Marcação de proximidade baseada em AirID para interação proteína-proteína em plantas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo passo-a-passo para a realização do experimento de marcação por proximidade (PL) em pepino (Cucumis sativus L.) usando AT4G18020 (APRR2)-proteína AirID como modelo. O método descreve a construção de um vetor, a transformação de um construto através de agroinfiltração, infiltração de biotina, extração de proteínas e purificação de proteínas marcadas com biotina através da técnica de purificação por afinidade.

Resumo

Em células e plantas de mamíferos, abordagens de marcação por proximidade (PL) usando ascorbato peroxidase modificada (APEX) ou a Escherichia coli biotina ligase BirA (conhecida como BioID) têm se mostrado bem-sucedidas na identificação de interações proteína-proteína (IBPs). APEX, BioID e TurboID, uma versão revisada do BioID têm algumas restrições, além de serem tecnologias valiosas. O recém-desenvolvido AirID, uma nova versão do BioID para identificação de proximidade em interações proteína-proteína, superou essas restrições. Anteriormente, o AirID foi usado em modelos animais, enquanto o estudo atual demonstra o uso do AirID em plantas, e os resultados confirmaram que o AirID tem melhor desempenho em sistemas vegetais em comparação com outras enzimas PL, como BioID e TurboID para marcação de proteínas que são proximais às proteínas-alvo. Aqui está um protocolo passo-a-passo para identificar parceiros de interação de proteínas usando a proteína AT4G18020 (APRR2) como modelo. Os métodos descrevem a construção de vetor, a transformação de construto através de agroinfiltração, transformação de biotina, extração de proteínas e enriquecimento de proteínas marcadas com biotina através da técnica de purificação por afinidade. Os resultados concluem que AirID é uma enzima nova e ideal para analisar IBPs em plantas. O método pode ser aplicado para estudar outras proteínas em plantas.

Introdução

Várias proteínas celulares trabalham sob o sistema biologicamente regulatório, e as interações proteína-proteína (IBPs) são uma parte deste sistema e a base de muitos processos celulares. Além dos IBPs, a função das proteínas naturais é promovida pós-traducionalmente através de várias modificações, tais como a formação de complexos, ubiquitinação e fosforilação. Portanto, o estudo dos IBPs é importante para o entendimento da possível função das proteínas-alvo. Os IBPs têm sido realizados utilizando várias tecnologias, tais como análise por espectrometria de massa após imunoprecipitação (análise IP-MS)¹, sistema de dois híbridos de levedura (Y2H)², também arranjos baseados em células^{livres 3}. Esses métodos exploraram várias descobertas vitais no campo da pesquisa. No entanto, esses métodos têm algumas desvantagens; por exemplo, o Y2H é uma estratégia demorada e cara que requer a construção da biblioteca Y2H da espécie-alvo.

Além disso, a técnica de Y2H usa levedura, um organismo eucariótico heterólogo de célula única, que não poderia refletir com precisão o estado celular de células eucarióticas superiores. O IP-MS é inadequado para proteínas de alta hidrofobicidade e apresenta baixa eficiência na captura de IBPs fracos. Várias proteínas essenciais em plantas, tais como domínio de ligação a nucleotídeos e proteínas contendo repetições ricas em leucina (NLR) e quinases semelhantes a receptores (RLKs) são expressas em um nível baixo e interagem principalmente com outras proteínas transitoriamente; portanto, o uso desses métodos é insuficiente para a compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação dessas proteínas³.

Uma nova técnica chamada biotinilação de proximidade (PB) ajuda os pesquisadores a identificar IBPs. O PB depende das enzimas PL, que se ligam à proteína de interesse (POI), e quando a proteína parceira se aproxima do POI, o PL anexa uma etiqueta química de biotina à proteína parceira. Além disso, a proteína marcada pode ser identificada e pode saber rapidamente qual proteína parceira se liga à proteína alvo⁵. Estudos anteriores comprovaram que o BioID e o TurboID são ferramentas de sucesso para IBPs, especialmente em plantas, mas apresentam certas limitações⁴. A BioID precisa de um alto nível de biotina para rotular proteínas parceiras, o que leva mais de 16 horas. Em comparação com o BioID, o TurboID é mais benéfico, pois rotula a proteína em 10 minutos e pode rotular a proteína parceira à temperatura ambiente (TR). Também é tóxico para as células em certas condições e marca aquelas proteínas que não mostram interação com a proteína de interesse.

