식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

요약

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

초록

포유류 세포와 식물에서 변형된 아스코르브산염 과산화효소(APEX) 또는 대장균 비오틴 리가아제 BirA(BioID로 알려짐)를 사용하는 근접 표지(PL) 접근법은 단백질-단백질 상호 작용(PPI)을 식별하는 데 성공적인 것으로 입증되었습니다. APEX, BioID 및 BioID의 개정판인 TurboID는 가치 있는 기술일 뿐만 아니라 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 최근 개발된 AirID는 단백질-단백질 상호 작용에서 근접 식별을 위한 BioID의 새로운 버전으로, 이러한 제한을 극복했습니다. 기존에는 동물 모델에서 AirID를 사용했으나, 이번 연구에서는 식물에서 AirID를 사용하는 것을 입증했으며, 그 결과 AirID가 표적 단백질에 근접한 단백질 라벨링을 위해 BioID 및 TurboID와 같은 다른 PL 효소에 비해 식물 시스템에서 더 나은 성능을 발휘한다는 것을 확인했습니다. 다음은 AT4G18020(APRR2) 단백질을 모델로 사용하여 단백질 상호 작용 파트너를 식별하기 위한 단계별 프로토콜입니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변환, 비오틴 변환, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 농축을 설명합니다. 그 결과 AirID는 식물의 PPI를 분석하기 위한 새롭고 이상적인 효소라는 결론을 내렸습니다. 이 방법은 식물의 다른 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

서문

다양한 세포 단백질은 생물학적으로 조절되는 시스템 하에서 작용하며, 단백질-단백질 상호작용(PPI)은 이 시스템의 일부이자 많은 세포 과정의 기초입니다. PPI 외에도 천연 단백질의 기능은 복합체, 유비퀴틴화 및 인산화의 형성과 같은 다양한 변형을 통해 번역 후 촉진됩니다. 따라서 PPI를 연구하는 것은 표적 단백질의 가능한 기능을 이해하는 데 중요합니다. PPI는 면역침전 후 질량 분석 분석(IP-MS 분석)¹, 효모 2 하이브리드 시스템(Y2H)², 무세포 기반 어레이³와 같은 다양한 기술을 사용하여 수행되었습니다. 이러한 방법은 연구 분야에서 다양한 중요한 발견을 탐구했습니다. 그러나 이러한 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, Y2H는 대상 종의 Y2H 라이브러리를 구축해야 하는 시간과 비용이 많이 드는 전략입니다.

또한 Y2H 기술은 이종 단세포 진핵 생물인 효모를 사용하여 고등 진핵 세포의 세포 상태를 정확하게 반영할 수 없습니다. IP-MS는 소수성이 높은 단백질에 적합하지 않으며 약한 PPI를 포획하는 데 낮은 효율을 보입니다. 뉴클레오티드 결합 도메인, 류신이 풍부한 반복 함유(NLR) 단백질 및 수용체 유사 키나아제(RLK)와 같은 식물의 다양한 필수 단백질은 낮은 수준에서 발현되며 대부분 다른 단백질과 일시적으로 상호 작용합니다. 따라서 이러한 방법을 사용하는 것은 이러한 단백질의 조절의 기저에 있는 메커니즘을 이해하기에 충분하지 않습니다³.

근접 비오틴화(PB)라는 새로운 기술은 연구자들이 PPI를 식별하는 데 도움이 됩니다. PB는 관심 단백질(POI)에 부착되는 PL 효소에 의존하며, 파트너 단백질이 POI에 가까워지면 PL은 파트너 단백질에 화학적 비오틴 태그를 부착합니다. 또한, 태그된 단백질을 식별할 수 있으며, 어떤 파트너 단백질이 표적 단백질에 부착되는지 신속하게 알 수 있다⁵. 이전 연구에서는 BioID와 TurboID가 특히 식물에서 PPI를 위한 성공적인 도구임이 입증되었지만 특정 한계가 있습니다⁴. BioID는 파트너 단백질을 라벨링하기 위해 높은 수준의 비오틴이 필요하며, 이는 16시간 이상 소요됩니다. BioID에 비해 TurboID는 10분 안에 단백질을 라벨링하고 실온(RT)에서 파트너 단백질을 라벨링할 수 있기 때문에 더 유리합니다. 또한 특정 조건에서 세포에 독성이 있으며 관심 단백질과 상호 작용하지 않는 단백질에 태그를 붙입니다.

