Fonte e via di contaminazione da alcaloidi pirrolizidinici nei campioni di tè

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la contaminazione degli alcaloidi pirrolizidinici (PA) nei campioni di tè provenienti da erbe infestanti produttrici di PA nei giardini del tè.

Abstract

Gli alcaloidi pirrolizidinici tossici (PA) si trovano nei campioni di tè, che rappresentano una minaccia per la salute umana. Tuttavia, la fonte e la via della contaminazione da PA nei campioni di tè sono rimaste poco chiare. In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo adsorbente combinato con UPLC-MS / MS per determinare 15 PA nell'erba Ageratum conyzoides L., nel terreno rizosferico di A. conyzoides , foglie di tè fresco e campioni di tè essiccato . I recuperi medi variavano dal 78% al 111%, con deviazioni standard relative dello 0,33% -14,8%. Quindici coppie di campioni di terreno rizosferico di A. conyzoides e A. conyzoides e 60 campioni di foglie di tè fresco sono stati raccolti dal giardino del tè Jinzhai nella provincia di Anhui, in Cina, e analizzati per i 15 PA. Non tutti i 15 PA sono stati rilevati nelle foglie di tè fresco, ad eccezione dell'intermedio-N-ossido (ImNO) e della senecionina (Sn). Il contenuto di ImNO (34,7 μg/kg) era superiore a quello di Sn (9,69 μg/kg). Inoltre, sia ImNO che Sn erano concentrati nelle foglie giovani della pianta del tè, mentre il loro contenuto era inferiore nelle foglie vecchie. I risultati hanno indicato che i PA nel tè sono stati trasferiti attraverso il percorso delle erbacce che producono PA-terra-foglie di tè fresche nei giardini del tè.

Introduzione

Come metaboliti secondari, gli alcaloidi pirrolizidinici (PA) proteggono le piante da erbivori, insetti e agenti patogeni ^1,2. Fino ad ora, oltre 660 PA e ossidi di PA-N (PANO) con strutture diverse sono stati trovati in più di 6.000 specie di piante in tutto il mondo ^3,4. Le piante produttrici di PA si trovano principalmente nelle famiglie Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae e Apocynaceae ^5,6. I PA sono facilmente ossidati in alcaloidi deidropirrolizidinici instabili, che hanno una forte elettrofilicità e possono attaccare nucleofili come DNA e proteine, con conseguente necrosi delle cellule del fegato, occlusioni venose, cirrosi, ascite e altri sintomi ^7,8. Il principale organo bersaglio della tossicità PA è il fegato. Le PA possono anche causare tossicità polmonare, renale e di altri organi e tossicità mutagena, cancerogena e dello sviluppo ^9,10.

Casi di avvelenamento umano e animale sono stati segnalati in molti paesi dall'ingestione di erbe tradizionali, integratori o tè contenenti PA o dalla contaminazione indiretta di alimenti come latte, miele o carne (tossici dall'ingestione di pascoli contenenti PA)^11,12,13. Le conclusioni dell'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) indicano che sostanze come il tè (alle erbe) sono un'importante fonte di esposizione umana agli AP/PANO¹⁴. I campioni di tè non producono PA, mentre le piante produttrici di PA si trovano comunemente nei giardini del tè (ad esempio, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus e Ageratum conyzoides)¹⁵. In precedenza si sospettava che il tè potesse essere contaminato da PA provenienti dai loro impianti di produzione durante la raccolta e la lavorazione. Tuttavia, i PA sono stati rilevati anche in alcune foglie di tè raccolte a mano (cioè nessun impianto che produce PA), suggerendo che ci devono essere altre vie o fonti di contaminazione¹⁶. È stato condotto un esperimento di co-coltivazione di erba (Senecio jacobaea) con melissa (Melissa officinalis), menta piperita (Mentha piperita), prezzemolo (Petroselinum crispum), camomilla (Matricaria recutita) e nasturzio (Tropaeolum majus) e i risultati hanno mostrato che le PA sono state rilevate in tutte queste piante¹⁷. È stato verificato che le PA sono effettivamente trasferite e scambiate tra piante viventi attraverso il suolo^18,19. Van Wyk et ^al.20 hanno scoperto che il tè rooibos (Aspalathus linearis) era gravemente contaminato in siti ricchi di erba e conteneva PA dello stesso tipo e proporzione. Tuttavia, non sono stati rilevati PA nel tè rooibos in siti privi di erbacce.

Attualmente, la spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UPLC-MS/MS) ad alta selettività e sensibilità è stata ampiamente utilizzata nell'analisi qualitativa e quantitativa delle PA nei prodotti agricoli e alimentari^21,22. Il metodo di trattamento del campione è solitamente costituito dall'estrazione in fase solida (SPE) o dalla pulizia QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) di estratti di matrici alimentari complesse, che possono ottenere la massima sensibilità possibile^12,19. Tuttavia, mancano ancora solidi metodi analitici che consentano il rilevamento e la quantificazione di PA in matrici complesse come suolo, erbe infestanti e foglie di tè fresco.

