植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

要約

ここでは、AT4G18020(APRR2)-AirIDタンパク質をモデルとして、キュウリ(Cucumis sativus L.)の近接標識(PL)実験を行うためのステップバイステップのプロトコルを紹介します。この方法は、ベクターの構築、アグロインフィルトレーションによるコンストラクトの形質転換、ビオチン浸潤、タンパク質抽出、およびアフィニティー精製技術によるビオチン標識タンパク質の精製を記述します。

要約

哺乳類の細胞や植物では、修飾アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)または大 腸菌 ビオチンリガーゼBirA(BioID)を用いた近接標識(PL)アプローチが、タンパク質間相互作用(PPI)の同定に成功していることが証明されています。APEX、BioID、およびBioIDの改訂版であるTurboIDには、貴重な技術であることに加えて、いくつかの制限があります。最近開発されたAirIDは、タンパク質間相互作用における近接同定のためのBioIDの新規バージョンであり、これらの制限を克服しました。これまでは動物モデルでAirIDが用いられていましたが、今回の研究では植物におけるAirIDの利用が実証され、標的タンパク質の近位にあるタンパク質標識において、BioIDやTurboIDなどの他のPL酵素と比較して、植物系においてAirIDが優れた性能を発揮することが確認されました。ここでは、AT4G18020(APRR2)タンパク質をモデルとしてタンパク質相互作用パートナーを同定するためのステップバイステップのプロトコルを示します。この方法では、ベクターの構築、アグロインフィルトレーションによるコンストラクトの形質転換、ビオチンの形質転換、タンパク質の抽出、およびアフィニティー精製技術によるビオチン標識タンパク質の濃縮について説明します。この結果は、AirIDが植物のPPIを分析するための新規かつ理想的な酵素であると結論付けています。この方法は、植物の他のタンパク質の研究に適用できます。

概要

さまざまな細胞タンパク質が生物学的に制御されたシステムの下で機能し、タンパク質間相互作用(PPI)はこのシステムの一部であり、多くの細胞プロセスの基礎です。天然タンパク質の機能は、PPI以外にも、複合体の形成、ユビキチン化、リン酸化などの様々な修飾 によって 翻訳後促進されます。したがって、PPIの研究は、標的タンパク質の可能な機能を理解する上で重要です。PPIは、免疫沈降後の質量分析(IP-MS分析)¹、酵母ツーハイブリッドシステム(Y2H)²、無細胞ベースアレイ³など、さまざまな技術を用いて実施されています。これらの手法は、研究分野におけるさまざまな重要な発見を探求しました。ただし、これらの方法にはいくつかの欠点があります。例えば、Y2Hは時間と費用のかかる戦略であり、対象種のY2Hライブラリを構築する必要があります。

さらに、Y2H技術では、高等真核細胞の細胞状態を正確に反映できない異種の単細胞真核生物である酵母を使用します。IP-MSは疎水性が高いタンパク質には適さず、弱いPPIの捕捉効率も低いことが示されています。ヌクレオチド結合ドメインやロイシンリッチリピート含有(NLR)タンパク質、受容体様キナーゼ(RLK)など、植物のさまざまな必須タンパク質は低レベルで発現し、ほとんどが他のタンパク質と一過性に相互作用します。したがって、これらの方法を用いるだけでは、これらのタンパク質の調節の根底にあるメカニズムを理解するには不十分である³。

近接ビオチン化(PB)と呼ばれる新しい技術は、研究者がPPIを特定するのに役立ちます。PBは、目的のタンパク質(POI)に結合するPL酵素に依存しており、パートナータンパク質がPOIに近づくと、PLはパートナータンパク質に化学ビオチンタグを付加します。さらに、タグ付きタンパク質を同定することができ、どのパートナータンパク質が標的タンパク質^に結合するかを迅速に知ることができる5。これまでの研究で、BioIDとTurboIDは、特に植物におけるPPIのツールとして成功することが証明されていますが、^{一定の限界があります}4。BioID では、パートナータンパク質の標識に高レベルのビオチンが必要であり、これには 16 時間以上かかります。BioID と比較して、TurboID は 10 分でタンパク質を標識し、室温(RT)でパートナータンパク質を標識できるため、より有益です。また、特定の条件下では細胞に毒性があり、目的のタンパク質との相互作用を示さないタンパク質にタグを付けます。

