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Resumo

O presente protocolo descreve a contaminação de alcaloides pirrolizidínicos (APs) em amostras de chá de plantas daninhas produtoras de AP em jardins de chá.

Resumo

Alcaloides pirrolizidínicos tóxicos (APs) são encontrados em amostras de chá, que representam uma ameaça à saúde humana. No entanto, a origem e a via de contaminação por AP em amostras de chá permanecem obscuras. Neste trabalho, um método adsorvente combinado com UPLC-MS/MS foi desenvolvido para determinar 15 APs em plantas daninhas Ageratum conyzoides L., solo rizosférico de A. conyzoides, folhas de chá fresco e amostras de chá seco. As recuperações médias variaram de 78%-111%, com desvios-padrão relativos de 0,33%-14,8%. Quinze pares de A. conyzoides e A. conyzoides rhizospheric amostras de solo e 60 amostras de folhas de chá fresco foram coletadas no jardim de chá Jinzhai na província de Anhui, China, e analisadas para os 15 APs. Nem todos os 15 APs foram detectados em folhas de chá fresco, exceto N-óxido intermediário (ImNO) e senecionina (Sn). O conteúdo de ImNO (34,7 μg/kg) foi maior que o de Sn (9,69 μg/kg). Além disso, tanto o ImNO quanto o Sn concentraram-se nas folhas jovens da planta de chá, enquanto seu conteúdo foi menor nas folhas velhas. Os resultados indicaram que os APs no chá foram transferidos através do caminho de plantas daninhas produtoras de AF - solo e folhas frescas de chá em jardins de chá.

Introdução

Como metabólitos secundários, os alcaloides pirrolizidínicos (APs) protegem as plantas contra herbívoros, insetos e patógenos 1,2. Até o momento, mais de 660 APs e óxidos de AP-N (PANOs) com diferentes estruturas foram encontrados em mais de 6.000 espécies de plantas em todo o mundo 3,4. Plantas produtoras de AP são encontradas principalmente nas famílias Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae e Apocynaceae 5,6. Os APs são facilmente oxidados a alcaloides desidropirrolizidínicos instáveis, que apresentam forte eletrofilicidade e podem atacar nucleófilos como DNA e proteínas, resultando em necrose das células hepáticas, oclusões venosas, cirrose, ascite e outros sintomas 7,8. O principal órgão-alvo da toxicidade da AP é o fígado. Os APs também podem causar toxicidade pulmonar, renal e de outros órgãos e toxicidade mutagênica, carcinogênica e de desenvolvimento 9,10.

Casos de intoxicação humana e animal têm sido relatados em muitos países a partir da ingestão de ervas tradicionais, suplementos ou chás contendo APs ou da contaminação indireta de alimentos como leite, mel ou carne (tóxicos pela ingestão de pastagens contendo APs)11,12,13. As conclusões da Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA) indicam que substâncias como o chá (herbal) são uma importante fonte de exposição humana a APs/PANOs14. Amostras de chá não produzem APs, enquanto plantas produtoras de AF são comumente encontradas em jardins de chá (por exemplo, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus e Ageratum conyzoides)15. Suspeitava-se anteriormente que o chá poderia estar contaminado com APs de suas plantas produtoras durante a colheita e processamento. No entanto, APs também foram detectados em algumas folhas de chá escolhidas manualmente (ou seja, sem plantas produtoras de AF), sugerindo que deve haver outras rotas ou fontes de contaminação16. Foi conduzido um experimento de co-cultivo de plantas de trapoeraba (Senecio jacobaea) com plantas de melissa (Melissa officinalis), hortelã-pimenta (Mentha piperita), salsa (Petroselinum crispum), camomila (Matricaria recutita) e nasturtium (Tropaeolum majus), cujos resultados mostraram que APs foram detectados em todas essas plantas17. Verificou-se que os APs são, de fato, transferidos e trocados entre plantas vivas via solo18,19. Van Wyk et al.20 verificaram que o chá de rooibos (Aspalathus linearis) estava severamente contaminado em locais ricos em plantas daninhas e continha APs do mesmo tipo e proporção. No entanto, não foram detectados APs no chá de rooibos em locais livres de plantas daninhas.

Atualmente, a cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UPLC-MS/MS) com alta seletividade e sensibilidade tem sido amplamente utilizada na análise qualitativa e quantitativa de APs em produtos agrícolas ealimentícios21,22. O método de tratamento da amostra é geralmente composto por extração em fase sólida (SPE) ou limpeza QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) de extratos de matrizes alimentares complexas, que podem obter a maior sensibilidade possível12,19. No entanto, métodos analíticos robustos que permitam a detecção e quantificação de APs em matrizes complexas como solo, plantas daninhas e folhas de chá fresco ainda estão ausentes.

