Fuente y ruta de contaminación por alcaloides pirrolizidina en muestras de té

Resumen

El presente protocolo describe la contaminación de los alcaloides de pirrolizidina (PA) en muestras de té de malezas productoras de PA en jardines de té.

Resumen

Los alcaloides tóxicos de pirrolizidina (PA) se encuentran en muestras de té, que representan una amenaza para la salud humana. Sin embargo, la fuente y la ruta de contaminación por PA en muestras de té no están claras. En este trabajo, se desarrolló un método adsorbente combinado con UPLC-MS / MS para determinar 15 PA en la maleza Ageratum conyzoides L., suelo rizosférico de A. conyzoides , hojas de té frescas y muestras de té secas. Las recuperaciones promedio oscilaron entre 78% y 111%, con desviaciones estándar relativas de 0.33% -14.8%. Quince pares de muestras de suelo rizosférico de A. conyzoides y A. conyzoides y 60 muestras de hojas de té frescas se recolectaron del jardín de té Jinzhai en la provincia de Anhui, China, y se analizaron para las 15 AP . No se detectaron los 15 PA en hojas de té frescas, excepto el N-óxido intermedio (ImNO) y la senecionina (Sn). El contenido de ImNO (34,7 μg/kg) fue mayor que el de Sn (9,69 μg/kg). Además, tanto ImNO como Sn se concentraron en las hojas jóvenes de la planta del té, mientras que su contenido fue menor en las hojas viejas. Los resultados indicaron que los PA en el té se transfirieron a través del camino de las malezas productoras de PA-suelo-hojas de té frescas en los jardines de té.

Introducción

Como metabolitos secundarios, los alcaloides de pirrolizidina (AP) protegen a las plantas contra herbívoros, insectos y patógenos ^1,2. Hasta ahora, se han encontrado más de 660 PA y óxidos de PA (PANO) con diferentes estructuras en más de 6.000 especies de plantas en todo el mundo ^3,4. Las plantas productoras de PA se encuentran principalmente en las familias Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae y Apocynaceae ^5,6. Los PA se oxidan fácilmente a alcaloides deshidropirrolizidina inestables, que tienen una fuerte electrofilicidad y pueden atacar nucleófilos como el ADN y las proteínas, lo que resulta en necrosis de células hepáticas, oclusiones venosas, cirrosis, ascitis y otros síntomas ^7,8. El principal órgano diana de la toxicidad por PA es el hígado. Los AP también pueden causar toxicidad pulmonar, renal y de otros órganos, así como toxicidad mutagénica, carcinogénica y para el desarrollo ^9,10.

En muchos países se han notificado casos de intoxicación humana y animal por la ingestión de hierbas, suplementos o tés tradicionales que contienen AP o la contaminación indirecta de alimentos como la leche, la miel o la carne (tóxicos por la ingestión de pastos que contienen AP)^11,12,13. Los resultados de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) indican que sustancias como el té (a base de hierbas) son una fuente importante de exposición humana a las AP/PANO¹⁴. Las muestras de té no producen AP, mientras que las plantas productoras de PA se encuentran comúnmente en jardines de té (por ejemplo, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus, y Ageratum conyzoides)¹⁵. Anteriormente se sospechaba que el té podría estar contaminado con PA de sus plantas productoras durante la recolección y el procesamiento. Sin embargo, también se detectaron AP en algunas hojas de té recogidas a mano (es decir, sin plantas productoras de AP), lo que sugiere que debe haber otras rutas o fuentes de contaminación¹⁶. Se realizó un experimento de cocultivo de artemisa (Senecio jacobaea) con melisa (Melissa officinalis), menta (Mentha piperita), perejil (Petroselinum crispum), manzanilla (Matricaria recutita) y capuchina (Tropaeolum majus), y los resultados mostraron que se detectaron APs en todas estas plantas¹⁷. Se ha verificado que las AP son efectivamente transferidas e intercambiadas entre plantas vivas a través del suelo^18,19. Van Wyk et ^al.20 encontraron que el té rooibos (Aspalathus linearis) estaba severamente contaminado en sitios ricos en malezas y contenía AP del mismo tipo y proporción. Sin embargo, no se detectaron AP en el té rooibos en sitios libres de malezas.

En la actualidad, la cromatografía líquida de ultra alta resolución espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS/MS) con alta selectividad y sensibilidad ha sido ampliamente utilizada en el análisis cualitativo y cuantitativo de APs en productos agrícolas y alimentarios^21,22. El método de tratamiento de la muestra generalmente consiste en la extracción en fase sólida (SPE) o en la limpieza QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) de extractos de matrices alimentarias complejas, que pueden obtener la mayor sensibilidad posible^12,19. Sin embargo, todavía faltan métodos analíticos robustos que permitan la detección y cuantificación de AP en matrices complejas como tierra, malezas y hojas de té frescas.