これらの問題を克服するために、Kidoらによって開発されたAirIDは、BioIDとAirID⁵の配列類似性は82%ですが、他の標識酵素よりも効率的です。AirIDの効率性を確認するために、既知のアソシエイトとのPOIを使用して実験を行いました。この実験により、AirIDが植物細胞内の関連タンパク質を間違いなく標識できることが確認されました。AirIDは、 in vitro および細胞内のPPIを分析するための貴重な酵素です。TurboIDよりも毒性が少なく、非パートナーにタグを付けるのに時間がかかるプロセスでエラーが少なく、細胞を殺すことができます。これは、AirIDが近接ビオチン化において他の標識酵素よりも競争力が高いことを示しています。それはより正確で、時間のかかるプロセスでより多くの可能性を秘めており、 in vitro および生細胞での毒性が低くなります。現在のプロトコルでは、AirIDをPL酵素として使用したAPRR2の相互作用タンパク質の同定が記述されています。さらに、この方法を他のタンパク質に適用して、植物種のPPIを調べることができます。

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プロトコル

1.植物材料の準備

1. Cucumis sativus (キュウリ)は実験分析に用いられます。種子を水に入れ、50°Cで20分間インキュベートした後、種子をペトリプレート上の濾紙に12〜16時間置きます。
2. その後、種子を土壌の入った鉢(市販で購入)に移し、23°Cの温度、16時間の明期と8時間の暗期の気候室で成長させます。
3. 植物が3〜4週間、葉の段階に達するまで、植物を気候チャンバーに維持して、農業浸透を成功させます。

2. AirID構築

1. APRR2を標的タンパク質とし、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(p35S:APRR2-AirID)でAPRR2-AirIDを構築します。これをGateway互換バイナリベクターpEarleyGate100⁶(カンザス州立大学のKathrin Schrick博士提供)に導入し、 補足ファイル1に示された配列に従ってPL酵素を直接合成します。

3. コンピテントセルの調製

1. DH5αコンピテントセルの調製
   1. 2 mL の LB (10 g/L のトリプトン、5 g/L の酵母抽出物、10 g/L の NaCl; pH = 7.0.) に大 腸菌 DH5α 細胞を (融解せずに凍結ストックから直接) 接種し、37 °C で一晩 (O/N) 増殖させます。
   2. O/N培養液から0.1%〜0.5%の接種物を100mLのLB培地に新たに接種し、OD₆₀₀ が0.4〜0.6に達するまで細胞を増殖させ、4°Cで30分間培養液をインキュベートします。
   3. 培養液を2本の50 mL遠心チューブに入れ、2500 x gで4°Cで5分間遠心します。
   4. 上清を廃棄し、細胞を10 mLの0.1 M氷冷CaCl₂に再懸濁し、氷上に15分間置いた。2500 x g のスピンで細胞を4°Cで5分間ペレット化します。
   5. 細胞を氷冷した0.1 M CaCl₂ + 20%グリセロール1 mLに再懸濁し、各1.5 mLチューブに100 μLを分注し、直ちに-80°Cで保存します。
2. GV3101コンピテントセルの調製
   1. 2 mL の LB (50 μg/mL のゲンタマイシンと 25 μg/mL のリファンピシンを含む) を 1 つの GV3101 コロニーに接種します。培養物O/Nを28°Cでインキュベートし、250rpmで振とうします。
   2. 200 mL の LB に 1 mL の飽和一晩培養液を接種します。培養液を250rpmで振とうし、OD₆₀₀ が0.5になるまで28°Cでインキュベートします。
   3. 培養液を4本の冷やした滅菌済み50 mL遠心チューブに移し、氷上に30分間置きます。
   4. 細胞を2500 x gで4°Cで10分間ペレット化します。 上澄みを捨て、ペレットを氷の上に置きます。
   5. 細胞を10 mLの0.1 M氷冷CaCl₂ 溶液に再懸濁します。細胞を1本の冷やした50 mLのOakridgeチューブにプールします。
   6. 細胞を1,000 x g で4°Cで5分間ペレット化します。 上清を廃棄し、細胞を氷冷CaCl₂ 溶液10 mLに再懸濁します。氷の上に30分間置きます。
   7. 細胞を1,000 x gで4°Cで5分間ペレット化します。 上清を廃棄し、細胞を 2 mL の 0.1 M 氷冷 CaCl₂ 溶液に再懸濁します。
   8. 細胞を50 μLのアリコートに入れ、あらかじめ冷やした滅菌ポリプロピレンチューブに分注します。細胞は-80°Cで保存してください。

