Etichettatura di prossimità basata su AirID per l'interazione proteina-proteina nelle piante

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per eseguire l'esperimento di marcatura di prossimità (PL) nel cetriolo (Cucumis sativus L.) utilizzando AT4G18020 proteina (APRR2)-AirID come modello. Il metodo descrive la costruzione di un vettore, la trasformazione di un costrutto attraverso l'agroinfiltrazione, l'infiltrazione di biotina, l'estrazione di proteine e la purificazione di proteine marcate con biotina attraverso la tecnica di purificazione per affinità.

Abstract

Nelle cellule e nelle piante di mammifero, gli approcci di marcatura di prossimità (PL) che utilizzano l'ascorbato perossidasi modificata (APEX) o la biotina ligasi BirA di Escherichia coli (nota come BioID) si sono dimostrati efficaci nell'identificare le interazioni proteina-proteina (PPI). APEX, BioID e TurboID, una versione rivista di BioID, hanno alcune restrizioni oltre ad essere tecnologie preziose. L'AirID, una nuova versione di BioID per l'identificazione di prossimità nelle interazioni proteina-proteina, ha superato queste restrizioni. In precedenza, AirID è stato utilizzato in modelli animali, mentre l'attuale studio dimostra l'uso di AirID nelle piante e i risultati hanno confermato che AirID funziona meglio nei sistemi vegetali rispetto ad altri enzimi PL come BioID e TurboID per la marcatura delle proteine che sono prossimali alle proteine bersaglio. Ecco un protocollo passo-passo per identificare i partner di interazione proteica utilizzando la proteina AT4G18020 (APRR2) come modello. I metodi descrivono la costruzione del vettore, la trasformazione del costrutto attraverso l'agroinfiltrazione, la trasformazione della biotina, l'estrazione di proteine e l'arricchimento di proteine marcate con biotina attraverso la tecnica di purificazione per affinità. I risultati concludono che AirID è un enzima nuovo e ideale per l'analisi degli IPP nelle piante. Il metodo può essere applicato per studiare altre proteine nelle piante.

Introduzione

Varie proteine cellulari lavorano nell'ambito del sistema biologicamente regolatorio e le interazioni proteina-proteina (PPI) fanno parte di questo sistema e sono alla base di molti processi cellulari. Oltre agli IPP, la funzione delle proteine naturali è promossa post-traduzionalmente attraverso varie modificazioni come la formazione di complessi, l'ubiquitinazione e la fosforilazione. Pertanto, lo studio degli IPP è significativo per comprendere la possibile funzione delle proteine bersaglio. Gli IPP sono stati effettuati utilizzando varie tecnologie come l'analisi di spettrometria di massa dopo immunoprecipitazione (analisi IP-MS)¹, il sistema a due ibridi di lievito (Y2H)², anche array basati su cellule^{libere 3}. Questi metodi hanno esplorato varie scoperte vitali nel campo della ricerca. Tuttavia, questi metodi presentano alcuni inconvenienti; ad esempio, Y2H è una strategia dispendiosa in termini di tempo e denaro che richiede la costruzione della libreria Y2H della specie target.

Inoltre, la tecnica Y2H utilizza il lievito, un organismo eucariotico eterologo unicellulare, che non è in grado di riflettere accuratamente lo stato cellulare delle cellule eucariotiche superiori. L'IP-MS non è adatto per proteine ad alta idrofobicità e mostra una bassa efficienza nel catturare PPI deboli. Varie proteine essenziali nelle piante, come il dominio di legame dei nucleotidi e le proteine contenenti ripetizioni ricche di leucina (NLR) e le chinasi simili ai recettori (RLK), sono espresse a basso livello e interagiscono per lo più con altre proteine in modo transitorio; Pertanto, l'utilizzo di questi metodi non è sufficiente per comprendere i meccanismi alla base della regolazione di queste proteine³.

Una nuova tecnica chiamata biotinilazione di prossimità (PB) aiuta i ricercatori a identificare gli IPP. Il PB dipende dagli enzimi PL, che si legano alla proteina di interesse (POI), e quando la proteina partner si avvicina al POI, il PL attacca un tag chimico di biotina alla proteina partner. Inoltre, la proteina marcata può essere identificata e può sapere rapidamente quale proteina partner si attacca alla proteina^{bersaglio 5}. Studi precedenti hanno dimostrato che BioID e TurboID sono strumenti efficaci per gli IPP, soprattutto nelle piante, ma presentano alcuni limiti⁴. BioID ha bisogno di un alto livello di biotina per marcare le proteine partner, il che richiede più di 16 ore. Rispetto a BioID, il TurboID è più vantaggioso in quanto marca la proteina in 10 minuti e può etichettare la proteina partner a temperatura ambiente (RT). È anche tossico per le cellule in determinate condizioni e marca quelle proteine che non mostrano interazione con la proteina di interesse.