Este estudio analizó 15 PA en muestras de té seco, hojas de té frescas, malezas y muestras de suelo rizosférico de malezas con UPLC-MS / MS combinado con un método de purificación adsorbente. Además, se recolectaron 15 muestras de suelo rizosférico de malezas y malezas emparejadas y 60 muestras de hojas de té frescas de cinco sitios de muestreo en el jardín de té Jinzhai en la provincia de Anhui, China, y se analizaron para detectar 15 AP. Estos resultados pueden proporcionar un método de encuesta y cierta información sobre la fuente y la ruta de las AP (contaminación) en las muestras de té para garantizar la calidad y seguridad del té.

Protocolo

Para el presente estudio, se recolectaron las siguientes especies de malezas: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. y Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. Las hojas de té frescas se recogieron de la variedad de árboles de té Longjing 43 ^#, y las muestras de té seco estaban disponibles comercialmente para el té procesado de acuerdo con el proceso de fabricación del té verde (ver Tabla de materiales).

1. Recogida de muestras

1. Recoge 40 muestras reales.
   1. Recolecte 10 malezas, 10 suelos y 10 hojas de té frescas al azar de múltiples jardines de té.
      NOTA: Para el presente estudio, el suelo fue muestreado a una profundidad de 20 cm con una cantidad de muestra de 200 g.
   2. Recoja al azar 10 productos de té seco (250 g) de un supermercado.
2. Recoja muestras de malezas, tierra y hojas de té frescas para estudiar la fuente de contaminación de los PA en el té.
   1. Establezca cinco puntos de muestreo en el mismo jardín de té, con tres réplicas en cada punto.
   2. Recoja muestras de malezas de Ageratum conyzoides L. con el mayor contenido de PA que se encuentra comúnmente en los jardines de té.
      NOTA: La cantidad muestral fue de 250 g para el presente estudio.
   3. Recoger las muestras de suelo.
      NOTA: Las muestras de suelo fueron suelo rizosférico de A. conyzoides a una profundidad de 20 cm con una cantidad muestral de 200 g.
   4. Recoja las hojas de té frescas de diferentes partes de las plantas de té, incluyendo un brote con dos hojas, un brote con tres hojas, un brote con cuatro hojas y hojas maduras.
      NOTA: La cantidad de muestra fue de 250 g.

2. Tratamiento de la muestra

1. Pretrate las muestras siguiendo los pasos a continuación.
   1. Moler las muestras de té seco y tierra con un molinillo, pasar las muestras pulverizadas a través de un tamiz de malla 200 y almacenarlas a -20 ° C.
      NOTA: El té seco era un producto de té disponible comercialmente (ver Tabla de materiales), por lo que se trituraba y tamizaba directamente para su almacenamiento. Las muestras de suelo (200 g) se colocaron en un lugar ventilado en la oscuridad para secar al aire durante aproximadamente una semana.
   2. Homogeneice la hierba y las hojas de té frescas con un homogeneizador y guárdelas a -20 °C.
2. Realice un tratamiento de muestra de los productos de té seco, hojas de té frescas y malezas.
   1. Pesar 1,00 g de cada muestra (productos de té secos, hojas de té frescas y malezas) y colóquela en tubos de centrífuga de 50 ml.
   2. Agregue 10 ml de solución de ácido sulfúrico 0.1 mol / L y vórtice durante 2 minutos para la extracción en fase sólida (usando cartucho SPE, consulte la Tabla de materiales) y 1 min para la purificación del adsorbente. Realice la extracción ultrasónica²³ durante 15 min, y luego centrifugar durante 10 min a una velocidad de 9,390 x g a temperatura ambiente.
      NOTA: La potencia del oscilador ultrasónico fue de 290 W, la frecuencia de oscilación fue de 35 kHz y la temperatura se estableció en 30 ° C.
   3. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml con un gotero de punta de plástico.
   4. Siga los pasos anteriores para repetir la extracción una vez. Combine los dos sobrenadantes.
      1. Active los cartuchos SPE con 5 mL de metanol y 5 mL de agua desionizada. Agregue 10 ml de sobrenadante al cartucho preactivado y realice la limpieza de la muestra.
      2. Después de que el nivel de la solución de muestra haya alcanzado la capa superior de los cartuchos, eluya los analitos con 5 ml de solución de ácido fórmico al 1% y luego 5 ml de metanol. Deseche el eluido.
      3. Eluya con 5 ml de metanol (que contiene 0,5% de agua de amoníaco), filtre el eluido a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y analice mediante UPLC-MS/MS (consulte la Tabla de materiales).
   5. Realice la limpieza de muestras utilizando adsorbentes.
      1. Tomar 2 ml del sobrenadante (paso 2.2.4) en un tubo de centrífuga de 10 ml lleno con los adsorbentes de GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg, ver Tabla de materiales), vórtice durante 1 min y centrifugar a 9,390 x g durante 8 min a temperatura ambiente.
      2. Pasar 1 ml del sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,22 μm antes del análisis por UPLC-MS/MS.
3. Realizar el tratamiento de las muestras de suelo.
   1. Pesar una muestra de suelo de 1,00 g. Colóquelo en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregue 0.1 ml de solución de citrato trisódico de 0.1 mol / L (consulte la Tabla de materiales) para ajustar el valor del pH del suelo a 6.0.
   2. Deje reposar durante 2 minutos y luego agregue 10 ml de solución de metanol de ácido sulfúrico 0.1 mol / L, vórtice durante 2 minutos y agite durante 30 minutos, y luego realice la extracción ultrasónica durante 30 minutos.
   3. Centrifugar a 9.390 x g durante 10 min, y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml con un gotero de punta de plástico.
   4. Siga los pasos anteriores para repetir la extracción y combine el sobrenadante dos veces.
      NOTA: El método de purificación fue el mismo que en los pasos 2.2.5.1 y 2.2.5.2.