Este estudo analisou 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e amostras de solo rizosférico de plantas daninhas com UPLC-MS/MS combinado com um método de purificação por adsorvente. Além disso, 15 amostras pareadas de solo rizosférico de plantas daninhas e plantas daninhas e 60 amostras de folhas de chá fresco foram coletadas de cinco pontos de amostragem no jardim de chá Jinzhai na província de Anhui, China, e foram analisadas para 15 APs. Estes resultados podem fornecer um método de levantamento e algumas informações sobre a origem e rota de APs (contaminação) em amostras de chá para garantir a qualidade e segurança do chá.

Protocolo

Para o presente estudo, foram coletadas as seguintes espécies de plantas daninhas: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. e Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. As folhas de chá fresco foram colhidas da variedade de árvores de chá Longjing 43#, e as amostras de chá seco foram comercialmente disponíveis chá processado de acordo com o processo de fabricação do chá verde (ver Tabela de Materiais).

1. Coleta de amostras

  1. Coletar 40 amostras reais.
    1. Colete 10 ervas daninhas, 10 solos e 10 folhas de chá fresco aleatoriamente de vários jardins de chá.
      OBS: Para o presente estudo, o solo foi amostrado na profundidade de 20 cm com uma quantidade de amostra de 200 g.
    2. Recolha aleatoriamente 10 produtos de chá seco (250 g) de um supermercado.
  2. Coletar amostras de ervas daninhas, solo e folhas de chá fresco para estudar a fonte de contaminação de APs no chá.
    1. Defina cinco pontos de amostragem no mesmo jardim de chá, com três repetições em cada ponto.
    2. Coletar amostras de plantas daninhas de Ageratum conyzoides L. com maior teor de PA comumente encontrado em jardins de chá.
      OBS: A quantidade amostral foi de 250 g para o presente estudo.
    3. Coletar as amostras de solo.
      NOTA: As amostras de solo foram de A. conyzoides rhizospheric na profundidade de 20 cm com uma quantidade de amostra de 200 g.
    4. Colete as folhas de chá fresco de diferentes partes das plantas de chá, incluindo um botão com duas folhas, um botão com três folhas, um botão com quatro folhas e folhas maduras.
      NOTA: A quantidade de amostra foi de 250 g.

2. Tratamento da amostra

  1. Pré-trate as amostras seguindo os passos abaixo.
    1. Triture as amostras secas de chá e solo com um moedor, passe as amostras pulverizadas por uma peneira de 200 malhas e armazene-as a -20 °C.
      NOTA: O chá seco era um produto de chá disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais), por isso foi diretamente triturado e peneirado para armazenamento. As amostras de solo (200 g) foram colocadas em local ventilado no escuro para secar ao ar por cerca de uma semana.
    2. Homogeneizar a erva daninha e as folhas de chá fresco com um homogeneizador e armazená-las a -20 °C.
  2. Realizar o tratamento de amostra dos produtos de chá seco, folhas de chá fresco e ervas daninhas.
    1. Pesar 1,00 g de cada amostra (produtos secos de chá, folhas de chá fresco e ervas daninhas) e colocá-lo em tubos de centrífuga de 50 mL.
    2. Adicionar 10 ml de solução de ácido sulfúrico 0,1 mol/L e vórtice durante 2 minutos para extracção em fase sólida (utilizando cartucho SPE, ver Tabela de Materiais) e 1 min para purificação do adsorvente. Realizar extração ultra-sônica23 por 15 min e, em seguida, centrifugar por 10 min a uma velocidade de 9.390 x g à temperatura ambiente.
      NOTA: A potência do oscilador ultra-sônico foi de 290 W, a frequência de oscilação foi de 35 kHz e a temperatura foi ajustada para 30 °C.
    3. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL com um conta-gotas de plástico.
    4. Siga as etapas acima para repetir a extração uma vez. Combine os dois sobrenadantes.
      1. Ativar os cartuchos SPE com 5 mL de metanol e 5 mL de água deionizada. Adicionar 10 ml de sobrenadante ao cartucho pré-ativado e efectuar a limpeza da amostra.
      2. Após o nível da solução da amostra atingir a camada superior dos cartuchos, eluir os analitos com 5 mL de solução de ácido fórmico a 1% e, em seguida, 5 mL de metanol. Descarte o eluato.
      3. Eluir com 5 mL de metanol (contendo 0,5% de água de amônia), filtrar o eluato através de um filtro de membrana de 0,22 μm e analisar por UPLC-MS/MS (ver Tabela de Materiais).
    5. Realizar a limpeza da amostra usando adsorventes.
      1. Tomar 2 ml do sobrenadante (passo 2.2.4) num tubo de centrifugação de 10 ml preenchido com os adsorventes de GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg, ver Tabela de Materiais), vórtice durante 1 minuto e centrifugar a 9.390 x g durante 8 minutos à temperatura ambiente.
      2. Passar 1 mL do sobrenadante através de um filtro de membrana de 0,22 μm antes da análise por UPLC-MS/MS.
  3. Realizar tratamento das amostras de solo.
    1. Pesar uma amostra de solo de 1,00 g. Colocá-lo num tubo de centrifugação de 50 ml e adicionar 0,1 ml de solução de citrato trissódico 0,1 mol/L (ver Tabela de Materiais) para ajustar o valor de pH do solo para 6,0.
    2. Deixe repousar por 2 minutos e, em seguida, adicione 10 mL de solução de metanol de ácido sulfúrico 0,1 mol/L, vórtice por 2 min e agite por 30 minutos e, em seguida, execute a extração ultra-sônica por 30 min.
    3. Centrifugar a 9.390 x g por 10 min e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL com conta-gotas de plástico.
    4. Siga os passos acima para repetir a extração e combinar o sobrenadante duas vezes.
      NOTA: O método de purificação foi o mesmo que nas etapas 2.2.5.1 e 2.2.5.2.