Per ovviare a questi problemi, AirID, sviluppato da Kido et al., è più efficiente del resto degli enzimi di marcatura, sebbene la somiglianza di sequenza sia dell'82% tra BioID e AirID⁵. Per verificare l'efficienza di AirID, abbiamo condotto un esperimento utilizzando un POI con associati noti. Questo esperimento ha confermato che AirID potrebbe senza dubbio marcare le proteine associate nelle cellule vegetali. AirID è un enzima prezioso per l'analisi degli IPP in vitro e nelle cellule. Crea meno tossicità ed è meno errato nei processi di tempo rispetto a TurboID per etichettare i non partner, portando all'uccisione della cellula. Dimostra che AirID è più competitivo di altri enzimi di marcatura per la biotinilazione di prossimità. È più accurato, ha un maggiore potenziale nei processi che richiedono tempo e meno tossico in vitro e nelle cellule viventi. L'attuale protocollo descrive l'identificazione di proteine interagenti di APRR2 utilizzando AirID come enzima PL; inoltre, il metodo può essere applicato ad altre proteine per studiare gli IPP nelle specie vegetali.

Protocollo

1. Preparazione del materiale vegetale

1. Cucumis sativus (cetriolo) viene impiegato per l'analisi sperimentale. Mettere i semi in acqua, incubare a 50 °C per 20 min, quindi mettere i semi su carta da filtro su una piastra di Petri per 12-16 h.
2. Successivamente, trasferite i semi in vasi contenenti terriccio (acquistati in commercio) e coltivate in una camera climatica a 23 °C di temperatura e 16 ore di luce e 8 ore di fotoperiodo buio.
3. Mantenere le piante nella camera climatica per 3-4 settimane fino a quando le piante raggiungono i 3 o 4 stadi fogliari per una corretta agroinfiltrazione.

2. Creazione di un costrutto AirID

1. Utilizzare APRR2 come proteina bersaglio e costruire APRR2-AirID sotto il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore (p35S: APRR2-AirID). Introdurlo nel vettore binario compatibile con Gateway pEarleyGate100⁶ (fornito dalla Dott.ssa Kathrin Schrick, Kansas State University) e sintetizzare l'enzima PL direttamente secondo la sequenza fornita nel File Supplementare 1.

3. Preparazione di cellule competenti

1. Preparazione di celle competenti DH5α
   1. Inoculare i 2 mL di LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 10 g/L di NaCl; pH = 7,0.) con cellule di E.Coli DH5α (direttamente dal brodo congelato senza scongelamento) e far crescere per una notte (O/N) a 37 °C.
   2. Inoculare appena lo 0,1%-0,5% di inoculo dalla coltura O/N in 100 mL di terreno LB e far crescere le cellule fino a quando OD₆₀₀ raggiunge tra 0,4-0,6, quindi incubare la coltura a 4 °C per 30 min.
   3. Versare la coltura in due provette da centrifuga da 50 mL e centrifugare a 2500 x g per 5 minuti a 4 °C.
   4. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 10 mL di CaCl₂ ghiacciato 0,1 M e mettere in ghiaccio per 15 min. Pellet le celle con una centrifuga di 2500 x g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Risospendere le cellule in 1 mL di CaCl_0,1 M ghiacciato 2 + 20% di glicerolo, aliquotare 100 μL in ciascuna provetta da 1,5 mL e conservarle immediatamente a -80 °C.
2. Preparazione di celle competenti GV3101
   1. Inoculare 2 mL di LB (contenenti 50 μg/mL di gentamicina e 25 μg/mL di rifampicina) con una singola colonia GV3101. Incubare l'O/N di coltura a 28 °C agitando a 250 giri/min.
   2. Inoculare 200 mL di LB con 1 mL di una coltura satura durante la notte. Agitare la coltura a 250 giri/min incubandola a 28 °C fino a quando il diametro esterno₆₀₀ è uguale a 0,5.
   3. Trasferire la coltura in quattro provette da centrifuga sterili da 50 ml pre-raffreddate e mettere su ghiaccio per 30 minuti.
   4. Pellet le cellule a 2500 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e mettere i pellet sul ghiaccio.
   5. Risospendere le cellule in 10 mL di soluzione 0,1 M di CaCl₂ ghiacciata. Raggruppare le cellule in una provetta Oakridge da 50 ml pre-raffreddata.
   6. Pellet le cellule a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di soluzione ghiacciata di CaCl₂ . Mettere in ghiaccio per 30 min.
   7. Pellet le cellule a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione 0,1 M di CaCl₂ ghiacciata.
   8. Erogare le cellule in un'aliquota da 50 μL in provette sterili di polipropilene pre-raffreddate. Conservare le celle a -80 °C.