이러한 문제를 극복하기 위해 Kido 등이 개발한 AirID는 BioID와 AirID⁵ 간의 염기서열 유사성이 82%이지만 나머지 라벨링 효소보다 더 효율적입니다. AirID의 효율성을 확인하기 위해 알려진 동료와 함께 POI를 사용하여 실험을 수행했습니다. 이 실험은 AirID가 의심할 여지 없이 식물 세포의 관련 단백질을 라벨링할 수 있음을 확인했습니다. AirID는 체외 및 세포에서 PPI를 분석하는 데 유용한 효소입니다. TurboID보다 독성이 적고 파트너가 아닌 사람을 태그하는 데 걸리는 시간이 적어 세포를 죽일 수 있습니다. 이는 AirID가 근접 비오틴화에 대해 다른 라벨링 효소보다 더 경쟁력이 있음을 보여줍니다. 더 정확하고, 시간이 걸리는 과정에서 더 많은 잠재력을 가지고 있으며, 시험관 내 및 살아있는 세포에서 독성이 적습니다. 현재 프로토콜은 AirID를 PL 효소로 사용하여 APRR2의 상호 작용 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 또한, 이 방법은 식물 종의 PPI를 조사하기 위해 다른 단백질에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 식물 재료의 준비

1. Cucumis sativus (오이)는 실험 분석에 사용됩니다. 씨앗을 물에 넣고 50 °C에서 20 분 동안 배양 한 다음 12-16 시간 동안 페트리 판의 여과지에 씨앗을 놓습니다.
2. 그 후, 씨앗을 토양이 들어있는 화분 (상업적으로 구입)으로 옮기고 23 °C 온도와 16 시간 밝은 광주기 및 8 시간 어두운 광주기의 기후 챔버에서 자랍니다.
3. 성공적인 아그로인 침투를 위해 식물이 3 또는 4 잎 단계에 도달 할 때까지 3-4 주 동안 기후 챔버에서 식물을 유지하십시오.

2. AirID 구성

1. APRR2를 표적 단백질로 사용하고 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S promoter(p35S: APRR2-AirID)로 APRR2-AirID를 구축합니다. 이를 Gateway 호환 이진 벡터 pEarleyGate100⁶(캔자스 주립 대학의 Kathrin Schrick 박사 제공)에 도입하고 보충 파일 1에 제공된 서열에 따라 PL 효소를 직접 합성합니다.

3. 유능한 세포의 준비

1. DH5α competent cell의 제조
   1. 2mL의 LB(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, pH = 7.0)를 대장균 DH5α 세포(해동하지 않고 냉동 육수에서 직접)와 함께 접종하고 37°C에서 밤새 성장(O/N)합니다.
   2. O/N 배양액의 0.1%-0.5% 접종물을 100mL의 LB 배지에 새로 접종하고 OD₆₀₀ 이 0.4-0.6 사이가 될 때까지 세포를 성장시킨 다음 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 배양액을 2개의 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 4°C에서 5분 동안 2500 x g으로 회전시킵니다.
   4. 상층액을 버리고 세포를 10mL의 0.1M 얼음처럼 차가운_CaCl2에 재현탁시키고 15분 동안 얼음 위에 둡니다. 2500 x g 의 셀을 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다.
   5. 1mL의 얼음처럼 차가운 0.1M CaCl₂ + 20% 글리세롤에 세포를 재현탁시키고 각 1.5mL 튜브에 100μL를 분취시키고 즉시 -80°C에서 보관합니다.
2. GV3101 competent cell의 제조
   1. 2mL의 LB(겐타마이신 50μg/mL 및 리팜피신 25μg/mL 함유)를 단일 GV3101 콜로니로 접종합니다. 250rpm에서 흔들면서 28°C에서 배양액 O/N을 배양합니다.
   2. LB 200mL를 포화 하룻밤 배양액 1mL와 함께 접종합니다. OD 250이 28°C에서 배양하면서_600rpm 에서 배양액을 0.5로 흔듭니다.
   3. 배양액을 사전 냉각된 멸균 50mL 원심분리 튜브 4개로 옮기고 얼음 위에서 30분 동안 발효합니다.
   4. 세포를 2500 x g에서 4°C에서 10분 동안 펠렛합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다.
   5. 세포를 10mL의 0.1M 얼음처럼 차가운 CaCl₂ 용액에 재현탁시킵니다. 세포를 미리 냉각된 50mL Oakridge 튜브 하나에 함께 모읍니다.
   6. 세포를 1,000 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛합니다. 상층액을 버리고 10mL의 얼음처럼 차가운 CaCl₂ 용액에 세포를 재현탁시킵니다. 얼음 위에 30분 동안 놓습니다.
   7. 세포를 1,000 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛합니다. 상층액을 버리고 2mL의 0.1M 얼음처럼 차가운_CaCl2 용액에 세포를 재현탁시킵니다.
   8. 세포를 사전 냉각된 멸균 폴리프로필렌 튜브에서 50μL 부분 표본으로 분주합니다. 셀을 -80 °C에서 보관하십시오.