3. Análise instrumental

  1. Detectar os 15 PAs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, ervas daninhas e solo (amostras da etapa 2) usando um sistema UPLC-MS/MS disponível comercialmente (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Ajuste a temperatura da coluna para 40 °C, o fluxo para 0,250 mL/min e o volume de injeção para 3 μL.
  3. Definir a fase móvel A: metanol (contendo 0,1% de ácido fórmico + 1 mmol/L de formato de amônio) e a fase móvel B: água (contendo 0,1% de ácido fórmico + 1 mmol/L de formato de amônio).
  4. Defina um procedimento de eluição de gradiente: 10% A de 0,0 min a 0,25 min, 10%-30% A de 0,25 min a 6,0 min, 30%-40% A de 6,0 min a 9,0 min, 40%-98% A de 9,0 min a 9,01 min que foi mantido por 1,9 min e 98%-100% A de 11,0 min a 11,1 min que foi mantido por 2,9 min.
  5. Definir os parâmetros do espectrômetro de massa: modo de ionização, fonte de íons positivos por eletrospray (ESI+); pressão do atomizador, 7,0 bar; tensão capilar, 4,0 kV; fluxo de sopro de volta do furo de cone, 150 L/h; fluxo de gás solvente, 800 L/h; temperatura de dissolução, 400 °C; fluxo de gás de impacto, 0,25 mL/min.

Resultados

O método otimizado de purificação e análise de adsorventes de 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e solo foi estabelecido e comparado com o método de purificação comumente usado usando o cartucho SPE. Os resultados mostraram que a recuperação dos 15 APs em amostras de chá seco, plantas daninhas e folhas de chá fresco usando o cartucho de SPE foi de 72%-120%, enquanto que com purificação de adsorvente foi de 78%-98% (Figura 1). As recuperaçõ...

Discussão

O presente trabalho foi projetado para desenvolver um método eficaz e sensível para explorar as rotas de contaminação e fontes de APs em amostras de chá, bem como a distribuição de APs em diferentes partes das plantas de chá. No entanto, neste estudo, apenas 15 APs foram separados com sucesso na coluna cromatográfica, o que é um número muito pequeno em comparação com o grande número de alcaloides nas espécies vegetais 3,4. Isso não só foi relacio...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Scientific Foundation of China (32102244), pelo National Agricultural Products Quality and Safety and Risk Assessment Project (GJFP2021001), pela Natural Scientific Foundation of Anhui Province (19252002) e pelo USDA (HAW05020H).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile (99.9%)Tedia Company,Inc.21115197CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.181210CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%)Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai)G0860050CAS No:540-69-2
Carbon-GCBCNWB7760030120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HKHERMLEZ36HK30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea productLvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchunloose teaGreen tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%)BioCrick323256CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%)BioCrick98222CAS No:570-19-4
Formate (98.0%)AladdinE2022005CAS No:64-18-6
HC-C18CNWD211006040-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%)BioCrick906426CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%)BioCrick22581CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WScence203158000Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 columnWaters186004976ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%)BioCrick114843CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%)BioCrick340066CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%)BioCrick132282048CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%)ChemFacesCFN00461CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%)Tedia Company,Inc.21115100CAS No:67-56-1
PSAAgelaP19-0083340-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%)BioCrick5281743CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%)BioCrick5281734CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%)BioCrick5280906CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%)BioCrick5380876CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%)BioCrick6442619CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%)BioCrick5281750CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)BioCrick5281752CAS No:2318-18-5
SPE PCXAgilent Technologies12108206Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%)Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.1003019CAS No:7664-93-9
Trisodium citrateSinpharm Chemical Reagent Co., Ltd.20121009CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleanerSupmileKQ-600BInner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMSWatersZPLYY-003Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillatorGuoyu instrumentSHY-2AHSOscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

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