АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описывается контаминация пирролизидиновыми алкалоидами (ПА) в образцах чая из сорняков, продуцирующих ПА, на чайных плантациях.

Аннотация

В образцах чая обнаружены токсичные пирролизидиновые алкалоиды (ПА), которые представляют угрозу для здоровья человека. Однако источник и путь загрязнения ПА в образцах чая остались неясными. В данной работе был разработан метод адсорбента в сочетании с UPLC-MS/MS для определения 15 PA в корневищной почве сорняков Ageratum conyzoides L., A. conyzoides, свежих чайных листьях и образцах сушеного чая. Среднее выздоровление варьировало от 78% до 111% с относительными стандартными отклонениями 0,33%-14,8%. Пятнадцать пар образцов ризосферной почвы A. conyzoides и A. conyzoides и 60 образцов свежего чайного листа были собраны в чайном саду Цзиньчжай в провинции Аньхой, Китай, и проанализированы на наличие 15 ПА. Не все 15 PA были обнаружены в свежих чайных листьях, за исключением интермедина-N-оксида (ImNO) и сенеционина (Sn). Содержание ImNO (34,7 мкг/кг) было больше, чем Sn (9,69 мкг/кг). Кроме того, и ImNO, и Sn были сосредоточены в молодых листьях чайного растения, в то время как их содержание было ниже в старых листьях. Результаты показали, что ПА в чае переносились по пути сорняков, продуцирующих ПА, почвы и свежих чайных листьев в чайных садах.

Введение

В качестве вторичных метаболитов пирролизидиновые алкалоиды (ПА) защищают растения от травоядных, насекомых и патогенов 1,2. На сегодняшний день более 660 PA и PA-N-оксидов (PANO) с различной структурой были обнаружены в более чем 6,000 видах растений по всему миру 3,4. Растения, продуцирующие ПА, в основном встречаются в семействах Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae и Apocynaceae 5,6. ПА легко окисляются до нестабильных алкалоидов дегидропирролизидина, которые обладают сильной электрофильностью и могут атаковать нуклеофилы, такие как ДНК и белки, что приводит к некрозу клеток печени, венозным окклюзиям, циррозу, асциту и другим симптомам 7,8. Основным органом-мишенью токсичности ПА является печень. ПА также могут вызывать токсичность легких, почек и других органов, а также мутагенную, канцерогенную токсичность и токсичность для развития 9,10.

Во многих странах сообщалось о случаях отравления людей и животных в результате употребления в пищу традиционных трав, добавок или чаев, содержащих ПА, или косвенного загрязнения пищевых продуктов, таких как молоко, мед или мясо (токсичных при употреблении в пищу пастбищ, содержащих ПА)11,12,13. Результаты Европейского агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) указывают на то, что такие вещества, как (травяной) чай, являются важным источником воздействия на человека PA/PANO14. Образцы чая не производят ПА, тогда как растения, продуцирующие ПА, обычно встречаются в чайных садах (например, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus и Ageratum conyzoides)15. Ранее подозревалось, что чай может быть загрязнен PA с заводов-производителей во время сбора и переработки. Тем не менее, ПА также были обнаружены в некоторых собранных вручную чайных листьях (т.е. без растений, продуцирующих ПА), что позволяет предположить, что должны существовать другие пути или источники загрязнения16. Был проведен эксперимент по совместному выращиванию растений полыни (Senecio jacobaea) с мелиссой (Melissa officinalis), мятой перечной (Mentha piperita), петрушкой (Petroselinum crispum), ромашкой (Matricaria recutita) и настурцией (Tropaeolum majus), и результаты показали, что ПА были обнаружены во всех этих растениях17. Было подтверждено, что ПА действительно передаются и обмениваются между живыми растениями через почву18,19. Van Wyk et al.20 обнаружили, что чай ройбуш (Aspalathus linearis) был сильно загрязнен на участках, богатых сорняками, и содержал ПА того же типа и пропорции. Тем не менее, ПА не были обнаружены в чае ройбуш на участках, свободных от сорняков.

В настоящее время тандемная масс-спектрометрия со сверхвысокой эффективностью жидкостной хроматографии (UPLC-MS/MS) с высокой селективностью и чувствительностью широко используется в качественном и количественном анализе ПА в сельскохозяйственной продукции и пищевых продуктах21,22. Метод обработки образцов обычно состоит либо из твердофазной экстракции (SPE), либо из очистки QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) сложных экстрактов пищевых матриц, которые позволяют получить максимально возможную чувствительность12,19. Однако надежные аналитические методы, позволяющие обнаруживать и количественно определять ПА в сложных матрицах, таких как почва, сорняки и свежие чайные листья, по-прежнему отсутствуют.

