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要約

本プロトコルは、茶園のPA産生雑草からの茶サンプル中のピロリジジンアルカロイド(PA)の汚染について説明しています。

要約

有毒なピロリジジンアルカロイド(PA)はお茶のサンプルに含まれており、人間の健康に脅威をもたらします。しかし、茶サンプル中のPA汚染の原因と経路は不明のままです。本研究では、UPLC-MS/MSと組み合わせた吸着剤法を開発し、雑草Ageratum conyzoides L.、A. conyzoides 根粒球土壌、新鮮な茶葉、および乾燥茶サンプル中の15のPAを測定しました。平均回収率は78%〜111%の範囲であり、相対標準偏差は0.33%〜14.8%であった。中国安徽省の金寨茶園から15組のコニゾイデスとコニゾイデスの根圏土壌サンプル60枚を採取し、15個のPAについて分析しました。インターメジン-N-オキシド(ImNO)とセネシオニン(Sn)を除いて、15のPAすべてが新鮮な茶葉で検出されたわけではありません。ImNO(34.7μg/kg)の含有量はSn(9.69μg/kg)よりも多かった。また,ImNOとSnはいずれも茶樹の若葉に集中していたが,その含有量は古い葉では低かった。その結果,茶園ではPA生成雑草-土壌-生茶葉の経路を通って茶類中のPAが移動することが示された。

概要

二次代謝産物として、ピロリジジンアルカロイド(PA)は草食動物、昆虫、および病原体から植物を保護します1,2。これまでに、異なる構造を持つ660を超えるPAおよびPA-N酸化物(PANO)が、世界中の6,000を超える植物種で発見されています3,4。PA生産植物は、主にキク科、ボラギナ科、ブナ科、およびキク科5,6に見られます。PAは不安定なデヒドロピロリジジンアルカロイドに容易に酸化され、強い求電子性を持ち、DNAやタンパク質などの求核剤を攻撃し、肝細胞の壊死、静脈閉塞、肝硬変、腹水、およびその他の症状を引き起こす可能性があります7,8。PA毒性の主な標的器官は肝臓です。PAはまた、肺、腎臓、およびその他の臓器毒性および変異原性、発がん性、および発生毒性を引き起こす可能性があります9,10。

PAを含む伝統的なハーブ、サプリメント、お茶の摂取、または牛乳、蜂蜜、肉などの食品の間接的な汚染(PAを含む放牧の摂取による毒性)から、人間と動物の中毒の症例が多くの国で報告されています11,12,13。欧州食品安全機関(EFSA)の調査結果は、(ハーブ)ティーなどの物質がPA / PANOへの人間の曝露の重要な原因であることを示しています14。茶サンプルはPAを生成しませんが、PA産生植物は茶園で一般的に見られます(例:エミリアソンチフォリア、セネシオアングラタス、およびアゲラタムコニゾイデス)15。以前は、お茶がピッキングおよび加工中に生産工場からのPAで汚染されている可能性があると疑われていました。しかし、PAはいくつかの手摘み茶葉(すなわち、PA生産プラントがない)でも検出され、他の経路または汚染源があるに違いないことを示唆しています16。ラグワート(セネシオ・ジャコバエア)とメリッサ(メリッサ・オフィシナリス)、ペパーミント(ハッカ・ピペリタ)、パセリ(ペトロセリナム・クリスプム)、カモミール(マトリカリア・レキューティタ)、キンレンカ(トロパエオラム・マジュス)の共栽培実験を行い、その結果、これらすべての植物でPAが検出されました17。PAは実際に土壌18,19を介して生きている植物間で移動および交換されることが確認されています。Van Wykら20は、ルイボスティー(Aspalathus linearis)が雑草が豊富な場所でひどく汚染されており、同じ種類と比率のPAを含んでいることを発見しました。しかし、雑草のない場所のルイボスティーからPAは検出されませんでした。

現在、高い選択性と感度を備えた超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(UPLC-MS / MS)は、農産物および食品中のPAの定性的および定量的分析に広く使用されています21,22。サンプル処理方法は通常、固相抽出(SPE)または複雑な食品マトリックス抽出物のQuEChERS(クイックイージーで安価で効果的な頑丈な安全)クリーンアップのいずれかで構成され、可能な限り最高の感度を得ることができます12,19。しかし、土壌、雑草、新鮮な茶葉などの複雑なマトリックス中のPAの検出と定量を可能にする堅牢な分析方法はまだ不足しています。

