植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

要約

ここでは、AT4G18020(APRR2)-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリ(Cucumis sativus L.)の近接標識(PL)実験を行うためのステップバイステップのプロトコルを紹介します。この方法は、ベクターの構築、アグロインフィルトレーションによるコンストラクトの形質転換、ビオチン浸潤、タンパク質抽出、およびアフィニティー精製技術によるビオチン標識タンパク質の精製を記述します。

要約

哺乳類の細胞や植物では、修飾アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)または大 腸菌 ビオチンリガーゼBirA(BioID)を用いた近接標識(PL)アプローチが、タンパク質間相互作用(PPI)の同定に成功していることが証明されています。APEX、BioID、およびBioIDの改訂版であるTurboIDには、貴重な技術であることに加えて、いくつかの制限があります。最近開発されたAirIDは、タンパク質間相互作用における近接同定のためのBioIDの新規バージョンであり、これらの制限を克服しました。これまでは動物モデルでAirIDが用いられていましたが、今回の研究では植物におけるAirIDの利用が実証され、標的タンパク質の近位にあるタンパク質標識において、BioIDやTurboIDなどの他のPL酵素と比較して、植物系においてAirIDが優れた性能を発揮することが確認されました。ここでは、AT4G18020(APRR2)タンパク質をモデルとしてタンパク質相互作用パートナーを同定するためのステップバイステップのプロトコルを示します。この方法では、ベクターの構築、アグロインフィルトレーションによるコンストラクトの形質転換、ビオチンの形質転換、タンパク質の抽出、およびアフィニティー精製技術によるビオチン標識タンパク質の濃縮について説明します。この結果は、AirIDが植物のPPIを分析するための新規かつ理想的な酵素であると結論付けています。この方法は、植物の他のタンパク質の研究に適用できます。

概要

さまざまな細胞タンパク質が生物学的に制御されたシステムの下で機能し、タンパク質間相互作用(PPI)はこのシステムの一部であり、多くの細胞プロセスの基礎です。天然タンパク質の機能は、PPI以外にも、複合体の形成、ユビキチン化、リン酸化などの様々な修飾 によって 翻訳後促進されます。したがって、PPIの研究は、標的タンパク質の可能な機能を理解する上で重要です。PPIは、免疫沈降後の質量分析(IP-MS分析)¹、酵母ツーハイブリッドシステム(Y2H)²、無細胞ベースアレイ³など、さまざまな技術を用いて実施されています。これらの手法は、研究分野におけるさまざまな重要な発見を探求しました。ただし、これらの方法にはいくつかの欠点があります。例えば、Y2Hは時間と費用のかかる戦略であり、対象種のY2Hライブラリを構築する必要があります。

さらに、Y2H技術では、高等真核細胞の細胞状態を正確に反映できない異種の単細胞真核生物である酵母を使用します。IP-MSは疎水性が高いタンパク質には適さず、弱いPPIの捕捉効率も低いことが示されています。ヌクレオチド結合ドメインやロイシンリッチリピート含有(NLR)タンパク質、受容体様キナーゼ(RLK)など、植物のさまざまな必須タンパク質は低レベルで発現し、ほとんどが他のタンパク質と一過性に相互作....

プロトコル

1.植物材料の準備

1. Cucumis sativus (キュウリ)は実験分析に用いられます。種子を水に入れ、50°Cで20分間インキュベートした後、種子をペトリプレート上の濾紙に12〜16時間置きます。
2. その後、種子を土壌の入った鉢(市販で購入)に移し、23°Cの温度、16時間の明期と8時間の暗期の気候室で成長させます。
3. 植物が3〜4週間、葉の段階に達するまで、植物を気候チャンバーに維持して、農業浸透を成功させます。

2. AirID構築

1. APRR2を標的タンパク質とし、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(p35S:APRR2-AirID)でAPRR2-AirIDを構築します。これをGateway互換バイナリベクターpEarleyGate100⁶(カンザス州立大学のKathrin Schrick博士提供)に導入し、 補足ファイル1に示された配列に従ってPL酵素を直接合成します。

3. コンピテントセルの調製

1. DH5αコンピテントセルの調製
   1. 2 mL の LB (10 g/L の....

結果

これまでの研究によると、キュウリの遺伝子 APRR2 は、白色の未熟な果実の色を制御する候補遺伝子^である8。ここでは、キュウリ中の APRR2 の相互作用パートナータンパク質を見つけるための近接標識酵素としてAirIDを使用したプロトコルを開発しました。構築物をキュウリの葉に転写し、浸潤後36時間後にビオチンを転写した。48時間後、ウェスタンブロット分?.......

ディスカッション

今回の実験では、Kidoらが大規模なゲノムデータセットと5つの従来のBirA酵素^{5を用いて祖先}酵素を再構築するアルゴリズムによって開発した近接標識にAirIDを用いた。ランダム突然変異は、ランダム突然変異が動的な配列変化を生み出すことができないため^{、活性を高める}ために従来の進化的タンパク質工学で使用されました^9,10。?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% solution	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammonium bicarbonate	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G313BA0018
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Competent cells GV3101	Made in the current experiment
Desalting column	Thermo scientific	WC321753
Deoxycholic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G818BA0029
DH5α competent cells	Made in the current experiment		E.coli DH5α
β-D-maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	Quick filtration material filter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Protein inhibitor cocktail	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetic beads
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Tryptone	Thermo scientific	LP0042