Questo studio ha analizzato 15 PA in campioni di tè essiccato, foglie di tè fresco, erbe infestanti e campioni di terreno rizosferico con UPLC-MS / MS combinato con un metodo di purificazione adsorbente. Inoltre, 15 campioni di terreno rizosferico accoppiati di erba e 60 campioni di foglie di tè fresco sono stati raccolti da cinque siti di campionamento nel giardino del tè Jinzhai nella provincia di Anhui, in Cina, e sono stati analizzati per 15 PA. Questi risultati possono fornire un metodo di indagine e alcune informazioni sulla fonte e il percorso dei PA (contaminazione) nei campioni di tè per garantire la qualità e la sicurezza del tè.

Protocollo

Per il presente studio sono state raccolte le seguenti specie di piante infestanti: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. e Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. Le foglie di tè fresco sono state raccolte dalla varietà di alberi di tè Longjing 43 ^# e i campioni di tè essiccato erano tè disponibili in commercio elaborati secondo il processo di produzione del tè verde (vedi Tabella dei materiali).

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogli 40 campioni reali.
   1. Raccogli 10 erbacce, 10 terreni e 10 foglie di tè fresco in modo casuale da più giardini di tè.
      NOTA: Per il presente studio, il terreno è stato campionato ad una profondità di 20 cm con una quantità di campione di 200 g.
   2. Raccogli casualmente 10 prodotti a base di tè essiccati (250 g) da un supermercato.
2. Raccogli campioni di erbe infestanti, terra e foglie di tè fresco per studiare la fonte di contaminazione delle PA nel tè.
   1. Impostare cinque punti di campionamento nella stessa piantagione di tè, con tre repliche in ogni punto.
   2. Raccogliere campioni di erba Ageratum conyzoides L. con il più alto contenuto di PA che si trova comunemente nei giardini del tè.
      NOTA: La quantità del campione era di 250 g per il presente studio.
   3. Raccogli i campioni di terreno.
      NOTA: I campioni di terreno erano terreno rizosferico di A. conyzoides ad una profondità di 20 cm con una quantità di campione di 200 g.
   4. Raccogli le foglie di tè fresche da diverse parti delle piante del tè, tra cui una gemma con due foglie, una gemma con tre foglie, una gemma con quattro foglie e foglie mature.
      NOTA: La quantità del campione era di 250 g.

2. Trattamento del campione

1. Pretrattare i campioni seguendo i passaggi seguenti.
   1. Macinare il tè essiccato e i campioni di terreno con un macinino, passare i campioni polverizzati attraverso un setaccio a 200 maglie e conservarli a -20 °C.
      NOTA: Il tè essiccato era un prodotto di tè disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), quindi è stato direttamente frantumato e setacciato per la conservazione. I campioni di terreno (200 g) sono stati posti in un luogo ventilato al buio per asciugare all'aria per circa una settimana.
   2. Omogeneizzare l'erba e le foglie di tè fresco con un omogeneizzatore e conservarle a -20 °C.
2. Eseguire il trattamento a campione dei prodotti a base di tè essiccati, foglie di tè fresco ed erbe infestanti.
   1. Pesare 1,00 g di ciascun campione (prodotti a base di tè essiccati, foglie di tè fresco ed erbe infestanti) e metterlo in una provette da centrifuga da 50 ml.
   2. Aggiungere 10 mL di soluzione di acido solforico 0,1 mol/L e vortice per 2 minuti per l'estrazione in fase solida (utilizzando cartuccia SPE, vedere Tabella dei materiali) e 1 min per la purificazione adsorbente. Eseguire l'estrazione ad ultrasuoni²³ per 15 minuti, quindi centrifugare per 10 minuti ad una velocità di 9.390 x g a temperatura ambiente.
      NOTA: la potenza dell'oscillatore ad ultrasuoni era di 290 W, la frequenza di oscillazione era di 35 kHz e la temperatura era impostata su 30 °C.
   3. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 ml con un contagocce in plastica.
   4. Seguire i passaggi precedenti per ripetere l'estrazione una volta. Combinare i due surnatanti
      1. Attivare le cartucce SPE con 5 mL di metanolo e 5 mL di acqua deionizzata. Aggiungere 10 mL di surnatante alla cartuccia preattivata ed eseguire la pulizia del campione.
      2. Dopo che il livello della soluzione del campione ha raggiunto lo strato superiore delle cartucce, eluire gli analiti con 5 ml di soluzione di acido formico all'1% e quindi 5 ml di metanolo. Scartare l'eluato.
      3. Eluire con 5 mL di metanolo (contenente lo 0,5% di acqua ammoniaca), filtrare l'eluato attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm e analizzare mediante UPLC-MS/MS (vedere Tabella dei materiali).
   5. Eseguire la pulizia del campione utilizzando adsorbenti.
      1. Prelevare 2 mL di surnatante (fase 2.2.4) in una provetta da centrifuga da 10 mL riempita con gli adsorbenti di GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg; vedere Tabella dei materiali), vortice per 1 minuto e centrifugare a 9.390 x g per 8 minuti a temperatura ambiente.
      2. Far passare 1 mL di surnatante attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm prima dell'analisi mediante UPLC-MS/MS.
3. Eseguire il trattamento dei campioni di terreno.
   1. Pesare un campione di terreno di 1,00 g. Metterlo in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere 0,1 mL di soluzione di citrato trisodico 0,1 mol/L (vedere Tabella dei materiali) per regolare il valore del pH del terreno a 6,0.
   2. Lasciare riposare per 2 minuti, quindi aggiungere 10 ml di soluzione di metanolo acido solforico 0,1 mol / L, vortice per 2 minuti e agitare per 30 minuti, quindi eseguire l'estrazione ad ultrasuoni per 30 minuti.
   3. Centrifugare a 9.390 x g per 10 minuti e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 ml con un contagocce di plastica.
   4. Seguire i passaggi precedenti per ripetere l'estrazione e combinare il surnatante due volte.
      NOTA: il metodo di purificazione era lo stesso dei punti 2.2.5.1 e 2.2.5.2.