4. Agroinfiltrazione

1. Innanzitutto, trasferisci il plasmide all'agrobatterio
   1. Trasferire 2,5 μL del plasmide generato dalla fase 2.1 alle cellule competenti del ceppo di agrobacterium tumefaciens GV3101 e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
   2. Trasferire la provetta contenente il plasmide e le cellule competenti in azoto liquido per 3 min.
   3. Shock termico a 37 °C per 5 minuti in un'incubatrice, quindi mettere la provetta sul ghiaccio per 2 minuti.
   4. Aggiungere 1.000 μL di terreno LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 10 g/L di NaCl; pH = 7,0) all'agrobatterio e incubare a 30 °C e 118 giri/min per 1 ora.
   5. Centrifugare a 3.000 x g per 2 minuti a 4 °C.
   6. Eliminare gli 800 μL superiori della soluzione e miscelare la soluzione rimanente. Quindi, piastarlo su LB (come menzionato nel passaggio 4.1.4 aggiunto con agar e 50 μg/mL di Kanamicina per il plasmide e 50 μg/mL di gentamicina e 25 μg/mL di rifampicina per le cellule competenti GV3010). Incubare le piastre a 30 °C per 48 ore.
      NOTA: È meglio prelevare alcune colonie ed eseguire la PCR per confermare il gene di interesse⁷.
2. Prelevare alcune colonie batteriche dalle piastre e metterle in terreni LB più antibiotici appropriati (vedere il passaggio 4.1.6). Incubare a 30 °C e 218 rpm per 36-48 h.
3. Centrifugare le cellule a 3.000 x g per 2 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule a OD₆₀₀ = 1.0 in tampone di agroinfiltrazione (10 mM MgCl₂, 10 mM MES, pH = 5.6, 250 μM acetosiringone).
4. Infiltrare l'inoculo (generato dal punto 4.3) nell'epidermide (abassiale) utilizzando una siringa senza ago da 1 ml.
   NOTA: è meglio infiltrarsi nell'intera foglia e scegliere di replicare. Per 4-5 piante, usa un costrutto. Per ogni foglia sono sufficienti 1,5 ml di agrobatteri risospesi.
5. Mantenere le piante per 36 ore nella camera climatica con un fotoperiodo di 16 ore di luce (circa 75 μmol·^m-2·^s-1) e 8 ore di buio a 23 °C.
6. Dopo 36 ore di infiltrazione del costrutto, infiltrare 1 mL di 5 μM di Biotina (in una soluzione di 10 mM di MgCl₂ ) nelle foglie già filtrate del costrutto.
7. Mantenere le piante trattate per altre 4-12 ore prima di raccogliere il tessuto fogliare.
   NOTA: Secondo lo studio precedente, la proteina bersaglio raggiunge il picco a 36 ore, quindi scegli 36 infiltrazioni di biotina hpi ^4,6. La durata dell'incubazione per la biotina dipende dallo studio target, ma secondo l'attuale esperimento, un periodo di incubazione di 8 ore è più adatto per marcare le proteine.

5. Raccolta dei campioni

NOTA: Tutti i materiali per la raccolta dei campioni devono essere sterili per evitare la contaminazione da cheratina e tutte le fasi del protocollo devono essere eseguite in un ambiente privo di contaminazioni.

1. Tagliare le foglie infiltrate e trasferirle rapidamente in azoto liquido per evitare la degradazione delle proteine.
2. Eseguire la pre-rilevazione delle proteine attraverso analisi immunoblot⁶; questo è altamente raccomandato prima della co-immunoprecipitazione (Co-IP).

6. Estrazione proteica totale dalla foglia

1. Macinare le foglie con un pestello e un mortaio, aggiungere rapidamente 2 ml di 1x PBS-BSA PH 7.4 e macinare lentamente.
2. Prendi una provetta conica da 15 mL, posiziona un filtro per materiale filtrante rapido sopra la provetta conica, trasferisci la miscela del campione nella provetta attraverso il filtro per materiale filtrante rapido e tienila sul ghiaccio.
3. Trasferire i campioni in una provetta da 2 ml e aggiungere un cocktail di inibitori proteici all'1%.
4. Mescolare il contenuto girando verso l'alto e verso il basso 7-8 volte e centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C.
5. Trasferire il solvente superiore dei campioni in nuove provette da 2 mL, aggiungere il 10% di β-D-maltoside (β-DM) e mettere su ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C.