本研究では、乾燥茶試料、生茶葉、雑草、雑草根圏土壌試料中の15種類のPAを、UPLC-MS/MSと吸着剤精製法を組み合わせて分析した。さらに、中国安徽省金寨茶園の5つのサンプリングサイトから15対の雑草および雑草根圏土壌サンプル15ペアと60生茶葉サンプルを収集し、15のPAについて分析しました。これらの結果は、お茶の品質と安全性を確保するために、お茶のサンプル中のPA(汚染)の発生源と経路に関する調査方法といくつかの情報を提供することができます。

プロトコル

本研究では、次の雑草種が収集されました:Ludwigia prostrata Roxb.、Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke)Bruckn.、Ageratum conyzoides L.、Chenopodium ambrosioides、Trachelospermum jasminoide(L.) Lem.、Ageratum conyzoides L.、Emilia sonchifolia (L.) DC、Ageratum conyzoides L.、およびCrassocephalum crepidioides (ベンス)S.ムーア。生茶葉は龍井43#茶樹の品種から摘み取られ、乾燥茶サンプルは緑茶製造プロセスに従って加工された市販の茶でした(材料表を参照)。

1. サンプル収集

  1. 40個の実際のサンプルを収集します。
    1. 複数の茶園から10個の雑草、10個の土壌、10個の新鮮な茶葉をランダムに収集します。
      注:本研究では、土壌を20cmの深さでサンプル量200gでサンプリングしました。
    2. スーパーマーケットから10個の乾燥茶製品(250 g)をランダムに収集します。
  2. 雑草、土壌、新鮮な茶葉のサンプルを収集して、お茶中のPAの汚染源を調査します。
    1. 同じ茶園に5つのサンプリングポイントを設定し、各ポイントに3つの反復を行います。
    2. 茶園で一般的に見られる最高のPA含有量を持つ Ageratum conyzoides L.雑草サンプルを収集します。
      注:本研究のサンプル量は250gであった。
    3. 土壌サンプルを収集します。
      注:土壌サンプルは、深さ20 cmの A.コニゾイデス根 圏土壌で、サンプル量は200 gでした。
    4. 2枚の葉を持つ1つの芽、3枚の葉を持つ1つの芽、4枚の葉を持つ1つの芽、および成熟した葉を含む、茶樹のさまざまな部分から新鮮な茶葉を収集します。
      注:サンプル量は250gでした。

2.サンプル処理

  1. 以下の手順に従ってサンプルを前処理します。
    1. 乾燥したお茶と土壌のサンプルをグラインダーで粉砕し、粉砕したサンプルを200メッシュのふるいに通し、-20°Cで保管します。
      注:乾燥茶は市販の茶製品( 材料表を参照)であったため、直接粉砕してふるいにかけ、保管しました。土壌試料(200g)を暗所の換気された場所に置き、約1週間風乾した。
    2. 雑草と新鮮な茶葉をホモジナイザーで均質化し、-20°Cで保存します。
  2. 乾燥茶製品、生茶葉、雑草のサンプル処理を行います。
    1. 各サンプル(乾燥茶製品、新鮮な茶葉、雑草)を1.00 g量り、50 mLの遠沈管に入れます。
    2. 10 mLの0.1 mol/L硫酸溶液とボルテックスを固相抽出(SPEカートリッジを使用、 材料表を参照)に2分間、吸着剤精製に1分間加えます。超音波抽出23 を15分間行い、次いで室温で9,390 x g の速度で10分間遠心分離する。
      注:超音波発振器の電力は290W、発振周波数は35kHz、温度は30°Cに設定しました。
    3. 上清をプラスチックチップスポイト付きの50 mL遠沈管に移します。
    4. 上記の手順に従って、抽出を一度繰り返します。2つの上清を混ぜ合わせる。
      1. 5 mLのメタノールと5 mLの脱イオン水でSPEカートリッジをアクティブにします。10 mLの上清を事前にアクティブ化したカートリッジに追加し、サンプルクリーンアップを実行します。
      2. サンプル溶液のレベルがカートリッジの上層に達したら、5 mLの1%ギ酸溶液と5 mLのメタノールで分析種を溶出します。溶出液は廃棄してください。
      3. 5 mLのメタノール(0.5%アンモニア水を含む)で溶出し、溶出液を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過し、UPLC-MS/MSで分析します( 材料表を参照)。
    5. 吸着剤を使用してサンプルクリーンアップを実行します。
      1. 2 mLの上清(ステップ2.2.4)をGCB:PSA:C18(10 mg:20 mg:15 mg、 材料表を参照)の吸着剤で満たされた10 mLの遠沈管に入れ、ボルテックスで1分間、室温で9,390 x g で8分間遠心分離します。
      2. UPLC-MS/MSで分析する前に、1 mLの上清を0.22 μmのメンブレンフィルターに通します。
  3. 土壌サンプルの処理を行います。
    1. 1.00 gの土壌サンプルの重量を量ります。それを50 mLの遠沈管に入れ、0.1 mLの0.1 mol / Lクエン酸三ナトリウム溶液( 材料の表を参照)を加えて、土壌のpH値を6.0に調整します。
    2. 2分間放置し、10mLの0.1mol / L硫酸メタノール溶液を加え、2分間ボルテックスし、30分間振とうしてから、超音波抽出を30分間実行します。
    3. 9,390 x g で10分間遠心分離し、上清をプラスチックチップスポイト付きの50 mL遠沈管に移します。
    4. 上記の手順に従って抽出を繰り返し、上清を2回混ぜ合わせます。
      注:精製方法は、ステップ2.2.5.1およびステップ2.2.5.2と同じでした。