Para superar esses problemas, o AirID, desenvolvido por Kido et al., é mais eficiente do que o resto das enzimas de marcação, embora a similaridade de sequência seja de 82% entre BioID e AirID⁵. Para verificar a eficiência do AirID, realizamos um experimento usando um POI com associados conhecidos. Este experimento confirmou que o AirID poderia, sem dúvida, rotular proteínas associadas em células vegetais. AirID é uma enzima valiosa para analisar IBPs in vitro e em células. Ele cria menos toxicidade e é menos errôneo em processos demorados do que o TurboID para marcar não-parceiros, levando à morte da célula. Isso demonstra que o AirID é mais competitivo do que outras enzimas de marcação para biotinilação de proximidade. É mais preciso, tem mais potencial em processos demorados e menos tóxico in vitro e em células vivas. O protocolo atual descreve a identificação de proteínas interativas de APRR2 usando AirID como uma enzima PL; além disso, o método pode ser aplicado a outras proteínas para investigar IBPs em espécies vegetais.

Protocolo

1. Preparação do material vegetal

1. Cucumis sativus (pepino) é empregado para análise experimental. Coloque as sementes em água, incube a 50 °C por 20 min e, em seguida, coloque as sementes em papel filtro em uma placa de Petri por 12-16 h.
2. Em seguida, transferir as sementes para vasos contendo solo (comprados comercialmente) e crescer em câmara climática à temperatura de 23 °C e fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h de escuro.
3. Manter as plantas na câmara climática por 3-4 semanas até que as plantas atinjam 3 ou 4 estágios foliares para uma agroinfiltração bem-sucedida.

2. Fazendo o AirID construir

1. Use APRR2 como uma proteína alvo e construa APRR2-AirID sob o promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (p35S: APRR2-AirID). Introduzi-lo no vetor binário compatível com Gateway pEarleyGate100⁶ (fornecido pela Dra. Kathrin Schrick, Kansas State University), e sintetizar a enzima PL diretamente de acordo com a sequência fornecida no Arquivo Suplementar 1.

3. Preparação de células competentes

1. Preparação de células competentes DH5α
   1. Inocular os 2 mL de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl; pH = 7,0.) com células de E.Coli DH5α (diretamente do estoque congelado sem descongelamento) e crescer durante a noite (O/N) a 37 °C.
   2. Inocular recentemente 0,1%-0,5% de inóculo da cultura de O/N em 100 mL de meio LB e crescer as células até que OD₆₀₀ atinja entre 0,4-0,6 e, em seguida, incubar a cultura a 4 °C por 30 min.
   3. Levar a cultura em dois tubos de centrífuga de 50 mL e girar a 2500 x g por 5 min a 4 °C.
   4. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 10 mL de CaCl 2 gelado 0,1 M e coloque no gelo por 15 min. Pellet as células com um spin de 2500 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Ressuspender as células em 1 mL de CaCl₂ 0,1 M gelado + glicerol a 20%, alíquota de 100 μL em cada tubo de 1,5 mL e armazená-las imediatamente a -80 °C.
2. Preparação de células competentes GV3101
   1. Inocular 2 mL de LB (contendo 50 μg/mL de gentamicina e 25 μg/mL de rifampicina) com uma única colônia GV3101. Incubar o O/N da cultura a 28 °C enquanto agita a 250 rpm.
   2. Inocular 200 mL de LB com 1 mL de cultura noturna saturada. Agitar a cultura a 250 rpm enquanto a incuba a 28 °C até que o OD₆₀₀ seja igual a 0,5.
   3. Transferir a cultura para quatro tubos de centrífuga estéreis de 50 mL pré-resfriados e colocar no gelo por 30 min.
   4. Pellet as células a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e coloque os pellets no gelo.
   5. Ressuspender as células em 10 mL de solução de CaCl₂ gelada 0,1 M. Junte as células em um tubo Oakridge pré-resfriado de 50 mL.
   6. Pelotar as células a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender as células em 10 ml de solução de CaCl₂ gelada. Coloque no gelo por 30 min.
   7. Pelotar as células a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender as células em 2 ml de solução de CaCl₂ gelada 0,1 M.
   8. Distribuir as células em uma alíquota de 50 μL em tubos de polipropileno estéreis pré-resfriados. Conservar as células a -80 °C.