7. Equilibrare la colonna di desalinizzazione

1. Centrifugare la colonna a 1.000 x g per 1 minuto a 4 °C.
   NOTA: Contrassegnare un lato della colonna e assicurarsi che il lato contrassegnato sia rivolto verso l'esterno durante tutti i processi di centrifugazione.
2. Rimuovere il coperchio superiore e inferiore della colonna e centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C.
3. Scartare la soluzione liquida dalla provetta di raccolta della colonna e aggiungere 5 mL di 1x tampone PBS per il lavaggio.
4. Centrifugare la colonna a 1.000 x g per 2 minuti a 4 °C.
5. Ripetere i passaggi 7.3 e 7.4 almeno cinque volte.

8. Lavaggio delle perle magnetiche

1. Prendi una provetta da 1,5 mL e aggiungi 50 μL di microsfere magnetiche coniugate con streptavidina-C1.
2. Aggiungere 1 mL di 1x PBS-BSA per il lavaggio, mescolare accuratamente e posizionare sul supporto magnetico per 3 minuti. Scartare il surnatante.
3. Ripetere il passaggio 8.2 almeno tre volte.
4. Dopo ogni lavaggio, posizionare il tubo sul rack magnetico per adsorbire le perline verso un lato del tubo per rimuovere il tampone di lavaggio.

9. Arricchimento di proteine biotinilate

1. Aggiungere 2 mL di campioni alla colonna e centrifugare a 1.000 x g per 8 minuti a 4 °C.
2. Aggiungere 1 mL dell'estratto proteico dissalato a 50 μL di microsfere magnetiche coniugate con streptavidina-C1 per equilibrarle.
3. Posizionare la provetta sul rotatore a velocità normale in modo che la soluzione si mescoli completamente e incubi a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti.
4. Posizionare le perline sulla griglia magnetica per 3 minuti a RT, o fino a quando non si raccolgono su un lato della provetta, per rimuovere delicatamente il surnatante.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio I (2% SDS in acqua), ruotare a RT per 2 minuti su un rotatore e ripetere il passaggio 9.4.
6. Posizionare la provetta sul rotatore a RT per 2 minuti dopo aver aggiunto 1 mL di tampone di lavaggio II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% acido desossicolico [p/v] e 1% Triton X-100). Ripetere il passaggio 9.4.
7. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% acido desossicolico [p/v], 1% NP40 [v/v]) e ruotare con uno shaker per 2 minuti a RT. Quindi, ripetere il passaggio 9.4.
8. Per rimuovere il detersivo, aggiungere 1,7 mL di Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5) e ripetere il passaggio 9.4. Ripeti questo passaggio ancora una volta.
9. Lavare le perle sei volte per 2 minuti ciascuna in 1 mL di tampone di bicarbonato di ammonio da 50 mM a RT e ripetere il passaggio 9.4.
10. Aggiungere 50 μL di estratto proteico contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 12% (p/v) saccarosio (Suc), 2% (p/v) litio laurilsolfato e 1,5% (p/v) ditiotreitolo alle sfere, shock termico nell'incubatore a 100 °C per 5 minuti e seguire il passaggio 9.4. Conservare il surnatante a -80 °C per l'analisi LC-MS/MS.

Risultati

Secondo ricerche precedenti, il gene del cetriolo APRR2 è il gene candidato che controlla il colore bianco immaturo^{del frutto 8}. Qui, è stato sviluppato un protocollo che utilizza AirID come enzima di marcatura di prossimità per trovare la proteina partner interagente di APRR2 nel cetriolo. Il costrutto è stato trasferito sulle foglie di cetriolo e, dopo 36 ore dall'infiltrazione, la biotina è stata trasferita. Dopo 48 ore i campioni sono stati prelevati per l'analisi wester...

Discussione

Nell'attuale esperimento, AirID è stato utilizzato per l'etichettatura di prossimità, che Kido et al. hanno sviluppato attraverso un algoritmo di ricostruzione enzimatica ancestrale utilizzando un ampio set di dati del genoma e cinque enzimi BirA^{convenzionali 5}. Le mutazioni casuali sono state utilizzate nell'ingegneria proteica evolutiva tradizionale per migliorare l'attività ^9,10 poiché le mutazioni casuali non possono produrre cambi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% solution	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammonium bicarbonate	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G313BA0018
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Competent cells GV3101	Made in the current experiment
Desalting column	Thermo scientific	WC321753
Deoxycholic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G818BA0029
DH5α competent cells	Made in the current experiment		E.coli DH5α
β-D-maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	Quick filtration material filter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Protein inhibitor cocktail	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetic beads
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Tryptone	Thermo scientific	LP0042