4. Agroinfiltration(アグロインフィルトレーション)

1. まず、プラスミドをアグロバクテリウムに移します
   1. ステップ2.1で生成したプラスミド2.5 μLをagrobacterium tumefaciens GV3101株のコンピテントセルに移し、氷上で30分間インキュベートします。
   2. プラスミドとコンピテントセルが入ったチューブを液体窒素に3分間移します。
   3. インキュベーターで37°Cで5分間ヒートショックした後、チューブを氷上に2分間置きます。
   4. 1,000 μLのLB培地(トリプトン10 g/L、酵母抽出物5 g/L、NaCl 10 g/L;pH = 7.0)をアグロバクテリウムに加え、30°C、118 rpmで1時間インキュベートします。
   5. 3,000 x g で4°Cで2分間遠心分離します。
   6. 溶液の上部800μLを廃棄し、残りの溶液を混合します。次に、LBに播種します(ステップ4.1.4で説明したように、プラスミドには寒天と50 μg/mLのカナマイシンを、GV3010コンピテントセルには50 μg/mLのゲンタマイシンと25 μg/mLのリファンピシンを加えました)。プレートを30°Cで48時間インキュベートします。
      注:いくつかのコロニーを選び^、PCRを実行して目的の遺伝子を確認することをお勧めします7。
2. プレートからいくつかの細菌コロニーを拾い上げ、LB培地と適切な抗生物質に入れます(ステップ4.1.6を参照)。30°C、218rpmで36〜48時間インキュベートします。
3. 細胞を3,000 x gで2分間、4°Cで遠心分離します。 細胞をアグロインフィルトレーションバッファー(10 mM MgCl₂、10 mM MES、pH = 5.6、250 μM アセトシリンゴン)にOD₆₀₀ = 1.0で再懸濁します。
4. 1 mLのニードルレスシリンジを使用して、(軸軸)表皮の接種物(ステップ4.3から生成)を浸潤させます。.
   注:葉全体に浸透し、複製することを選択することをお勧めします。4〜5個の植物の場合は、1つのコンストラクトを使用します。各葉に対して、1.5 mLの再懸濁アグロバクテリアで十分です。
5. 23°Cで16時間の光(約75μmol·^m-2·^s-1)と8時間の暗日長の気候チャンバーで植物を36時間維持します。
6. 構築物に36時間浸潤した後、1 mLの5 μMビオチン(10 mM MgCl₂ 溶液中)を、すでにろ過された構築物の葉に浸潤します。
7. 葉の組織を収穫する前に、処理された植物をさらに4〜12時間維持します。
   注:以前の研究によると、標的タンパク質は36時間でピークに達するため、36 hpiビオチン浸潤^4,6を選択します。ビオチンのインキュベーション期間はターゲット研究によって異なりますが、現在の実験によると、タンパク質の標識には8時間のインキュベーション期間が適しています。

5. サンプルの採取

注:ケラチン汚染を避けるために、サンプル収集用のすべての材料は無菌である必要があり、すべてのプロトコルステップは汚染のない環境で実行する必要があります。

1. 浸透した葉を切り取り、タンパク質の分解を避けるために液体窒素にすばやく移します。
2. イムノブロット分析によるタンパク質の事前検出⁶;これは、共免疫沈降(Co-IP)の前に強くお勧めします。

6. 葉からの総蛋白質の抽出

1. 乳棒と乳鉢を使用して葉を挽き、2 mLの1x PBS-BSA PH 7.4をすばやく加え、ゆっくりと挽きます。
2. 15 mLのコニカルチューブを用意し、コニカルチューブの上に急速ろ過材料フィルターを置き、サンプルミックスを急速ろ過材料フィルターを通してチューブに移し、氷上に保管します。
3. サンプルを 2 mL チューブに移し、1% プロテインインヒビターカクテルを加えます。
4. 内容物を上下に7〜8回回して混合し、1,000 x g で4°Cで2分間遠心分離します。
5. サンプルの上部溶媒を新しい 2 mL チューブに移し、10% β-D-マルトシド(β-D.M)を加え、氷上に 5 分間置きます。20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。