В этом исследовании было проанализировано 15 ПА в образцах сушеного чая, свежих чайных листьях, сорняках и ризосферных образцах почвы сорняков с помощью UPLC-MS / MS в сочетании с методом очистки адсорбента. Кроме того, 15 парных образцов почвы сорняков и ризосферных сорняков и 60 образцов свежих чайных листьев были собраны на пяти участках отбора проб в чайном саду Цзиньчжай в провинции Аньхой, Китай, и были проанализированы на наличие 15 ПА. Эти результаты могут предоставить метод обследования и некоторую информацию об источнике и пути ПА (загрязнения) в образцах чая для обеспечения качества и безопасности чая.

протокол

Для настоящего исследования были собраны следующие виды сорняков: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. и Crassocephalum crepidioides (Бент.) С. Мур. Свежие чайные листья были собраны из сорта чайных деревьев Longjing 43 #, а образцы сушеного чая были коммерчески доступными чайными изделиями, обработанными в соответствии с процессом производства зеленого чая (см. Таблицу материалов).

1. Сбор образцов

  1. Соберите 40 реальных образцов.
    1. Соберите 10 сорняков, 10 почв и 10 свежих чайных листьев случайным образом из нескольких чайных садов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования отбор проб почвы проводился на глубине 20 см с количеством пробы 200 г.
    2. Случайным образом соберите 10 сушеных чайных продуктов (250 г) из супермаркета.
  2. Соберите образцы сорняков, почвы и свежих чайных листьев, чтобы изучить источник загрязнения ПА в чае.
    1. Установите пять точек отбора проб в одном чайном саду, по три повторения в каждой точке.
    2. Соберите образцы сорняков Ageratum conyzoides L. с самым высоким содержанием PA, обычно встречающимся на чайных плантациях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образца составило 250 г для настоящего исследования.
    3. Соберите образцы почвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы почвы представляли собой ризосферную почву A. conyzoides на глубине 20 см с количеством образца 200 г.
    4. Соберите свежие чайные листья из разных частей чайных растений, в том числе одну почку с двумя листьями, одну почку с тремя листьями, одну почку с четырьмя листьями и зрелые листья.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образца составило 250 г.

2. Обработка образцов

  1. Предварительно обработайте образцы, выполнив следующие действия.
    1. Измельчите высушенный чай и образцы почвы с помощью измельчителя, пропустите измельченные образцы через сито с ячейкой 200 меш и храните их при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеный чай был коммерчески доступным чайным продуктом (см. Таблицу материалов), поэтому его непосредственно измельчали и просеивали для хранения. Образцы почвы (200 г) помещали в проветриваемое место в темноте для сушки на воздухе в течение примерно одной недели.
    2. Гомогенизируйте сорняки и свежие чайные листья с помощью гомогенизатора и храните их при температуре -20 ° C.
  2. Проведите пробную обработку высушенных чайных продуктов, свежих чайных листьев и сорняков.
    1. Взвесьте 1,00 г каждого образца (сушеные чайные продукты, свежие чайные листья и сорняки) и поместите его в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
    2. Добавьте 10 мл 0,1 моль/л раствора серной кислоты и встряхните в течение 2 мин для твердофазной экстракции (с использованием картриджа SPE, см. Таблицу материалов) и 1 мин для очистки адсорбента. Выполняют ультразвуковую экстракцию23 в течение 15 мин, а затем центрифугу в течение 10 мин со скоростью 9,390 x g при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность ультразвукового генератора составляла 290 Вт, частота колебаний составляла 35 кГц, а температура была установлена на 30 °C.
    3. Перенесите надосадочную жидкость в центрифужную пробирку объемом 50 мл с капельницей с пластиковым наконечником.
    4. Выполните описанные выше действия, чтобы повторить извлечение один раз. Соедините две надосадочные жидкости.
      1. Активируйте картриджи SPE 5 мл метанола и 5 мл деионизированной воды. Добавьте 10 мл надосадочной жидкости в предварительно активированный картридж и выполните очистку образца.
      2. После того, как уровень раствора образца достиг верхнего слоя картриджей, разбавляют аналиты 5 мл 1% раствора муравьиной кислоты, а затем 5 мл метанола. Откажитесь от элюата.
      3. Поливают 5 мл метанола (содержащего 0,5% аммиачной воды), фильтруют элюат через мембранный фильтр 0,22 мкм и анализируют с помощью UPLC-MS/MS (см. Таблицу материалов).
    5. Выполните очистку проб с помощью адсорбентов.
      1. Возьмите 2 мл надосадочной жидкости (этап 2.2.4) в центрифужную пробирку объемом 10 мл, заполненную адсорбентами GCB:PSA:C18 (10 мг:20 мг:15 мг, см. Таблицу материалов), встряхните в течение 1 мин и центрифугу при 9,390 x g в течение 8 мин при комнатной температуре.
      2. Пропустите 1 мл надосадочной жидкости через мембранный фильтр 0,22 мкм перед анализом с помощью UPLC-MS/MS.
  3. Проведите обработку образцов почвы.
    1. Взвесьте 1,00 г образца почвы. Поместите его в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 0,1 мл 0,1 моль/л раствора тринатрийцитрата 0,1 моль/л (см. Таблицу материалов), чтобы отрегулировать значение pH почвы до 6,0.
    2. Дайте постоять в течение 2 минут, а затем добавьте 10 мл раствора метанола серной кислоты 0,1 моль / л, встряхните в течение 2 минут и встряхните в течение 30 минут, а затем выполните ультразвуковую экстракцию в течение 30 минут.
    3. Центрифугу при 9,390 x g в течение 10 мин и перенесите надосадочную жидкость в центрифужную пробирку объемом 50 мл с капельницей с пластиковым наконечником.
    4. Выполните описанные выше шаги, чтобы повторить экстракцию и дважды смешать надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод очистки был таким же, как и на шагах 2.2.5.1 и 2.2.5.2.