3.機器分析

  1. 市販の UPLC-MS/MS システム (2.1 mm x 100 mm、1.8 μm) を使用して、乾燥茶サンプル、生茶葉、雑草、土壌 (ステップ 2 のサンプル) 中の 15 PA を検出します ( 材料表を参照)。
  2. カラム温度を40°C、流速を0.250 mL/min、注入量を3 μLに設定します。
  3. 移動相A:メタノール(0.1%ギ酸+1mmol/Lギ酸アンモニウム含有)、移動相B:水(0.1%ギ酸+1mmol/Lギ酸アンモニウム含有)をセットします。
  4. グラジエント溶出手順を設定します:0.0分から0.25分まで10%A、0.25分から6.0分まで10%-30%A、6.0分から9.0分まで30%-40%A、9.0分から9.01分まで1.9分間保持された40%-98%A、11.0分から11.1分まで2.9分間保持された98%-100%A。
  5. 質量分析計のパラメータを設定します:イオン化モード、エレクトロスプレー陽イオン源(ESI +)。アトマイザー圧力、7.0バール;毛細管電圧、4.0kV;テーパー穴バックブローフロー、150 L / h;溶媒ガス流量、800 L/h;溶解温度、400°C;衝撃ガス流量、0.25 mL/分。

結果

乾燥茶試料、生茶葉、雑草、土壌中の15 PAの最適化された吸着剤精製および分析方法を確立し、SPEカートリッジを使用した一般的に使用されている精製方法と比較しました。その結果、SPEカートリッジを使用した乾燥茶サンプル、雑草、および新鮮な茶葉中の15のPAの回収率は72%〜120%であり、吸着剤精製を使用した場合の回収率は78%〜98%でした(図1)。吸着剤精製を用いた...

ディスカッション

本研究は、茶類試料中のPAの汚染経路と発生源、および茶樹のさまざまな部分におけるPAの分布を探索するための効果的で高感度な方法を開発するために設計されました。しかし、この研究では、クロマトグラフィーカラムで正常に分離されたPAは15個のみであり、植物種のアルカロイドの数が多いのに比べて非常に少ない数です3,4。これは、カラム...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(32102244)、国家農産物の品質と安全性およびリスク評価プロジェクト(GJFP2021001)、安徽省自然科学財団(19252002)、およびUSDA(HAW05020H)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile (99.9%)Tedia Company,Inc.21115197CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.181210CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%)Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai)G0860050CAS No:540-69-2
Carbon-GCBCNWB7760030120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HKHERMLEZ36HK30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea productLvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchunloose teaGreen tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%)BioCrick323256CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%)BioCrick98222CAS No:570-19-4
Formate (98.0%)AladdinE2022005CAS No:64-18-6
HC-C18CNWD211006040-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%)BioCrick906426CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%)BioCrick22581CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WScence203158000Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 columnWaters186004976ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%)BioCrick114843CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%)BioCrick340066CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%)BioCrick132282048CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%)ChemFacesCFN00461CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%)Tedia Company,Inc.21115100CAS No:67-56-1
PSAAgelaP19-0083340-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%)BioCrick5281743CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%)BioCrick5281734CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%)BioCrick5280906CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%)BioCrick5380876CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%)BioCrick6442619CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%)BioCrick5281750CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)BioCrick5281752CAS No:2318-18-5
SPE PCXAgilent Technologies12108206Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.1003019CAS No:7664-93-9
Trisodium citrateSinpharm Chemical Reagent Co., Ltd.20121009CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleanerSupmileKQ-600BInner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMSWatersZPLYY-003Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillatorGuoyu instrumentSHY-2AHSOscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

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