7. 脱塩カラムの平衡化

1. カラムを 1,000 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。
   注:カラムの片側に印を付け、すべての遠心分離プロセス中に印を付けた面が外側を向いていることを確認してください。
2. カラムの上部カバーと下部カバーを取り外し、1,000 x g で 4 °C で 2 分間遠心分離します。
3. カラムの回収チューブから液体溶液を廃棄し、洗浄用に 5 mL の 1x PBS バッファーを加えます。
4. カラムを 1,000 x g で 4 °C で 2 分間遠心分離します。
5. 手順 7.3 と 7.4 を少なくとも 5 回繰り返します。

8.磁気ビーズの洗浄

1. 1.5 mLのチューブを用意し、50 μLのストレプトアビジン-C1標識磁気ビーズを加えます。
2. 洗浄用に1x PBS-BSAを1 mL加え、十分に混合し、マグネットスタンドに3分間置きます。上澄みを捨てます。
3. 手順 8.2 を少なくとも 3 回繰り返します。
4. 洗浄のたびに、チューブを磁気ラックに置き、ビーズをチューブの片側に吸着させて洗浄バッファーを除去します。

9. ビオチン化蛋白質の濃縮

1. 2 mL のサンプルをカラムに加え、1,000 x g で 4 °C で 8 分間遠心分離します。
2. 脱塩したタンパク質抽出物1 mLを50 μLのストレプトアビジン-C1標識磁気ビーズに加え、平衡化します。
3. チューブを回転器に通常速度で置き、溶液が完全に混合し、室温(RT)で30分間インキュベートします。
4. ビーズを磁気ラックに室温で3分間、またはチューブの片側に集まるまで置き、上清を静かに除去します。
5. 1 mL の洗浄バッファー I(2% SDS 水溶液)を加え、ローテーター上で室温で 2 分間回転させ、ステップ 9.4 を繰り返します。
6. 1 mL の洗浄バッファー II(50 mM HEPES:pH = 7.5、500 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% デオキシコール酸 [w/v]、1% Triton X-100)を添加した後、チューブを室温で 2 分間ローテーター上に置きます。手順9.4を繰り返します。
7. 洗浄バッファーIII(10 mM Tris-HCl:pH = 7.4、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1%デオキシコール酸[w/v]、1%NP40 [v/v])1 mLを加え、室温で2分間シェーカーを使用して回転させます。次に、手順9.4を繰り返します。
8. 界面活性剤を除去するには、1.7 mL の 50 mM Tris-HCl(pH = 7.5)を加え、ステップ 9.4 を繰り返します。この手順をもう一度繰り返します。
9. 室温でビーズを 50 mM 重炭酸アンモニウム緩衝液 1 mL でそれぞれ 2 分間 6 回洗浄し、ステップ 9.4 を繰り返します。
10. 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、12%(w/v)スクロース(Suc)、2%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、1.5%(w/v)ジチオスレイトールを含むタンパク質抽出物50 μLをビーズに加え、インキュベーターで100°Cで5分間ヒートショックし、ステップ9.4に従います。上清を-80°Cで保存し、LC-MS/MS分析を行います。

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結果

これまでの研究によると、キュウリの遺伝子 APRR2 は、白色の未熟な果実の色を制御する候補遺伝子^である8。ここでは、キュウリ中の APRR2 の相互作用パートナータンパク質を見つけるための近接標識酵素としてAirIDを使用したプロトコルを開発しました。構築物をキュウリの葉に転写し、浸潤後36時間後にビオチンを転写した。48時間後、ウェスタンブロット分?...

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ディスカッション

今回の実験では、Kidoらが大規模なゲノムデータセットと5つの従来のBirA酵素^{5を用いて祖先}酵素を再構築するアルゴリズムによって開発した近接標識にAirIDを用いた。ランダム突然変異は、ランダム突然変異が動的な配列変化を生み出すことができないため^{、活性を高める}ために従来の進化的タンパク質工学で使用されました^9,10。?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% solution	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammonium bicarbonate	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G313BA0018
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Competent cells GV3101	Made in the current experiment
Desalting column	Thermo scientific	WC321753
Deoxycholic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G818BA0029
DH5α competent cells	Made in the current experiment		E.coli DH5α
β-D-maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	Quick filtration material filter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Protein inhibitor cocktail	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetic beads
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Tryptone	Thermo scientific	LP0042