4. Agroinfiltração

1. Primeiro, transferir o plasmídeo para a agrobactéria
   1. Transferir 2,5 μL do plasmídeo gerado da etapa 2.1 para as células competentes da cepa GV3101 do agrobacterium tumefaciens e incubar em gelo por 30 min.
   2. Transfira o tubo contendo o plasmídeo e as células competentes para nitrogênio líquido por 3 min.
   3. Choque térmico a 37 °C durante 5 min numa incubadora e, em seguida, colocar o tubo no gelo durante 2 minutos.
   4. Adicionar 1.000 μL de meio LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl; pH = 7,0) à agrobactéria e incubar a 30 °C e 118 rpm por 1 h.
   5. Centrifugar a 3.000 x g por 2 min a 4 °C.
   6. Eliminar os 800 μL superiores da solução e misturar a solução restante. Em seguida, plaqueá-lo em LB (como mencionado na etapa 4.1.4 adicionado com ágar e 50 μg/mL de canamicina para o plasmídeo e 50 μg/mL de gentamicina e 25 μg/mL de rifampicina para células competentes do GV3010). Incubar as placas a 30 °C durante 48 horas.
      OBS: É melhor escolher algumas colônias e realizar PCR para confirmar o gene de interesse⁷.
2. Recolher algumas colónias bacterianas das placas e colocá-las em meios LB mais antibióticos apropriados (ver passo 4.1.6). Incubar a 30 °C e 218 rpm durante 36-48 h.
3. Centrifugar as células a 3.000 x g por 2 min a 4 °C. Ressuspender as células para OD₆₀₀ = 1,0 em tampão de Agroinfiltração (10 mM MgCl₂, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosiringona).
4. Infiltrar-se no inóculo (gerado a partir do passo 4.3) na epiderme (abaxial) utilizando uma seringa sem agulha de 1 mL.
   NOTA: É melhor se infiltrar em toda a folha e optar por replicar. Para 4-5 plantas, use uma construção. Para cada folha, 1,5 mL de agrobactéria ressuspendida é suficiente.
5. Manter as plantas por 36 h na câmara climática com 16 h de luz (cerca de 75 μmol·^m-2·^s-1) e 8 h de fotoperíodo escuro a 23 °C.
6. Após 36 h de infiltração do construto, infiltrar-se 1 mL de Biotina 5 μM (em solução de MgCl₂ 10 mM) nas folhas já filtradas do construto.
7. Manter as plantas tratadas por mais 4-12 h antes de colher o tecido foliar.
   NOTA: De acordo com o estudo anterior, a proteína alvo atinge o pico em 36 h, então escolha infiltrações de biotina de 36 hpi ^4,6. A duração da incubação da biotina depende do estudo alvo, mas de acordo com o experimento atual, um período de incubação de 8 h é mais adequado para a marcação de proteínas.

5. Coleta de amostras

OBS: Todos os materiais para coleta de amostras devem ser estéreis para evitar contaminação por queratina, e todas as etapas do protocolo devem ser realizadas em ambiente livre de contaminação.

1. Corte as folhas infiltradas e transfira-as rapidamente para nitrogênio líquido para evitar a degradação proteica.
2. Realizar a pré-detecção de proteínas através de análises de immunoblot⁶; isso é altamente recomendado antes da Co-imunoprecipitação (Co-IP).

6. Extração de proteína total da folha

1. Triture as folhas usando pilão e argamassa, adicione rapidamente 2 mL de 1x PBS-BSA PH 7,4 e triture lentamente.
2. Pegue um tubo cônico de 15 mL, coloque um filtro de material de filtração rápida em cima do tubo cônico, transfira a mistura de amostra para o tubo através do filtro de material de filtração rápida e mantenha-o no gelo.
3. Transfira as amostras para um tubo de 2 mL e adicione 1% de coquetel inibidor de proteína.
4. Misture o conteúdo girando para cima e para baixo 7-8 vezes e centrifugar a 1.000 x g por 2 min a 4 °C.
5. Transfira o solvente superior das amostras para novos tubos de 2 mL, adicione 10% de β-D-maltosídeo (β-D.M) e coloque no gelo por 5 min. Centrifugar a 20.000 x g por 10 min a 4 °C.