3. Análisis instrumental

1. Detecte los 15 PA en muestras de té seco, hojas de té frescas, malezas y tierra (muestras del paso 2) utilizando un sistema UPLC-MS/MS disponible comercialmente (2.1 mm x 100 mm, 1.8 μm) (ver Tabla de materiales).
2. Ajuste la temperatura de la columna a 40 °C, el caudal a 0,250 ml/min y el volumen de inyección a 3 μL.
3. Establezca la fase móvil A: metanol (que contiene 0,1% de ácido fórmico + 1 mmol / L de formiato de amonio) y la fase móvil B: agua (que contiene 0,1% de ácido fórmico + 1 mmol / L de formiato de amonio).
4. Establezca un procedimiento de elución de gradiente: 10% A de 0.0 min a 0.25 min, 10% -30% A de 0.25 min a 6.0 min, 30%-40% A de 6.0 min a 9.0 min, 40%-98% A de 9.0 min a 9.01 min que se mantuvo durante 1.9 min, y 98%-100% A de 11.0 min a 11.1 min que se mantuvo durante 2.9 min.
5. Ajuste los parámetros del espectrómetro de masas: modo de ionización, fuente de iones positivos por electrospray (ESI+); presión del atomizador, 7,0 bar; tensión capilar, 4,0 kV; flujo de soplado hacia atrás del orificio cónico, 150 L/h; caudal de gas disolvente, 800 L/h; temperatura del disolvente, 400 °C; caudal de gas de impacto, 0,25 mL/min.

Resultados

Se estableció el método optimizado de purificación y análisis de adsorbentes de 15 PA en muestras de té seco, hojas de té frescas, malezas y suelo y se comparó con el método de purificación comúnmente utilizado utilizando el cartucho SPE. Los resultados mostraron que las recuperaciones de los 15 PA en muestras de té seco, malezas y hojas de té frescas utilizando el cartucho SPE fueron del 72% -120%, mientras que el uso de la purificación adsorbente fue del 78% -98% (Figura 1). L...

Discusión

El presente trabajo fue diseñado para desarrollar un método eficaz y sensible para explorar las rutas de contaminación y las fuentes de AP en muestras de té, así como la distribución de AP en diferentes partes de las plantas de té. Sin embargo, en este estudio, sólo 15 PA fueron separados con éxito en la columna cromatográfica, que es un número muy pequeño en comparación con el gran número de alcaloides en las especies de plantas ^3,4. Esto no solo e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (99.9%)	Tedia Company,Inc.	21115197	CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%)	Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.	181210	CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%)	Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai)	G0860050	CAS No:540-69-2
Carbon-GCB	CNW	B7760030	120-400 MESH, 10g. per box
Centrifuge Z 36 HK	HERMLE	Z36HK	30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product	Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun	loose tea	Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%)	BioCrick	323256	CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%)	BioCrick	98222	CAS No:570-19-4
Formate (98.0%)	Aladdin	E2022005	CAS No:64-18-6
HC-C18	CNW	D2110060	40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%)	BioCrick	906426	CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%)	BioCrick	22581	CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS	cence	203158000	Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column	Waters	186004976	ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%)	BioCrick	114843	CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%)	BioCrick	340066	CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%)	BioCrick	132282048	CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%)	ChemFaces	CFN00461	CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%)	Tedia Company,Inc.	21115100	CAS No:67-56-1
PSA	Agela	P19-00833	40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%)	BioCrick	5281743	CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%)	BioCrick	5281734	CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%)	BioCrick	5280906	CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%)	BioCrick	5380876	CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%)	BioCrick	6442619	CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%)	BioCrick	5281750	CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%)	BioCrick	5281752	CAS No:2318-18-5
SPE PCX	Agilent Technologies	12108206	Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%)	Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd.	1003019	CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate	Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20121009	CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner	Supmile	KQ-600B	Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS	Waters	ZPLYY-003	Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator	Guoyu instrument	SHY-2AHS	Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C