3. Analisi strumentale

1. Rilevare i 15 PA in campioni di tè essiccato, foglie di tè fresco, erba e terreno (campioni della fase 2) utilizzando un sistema UPLC-MS/MS disponibile in commercio (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) (vedere Tabella dei materiali).
2. Impostare la temperatura della colonna a 40 °C, la portata a 0,250 ml/min e il volume di iniezione a 3 μL.
3. Impostare la fase mobile A: metanolo (contenente 0,1% di acido formico + 1 mmol/L di formiato di ammonio) e la fase mobile B: acqua (contenente 0,1% di acido formico + 1 mmol/L di formiato di ammonio).
4. Impostare una procedura di eluizione del gradiente: 10% A da 0,0 min a 0,25 min, 10%-30% A da 0,25 min a 6,0 min, 30%-40% A da 6,0 min a 9,0 min, 40%-98% A da 9,0 min a 9,01 min che si è tenuto per 1,9 min, e 98%-100% A da 11,0 min a 11,1 min che si è tenuto per 2,9 min.
5. Impostare i parametri dello spettrometro di massa: modalità di ionizzazione, sorgente ionica positiva elettrospray (ESI+); pressione atomizzatore, 7,0 bar; tensione capillare, 4,0 kV; flusso di controsoffiaggio del foro di cono, 150 L/h; flusso gas solvente, 800 L/h; temperatura di dissolvenza, 400 °C; flusso di gas d'impatto, 0,25 ml/min.

Risultati

Il metodo di purificazione e analisi adsorbente ottimizzato di 15 PA in campioni di tè essiccato, foglie di tè fresco, erbe infestanti e terreno è stato stabilito e confrontato con il metodo di purificazione comunemente usato utilizzando la cartuccia SPE. I risultati hanno mostrato che i recuperi dei 15 PA in campioni di tè essiccato, erba e foglie di tè fresco utilizzando la cartuccia SPE erano del 72% -120%, mentre quello che utilizzava la purificazione adsorbente era del 78% -98% (Figura 1

Discussione

Il presente lavoro è stato progettato per sviluppare un metodo efficace e sensibile per esplorare le vie di contaminazione e le fonti di PA nei campioni di tè, nonché la distribuzione di PA in diverse parti delle piante di tè. Tuttavia, in questo studio, solo 15 PA sono stati separati con successo sulla colonna cromatografica, che è un numero molto piccolo rispetto al gran numero di alcaloidi nelle specie vegetali ^3,4. Ciò non era solo correlato alle propri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (99.9%)	Tedia Company,Inc.	21115197	CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%)	Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.	181210	CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%)	Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai)	G0860050	CAS No:540-69-2
Carbon-GCB	CNW	B7760030	120-400 MESH, 10g. per box
Centrifuge Z 36 HK	HERMLE	Z36HK	30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product	Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun	loose tea	Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%)	BioCrick	323256	CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%)	BioCrick	98222	CAS No:570-19-4
Formate (98.0%)	Aladdin	E2022005	CAS No:64-18-6
HC-C18	CNW	D2110060	40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%)	BioCrick	906426	CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%)	BioCrick	22581	CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS	cence	203158000	Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column	Waters	186004976	ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%)	BioCrick	114843	CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%)	BioCrick	340066	CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%)	BioCrick	132282048	CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%)	ChemFaces	CFN00461	CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%)	Tedia Company,Inc.	21115100	CAS No:67-56-1
PSA	Agela	P19-00833	40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%)	BioCrick	5281743	CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%)	BioCrick	5281734	CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%)	BioCrick	5280906	CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%)	BioCrick	5380876	CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%)	BioCrick	6442619	CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%)	BioCrick	5281750	CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)	BioCrick	5281752	CAS No:2318-18-5
SPE PCX	Agilent Technologies	12108206	Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%)	Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.	1003019	CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate	Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20121009	CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner	Supmile	KQ-600B	Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS	Waters	ZPLYY-003	Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator	Guoyu instrument	SHY-2AHS	Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C