7. Equilibre a coluna de dessalinização

1. Centrifugar a coluna a 1.000 x g durante 1 min a 4 °C.
   NOTA: Marque um lado da coluna e certifique-se de que o lado marcado está virado para fora durante todos os processos de centrifugação.
2. Retire a tampa superior e inferior da coluna e centrifuja a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.
3. Eliminar a solução líquida do tubo de recolha da coluna e adicionar 5 ml de tampão PBS 1x para lavagem.
4. Centrifugar a coluna a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.
5. Repita as etapas 7.3 e 7.4 pelo menos cinco vezes.

8. Lavagem de contas magnéticas

1. Pegue um tubo de 1,5 mL e adicione 50 μL de esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina-C1.
2. Adicione 1 mL de 1x PBS-BSA para lavar, misture bem e coloque no suporte do ímã por 3 min. Descarte o sobrenadante.
3. Repita a etapa 8.2 pelo menos três vezes.
4. Após cada lavagem, coloque o tubo no rack magnético para adsorver as contas em direção a um lado do tubo para remover o tampão de lavagem.

9. Enriquecimento de proteínas biotiniladas

1. Adicionar 2 ml das amostras à coluna e centrifugar a 1.000 x g durante 8 min a 4 °C.
2. Adicionar 1 mL do extrato proteico dessalgado a 50 μL de esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina-C1 para equilibrá-las.
3. Coloque o tubo no rotador à velocidade normal para que a solução se misture completamente e incube à temperatura ambiente (TR) durante 30 minutos.
4. Coloque as contas no rack magnético por 3 min em RT, ou até que se juntem em um lado do tubo, para remover suavemente o sobrenadante.
5. Adicionar 1 ml de tampão de lavagem I (SDS a 2% em água), rodar em RT durante 2 min num rotador e repetir o passo 9.4.
6. Colocar o tubo no rotador em RT por 2 min após a adição de 1 mL de tampão de lavagem II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% de ácido deoxicólico [p/v] e 1% Triton X-100). Repita a etapa 9.4.
7. Adicionar 1 mL de tampão de lavagem III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% ácido deoxicólico [p/v], 1% NP40 [v/v]) e girar usando um agitador por 2 min no TR. Em seguida, repita a etapa 9.4.
8. Para remover o detergente, adicionar 1,7 ml de Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5) e repetir o passo 9.4. Repita esta etapa mais uma vez.
9. Lavar as esferas seis vezes durante 2 min cada em 1 ml de tampão bicarbonato de amónio 50 mM em RT e repetir o passo 9.4.
10. Adicionar 50 μL do extracto proteico contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 12% (p/v) de sacarose (Suc), 2% (p/v) de lauril sulfato de lítio e 1,5% (p/v) de ditiotreitol às contas, fazer choque térmico na estufa a 100 °C durante 5 minutos e seguir o passo 9.4. Conservar o sobrenadante a -80 °C para análise de LC-MS/MS.

Resultados

De acordo com pesquisas anteriores, o gene do pepino APRR2 é o gene candidato que controla a cor branca do fruto^{imaturo 8}. Aqui, um protocolo foi desenvolvido usando AirID como uma enzima de marcação de proximidade para encontrar a proteína parceira interativa de APRR2 em pepino. A construção foi transferida para as folhas de pepino e, após 36 h após a infiltração, a biotina foi transferida. Após 48 h, as amostras foram coletadas para análise de western blot para conf...

Discussão

No experimento atual, o AirID foi usado para marcação por proximidade, que Kido e colaboradores desenvolveram através de um algoritmo de reconstrução enzimática ancestral usando um grande conjunto de dados genômicos e cinco enzimas BirA convencionais⁵. Mutações aleatórias foram usadas na engenharia evolutiva tradicional de proteínas para aumentar a atividade ^9,10, uma vez que mutações aleatórias não podem produzir mudanças ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% solution	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammonium bicarbonate	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G313BA0018
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Competent cells GV3101	Made in the current experiment
Desalting column	Thermo scientific	WC321753
Deoxycholic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G818BA0029
DH5α competent cells	Made in the current experiment		E.coli DH5α
β-D-maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	Quick filtration material filter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Protein inhibitor cocktail	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetic beads
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Tryptone	Thermo scientific	LP0042