3. Инструментальный анализ

  1. Определите 15 PA в образцах сушеного чая, свежих чайных листьях, сорняках и почве (образцы из шага 2) с помощью коммерчески доступной системы UPLC-MS/MS (2,1 мм x 100 мм, 1,8 мкм) (см. Таблицу материалов).
  2. Установите температуру колонки на 40 °C, скорость потока на 0,250 мл/мин и объем впрыска на 3 мкл.
  3. Установите подвижную фазу А: метанол (содержащий 0,1% муравьиной кислоты + 1 ммоль/л формиата аммония) и подвижную фазу В: вода (содержащую 0,1% муравьиной кислоты + 1 ммоль/л формиата аммония).
  4. Установите процедуру градиентного элюирования: 10% А от 0,0 мин до 0,25 мин, 10%-30% А от 0,25 мин до 6,0 мин, 30%-40% А от 6,0 мин до 9,0 мин, 40%-98% А от 9,0 мин до 9,01 мин, которые удерживались в течение 1,9 мин, и 98%-100% А от 11,0 мин до 11,1 мин, которые удерживались в течение 2,9 мин.
  5. Установка параметров масс-спектрометра: режим ионизации, источник положительных ионов электрораспылением (ESI+); давление в распылителе, 7,0 бар; капиллярное напряжение, 4,0 кВ; расход обратного продувочного отверстия конического отверстия, 150 л/ч; расход газообразного растворителя, 800 л/ч; температура растворителя, 400 °C; расход ударного газа, 0,25 мл/мин.

Результаты

Был установлен оптимизированный метод очистки и анализа адсорбента 15 ПА в образцах сухого чая, свежих чайных листьях, сорняках и почве и сопоставлен с широко используемым методом очистки с использованием картриджа SPE. Результаты показали, что извлечение 15 ПА в образцах сушеного чая, со?...

Обсуждение

Настоящая работа была разработана для разработки эффективного, чувствительного метода изучения путей загрязнения и источников ПА в образцах чая, а также распределения ПА в различных частях чайных растений. Однако в этом исследовании только 15 ПА были успешно разделены на хроматографи?...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным естественно-научным фондом Китая (32102244), Национальным проектом оценки качества и безопасности сельскохозяйственной продукции и рисков (GJFP2021001), Естественно-научным фондом провинции Аньхой (19252002) и Министерством сельского хозяйства США (HAW05020H).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile (99.9%)Tedia Company,Inc.21115197CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.181210CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%)Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai)G0860050CAS No:540-69-2
Carbon-GCBCNWB7760030120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HKHERMLEZ36HK30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea productLvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchunloose teaGreen tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%)BioCrick323256CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%)BioCrick98222CAS No:570-19-4
Formate (98.0%)AladdinE2022005CAS No:64-18-6
HC-C18CNWD211006040-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%)BioCrick906426CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%)BioCrick22581CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WScence203158000Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 columnWaters186004976ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%)BioCrick114843CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%)BioCrick340066CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%)BioCrick132282048CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%)ChemFacesCFN00461CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%)Tedia Company,Inc.21115100CAS No:67-56-1
PSAAgelaP19-0083340-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%)BioCrick5281743CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%)BioCrick5281734CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%)BioCrick5280906CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%)BioCrick5380876CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%)BioCrick6442619CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%)BioCrick5281750CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)BioCrick5281752CAS No:2318-18-5
SPE PCXAgilent Technologies12108206Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.1003019CAS No:7664-93-9
Trisodium citrateSinpharm Chemical Reagent Co., Ltd.20121009CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleanerSupmileKQ-600BInner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMSWatersZPLYY-003Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillatorGuoyu instrumentSHY-2AHSOscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

Ссылки

  1. Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
  2. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
  3. Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
  4. Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P., Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. 1, 348-355 (2019).
  5. Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
  6. Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
  7. Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
  8. Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
  9. Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
  10. Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
  11. Mattocks, A. R. . Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , (1986).
  12. Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
  13. Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
  14. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
  15. Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
  16. Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
  17. Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
  18. Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
  19. Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
  20. Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
  21. Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
  22. Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
  23. Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
  24. Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
  25. European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены