proteína foi solubilizada ou se um detergente padrão deve ser usado em todas as corridas. Uma representação mais precisa do comportamento da proteína será obtida se todo o experimento for realizado com o detergente correspondente. No entanto, pode ser demorado e desperdiçar detergente se a coluna tiver de ser reequilibrada num novo detergente antes de cada corrida ser realizada. Além disso, como o principal objetivo da triagem de detergentes é comparar vestígios, as tendências permanecerão nos vestígios, mesmo que as condições não sejam ideais. Assim, pode-se chegar a um compromisso pelo qual a proteína é solubilizada no detergente de interesse, mas a coluna é executada em um tampão padrão com um único detergente em todas as corridas (por exemplo, DDM)¹¹, o que pode economizar tempo e consumíveis de detergente.

Ao modificar o equipamento FLPC usado, a taxa de transferência do protocolo FSEC pode ser significativamente aumentada e a necessidade de amostra pode ser minimizada. Por exemplo, um sistema FPLC ou HPLC poderia ser equipado com um amostrador automático, uma coluna analítica de volume de leito menor (como uma coluna SEC analítica de 3,2 mL) e um detector fluorescente em linha para monitorar traços contínuos de FSEC diretamente da coluna. A configuração resultante permitiria que mais execuções de FSEC fossem realizadas em um período de tempo mais curto e removeria a etapa de plotagem manual, permitindo assim que um maior número de condições fosse testado em um período de tempo mais curto. Além disso, a necessidade de amostras seria ainda mais reduzida, uma vez que menos amostras teriam de ser preparadas e carregadas na coluna FSEC para cada ensaio. Isso abriria possibilidades para reduzir as culturas de expressão a um formato baseado em placas, já que tão pouco material seria necessário para a análise.

Pontos fortes e fracos do FSEC em comparação com outros métodos
Uma desvantagem do FSEC é que as construções de proteínas de membrana precisam ser projetadas para introduzir a etiqueta fluorescente e, na introdução, há uma pequena possibilidade de que a colocação do rótulo possa interferir com a função ou dobramento da proteína de membrana de interesse. Além disso, o protocolo FSEC, como descrito aqui, monitora as características de uma proteína de membrana na presença de lisado celular, que é uma mistura bruta de proteínas. O comportamento de uma proteína de membrana neste ambiente pode ser diferente do que quando a proteína de membrana de interesse é submetida a uma coluna de SEC preparativa no final da purificação quando totalmente isolada de outras proteínas. Além disso, o FSEC fornece uma medida qualitativa da qualidade da proteína. No entanto, convertendo o traço de FSEC em um índice de monodispersidade, conforme descrito na etapa 4.3.3 do protocolo, uma medida quantitativa da qualidade da proteína pode ser obtida.

O FSEC não é o único método que pode ser usado na análise inicial de construções de proteínas de membrana, condições de solubilização e composição do tampão de purificação. As abordagens alternativas têm vantagens e desvantagens em relação à FSEC. Por exemplo, existem ensaios de termoestabilidade à base de fluoróforos, particularmente o uso do corante 7-dietilamino-3-(4′-maleimidilfenil)-4-metilcumarina (CPM)^16,17. A vantagem deste método é que, ao contrário do FSEC, que fornece uma medida qualitativa da qualidade da proteína, os ensaios de termoestabilidade fornecem uma medida quantitativa na forma de uma temperatura relativa de fusão. Além disso, não há necessidade de introduzir uma etiqueta fluorescente na construção da proteína. No entanto, as desvantagens dos ensaios de termoestabilidade em comparação com FSEC são que a proteína purificada deve ser usada e que o ensaio não é compatível com todas as construções proteicas, pois depende das posições vantajosas dos resíduos de cisteína nativa na proteína dobrada.