4. 농업 침투

1. 먼저, 플라스미드를 아그로박테리아(agrobacterium)로 옮깁니다
   1. 2.1단계에서 생성된 플라스미드 2.5μL를 agrobacterium tumefaciens GV3101 균주의 competent cell에 옮기고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 플라스미드와 competent cell이 들어있는 튜브를 액체 질소로 3분 동안 옮깁니다.
   3. 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 열충격을 가한 다음 튜브를 얼음 위에 2분 동안 놓습니다.
   4. 1,000μLof LB 배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, pH = 7.0)를 아그로박테리움에 넣고 30°C 및 118rpm에서 1시간 동안 배양합니다.
   5. 3,000 x g 에서 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리합니다.
   6. 용액의 상단 800μL를 버리고 나머지 용액을 혼합합니다. 그런 다음 LB에 플레이트를 올립니다(4.1.4단계에서 언급한 바와 같이 플라스미드의 경우 한천과 50μg/mL 카나마이신, GV3010 유능한 세포의 경우 50μg/mL 겐타마이신 및 25μg/mL 리팜피신을 첨가). 플레이트를 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.
      참고: 관심 유전자를 확인하기 위해 일부 콜로니를 선택하고 PCR을 수행하는 것이 좋습니다⁷.
2. 플레이트에서 일부 박테리아 콜로니를 집어 LB 배지와 적절한 항생제에 넣습니다(4.1.6단계 참조). 30 °C 및 218 rpm에서 36-48 시간 동안 배양합니다.
3. 세포를 3,000 x g에서 2분 4°C 동안 원심분리합니다. 아그로인 여과 완충액(10 mM MgCl₂, 10 mM MES, pH = 5.6, 250 μM 아세토시링곤)에서 세포를 OD₆₀₀ = 1.0으로 재현탁시킵니다.
4. 1mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 (abaxial) 표피의 접종물(4.3단계에서 생성)을 침투시킵니다.
   참고 : 전체 리프에 침투하고 복제를 선택하는 것이 좋습니다. 4-5개의 식물에 대해 하나의 구조를 사용합니다. 각 잎에 대해 1.5mL의 재현탁 농균이면 충분합니다.
5. 23°C에서 16시간 빛(약 75μmol·^m-2·^s-1)과 8시간 어두운 광주기로 기후 챔버에서 36시간 동안 식물을 유지합니다.
6. 36시간의 작제물 침투 후 1mL의 5μM 비오틴(10mM_MgCl2 용액)을 이미 여과된 작제물의 잎에 침투시킵니다.
7. 잎 조직을 수확하기 전에 처리된 식물을 추가로 4-12시간 동안 유지합니다.
   참고: 이전 연구에 따르면 표적 단백질은 36시간에 최고조에 달하므로 36hpi 비오틴 침투 ^4,6을 선택하십시오. 비오틴의 배양 기간은 대상 연구에 따라 다르지만 현재 실험에 따르면 8시간의 배양 기간이 단백질 라벨링에 더 적합합니다.

5. 샘플 수집

참고: 검체 채취를 위한 모든 물질은 케라틴 오염을 방지하기 위해 멸균되어야 하며, 모든 프로토콜 단계는 오염이 없는 환경에서 수행되어야 합니다.

1. 침투된 잎을 자르고 빠르게 액체 질소로 옮겨 단백질 분해를 방지합니다.
2. 면역블롯 분석을 통한 단백질의 사전 검출^{수행 6}; 이것은 Co-immunoprecipitation(Co-IP) 전에 적극 권장됩니다.

6. 잎에서 총 단백질 추출

1. 유봉과 절구를 사용하여 잎을 갈고 2x PBS-BSA PH 7.4 1mL를 빠르게 넣고 천천히 갈아줍니다.
2. 15mL 원뿔형 튜브를 가져다가 원뿔형 튜브 위에 급속 여과 재료 필터를 놓고 빠른 여과 재료 필터를 통해 샘플 혼합물을 튜브로 옮긴 다음 얼음 위에 보관합니다.
3. 샘플을 2mL 튜브로 옮기고 1% 단백질 억제제 칵테일을 추가합니다.
4. 내용물을 상하로 7-8회 돌려 혼합하고 1,000 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다.
5. 샘플의 상부 용매를 새 2mL 튜브로 옮기고 10% β-D-말토사이드(β-DM)를 넣고 얼음 위에 5분 동안 둡니다. 20,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.