Outro método que tem semelhanças com os ensaios de termoestabilidade à base de FSEC e fluoróforo é um ensaio que mede a sensibilidade à temperatura de uma proteína de membrana. Neste ensaio, a proteína é desafiada com diferentes temperaturas, e a proteína que permanece em solução após a centrifugação é detectada. A detecção neste método tem sido conduzida de várias maneiras, incluindo a medição da fluorescência em solução¹⁸, a fluorescência de uma banda de gel SDS-PAGE¹⁹, ou a intensidade do sinal em um western blot²⁰. No entanto, uma desvantagem significativa dessas abordagens é que o ensaio é muito trabalhoso e propenso a alto ruído nos resultados, pois cada ponto de temperatura individual deve ser coletado independentemente.

Finalmente, várias técnicas biofísicas mais avançadas podem ser usadas para avaliar a qualidade de proteínas de membrana de maneira semelhante à FSEC, por exemplo, análise de dispersão induzida por fluxo²¹, termoforese em microescala²² ou SPR. Apesar de abordagens muito poderosas, a desvantagem desses métodos é a exigência de instrumentos altamente especializados para executar as análises.

Em conclusão, o FSEC fornece uma ferramenta inestimável para uso em campanhas de produção de proteínas de membrana e, embora não seja a única opção, apresenta várias vantagens distintas sobre outros métodos, como listado acima. A validação cruzada dos resultados por ensaios ortogonais é sempre recomendada, e nenhum dos métodos discutidos acima são mutuamente exclusivos entre si.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL and 5 mL plastic syringes	Generic	-	Syringes for transfer of samples
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail	Abcam	ab201111	Protease inhibitors
15 mL tubes	Generic	-	15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation
2 mL ultra-centrifuge tubes	Beckman Coulter	344625	Tubes for ultra-centrifuge rotor
50 mL tubes	Generic	-	50 mL tubes for cell harvest
96 deep-well blocks	Greiner	15922302	For collecting 0.2 mL SEC fractions
ÄKTA  V9-L loop valve	Cytiva	29011358	5 posiiton loop valve  for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA F9-C fraction collector	Cytiva	29027743	6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC system for running the experiment
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)	Fisher Scientific	15828722	Centrifuge for low-speed spin
Blunt end filling needles	Generic	-	For transfer of samples
Bottle top vacuum filter	Corning	10005490	Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers
Cholesteryl hemisuccinate (CHS)	Generon	CH210-5GM	Additive for detergent solubilisation
Disposable multichannel reseviour	Generic	-	Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate
Dodecyl maltoside (DDM)	Glycon	D97002-C-25g	Detergent for solubilisation
eGFP protein standards	BioVision	K815-100	eGFP standards for fluorescent calibration curve
Glycerol	Thermo Scientific	11443297	Glycerol for buffer preparation
HEPES	Thermo Scientific	10411451	HEPES for buffer preparation
High molecular weight SEC calibration standards kit	Cytiva	28403842	Molecular weight calibration kit for SEC
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)	Generon	NB-19-0055-5G	Detergent for solubilisation
Low molecular  weight SEC calibration standards kit	Cytiva	28403841	Molecular weight calibration kit for SEC
MLA-130 ultra-centrifuge rotor	Beckman Coulter	367114	Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate	Corning	10656853	96-well for reading fluorescent signal in plate reader
Optima MAX-XP ultra-centrifuge	Beckman Coulter	393315	Centrifuge for high-speed spin
pH meter	Generic	-	For adjusting the pH of buffers during preparation
Prism	GraphPad	-	Graphing software for plotting traces
Rotary mixer	Fisher Scientific	12027144	Mixer for end over end mixing in the cold
Sodium chloride	Fisher Scientific	10316943	Sodium chloride for buffer preparation
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	10488790	Sodium hydroxide for buffer preparation
Spectramax ID3 Plate Reader	Molecular Devices	735-0391	Micro-plate reader capable of reading fluorescence
Stirrer plate	Generic	-	For stirring buffers during preparation
Styrene maleic acid (SMA)	Orbiscope	SMALP 300	Polymer for detergent free extraction
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	28990944	SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.
Vacuum pump	Sartorius	16694-2-50-06	For filtering and degassing buffers