7. 탈염 컬럼의 평형을 맞춥니다

1. 컬럼을 1,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리합니다.
   알림: 컬럼의 한쪽을 표시하고 모든 원심분리 과정에서 표시된 면이 바깥쪽을 향하도록 합니다.
2. 컬럼의 상단 및 하단 커버를 제거하고 4°C에서 2분 동안 1,000 x g 의 원심분리기를 제거합니다.
3. 컬럼의 수집 튜브에서 액체 용액을 버리고 세척을 위해 5mL의 1x PBS 완충액을 추가합니다.
4. 컬럼을 1,000 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다.
5. 7.3단계와 7.4단계를 5회 이상 반복합니다.

8. 자석 구슬 세척

1. 1.5mL 튜브에 50μL의 스트렙타비딘-C1 복합 마그네틱 비드를 추가합니다.
2. 세척을 위해 1x PBS-BSA 1mL를 넣고 잘 섞은 다음 자석 스탠드에 3분 동안 놓습니다. 상층액을 버리십시오.
3. 8.2단계를 세 번 이상 반복합니다.
4. 세탁할 때마다 튜브를 마그네틱 랙에 올려 비드를 튜브의 한쪽으로 흡착시켜 세탁 버퍼를 제거합니다.

9. 비오틴화 단백질의 농축

1. 시료 2mL를 컬럼에 넣고 4°C에서 8분 동안 1,000 x g 으로 원심분리합니다.
2. 탈염된 단백질 추출물 1mL를 50μL의 스트렙타비딘-C1 복합 마그네틱 비드에 첨가하여 평형을 이룹니다.
3. 튜브를 정상 속도로 로테이터에 올려 용액이 완전히 혼합되고 실온(RT)에서 30분 동안 배양되도록 합니다.
4. 비드를 마그네틱 랙에 놓고 RT에서 3분 동안 또는 튜브의 한쪽에 모일 때까지 올려 상층액을 부드럽게 제거합니다.
5. 세척 완충액 I 1mL(물에 2% SDS)를 첨가하고 회전기에서 2분 동안 상온으로 회전하고 9.4단계를 반복합니다.
6. 세척 완충액 II 1mL(50mM HEPES: pH = 7.5, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1% 데옥시콜산[w/v] 및 1% Triton X-100)를 추가한 후 튜브를 RT에서 2분 동안 놓습니다. 9.4단계를 반복합니다.
7. 세척 완충액 III 1mL(10mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250mM LiCl, 1mM EDTA, 0.1% 데옥시콜산[w/v], 1% NP40[v/v])를 넣고 셰이커를 사용하여 RT에서 2분 동안 회전합니다. 그런 다음 9.4단계를 반복합니다.
8. 세제를 제거하려면 1.7mM Tris-HCl 50 (pH = 7.5)를 넣고 9.4 단계를 반복하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
9. RT에서 50mM 중탄산 암모늄 완충액 1mL에서 각각 2분 동안 비드를 6회 세척하고 9.4단계를 반복합니다.
10. 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 12 % (w / v) 자당 (Suc), 2 % (w / v) 리튬 라 우릴 설페이트 및 1.5 % (w / v) 디티 오 트레이톨을 함유 한 단백질 추출물 50 μL를 비드에 첨가하고 100 ° C에서 5 분 동안 인큐베이터에서 열 충격을 가하고 9.4 단계를 따릅니다. LC-MS/MS 분석을 위해 상층액을 -80°C에서 보관합니다.

결과

선행 연구에 따르면, 오이 유전자 APRR2 는 백색의 미성숙 과일 색을 조절하는 후보 유전자이다⁸. 여기서는 오이에서 APRR2 의 상호작용 파트너 단백질을 찾기 위해 AirID를 근접 표지 효소로 사용하는 프로토콜을 개발했습니다. 작제물을 오이 잎으로 옮기고, 침투 후 36시간 후, 비오틴을 옮겼다. 48시간 후 성공적인 형질전환을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘...

토론

이번 실험에서 AirID는 근접 라벨링에 사용되었으며, Kido 등은 대규모 게놈 데이터 세트와 5개의 기존 BirA 효소를 사용하여 조상 효소 재구성 알고리즘을 통해 개발했습니다⁵. 무작위 돌연변이는 동적 서열 변화를 일으킬 수 없기 때문에 활성 ^9,10을 향상시키기 위해 전통적인 진화 단백질 공학에서 무작위 돌연변이가 사용되었습니다. 다...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% solution	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammonium bicarbonate	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G313BA0018
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Competent cells GV3101	Made in the current experiment
Desalting column	Thermo scientific	WC321753
Deoxycholic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G818BA0029
DH5α competent cells	Made in the current experiment		E.coli DH5α
β-D-maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	Quick filtration material filter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Protein inhibitor cocktail	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetic beads
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Tryptone	Thermo scientific	LP0042