Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

Résumé

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour réaliser l’expérience de marquage de proximité (PL) chez le concombre (Cucumis sativus L.) en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2)-AirID comme modèle. La méthode décrit la construction d’un vecteur, la transformation d’une construction par agroinfiltration, l’infiltration de biotine, l’extraction de protéines et la purification de protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité.

Résumé

Dans les cellules et les plantes de mammifères, les approches de marquage de proximité (PL) utilisant l’ascorbate peroxydase modifiée (APEX) ou la biotine ligase BirA d’Escherichia coli (connue sous le nom de BioID) se sont avérées efficaces pour identifier les interactions protéine-protéine (IPP). APEX, BioID et TurboID, une version révisée de BioID, ont certaines restrictions en plus d’être des technologies précieuses. L’AirID, une nouvelle version de BioID récemment développée pour l’identification de proximité dans les interactions protéine-protéine, a permis de surmonter ces restrictions. Auparavant, AirID a été utilisé dans des modèles animaux, tandis que l’étude actuelle démontre l’utilisation d’AirID dans les plantes, et les résultats ont confirmé qu’AirID fonctionne mieux dans les systèmes végétaux par rapport à d’autres enzymes PL telles que BioID et TurboID pour le marquage des protéines qui sont proches des protéines cibles. Voici un protocole étape par étape pour identifier les partenaires d’interaction protéique en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2) comme modèle. Les méthodes décrivent la construction du vecteur, la transformation de la construction par agroinfiltration, la transformation de la biotine, l’extraction des protéines et l’enrichissement des protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité. Les résultats concluent qu’AirID est une enzyme nouvelle et idéale pour analyser les IPP chez les plantes. La méthode peut être appliquée à l’étude d’autres protéines dans les plantes.

Introduction

Diverses protéines cellulaires fonctionnent dans le cadre du système de régulation biologique, et les interactions protéine-protéine (IPP) font partie de ce système et sont à la base de nombreux processus cellulaires. Outre les IPP, la fonction des protéines naturelles est favorisée post-traductionnellement par diverses modifications telles que la formation de complexes, l’ubiquitination et la phosphorylation. Par conséquent, l’étude des IPP est importante pour comprendre la fonction possible des protéines cibles. Les IPP ont été réalisés à l’aide de diverses technologies telles que l’analyse par spectrométrie de masse après immunoprécipitation (analyse IP-MS)¹, le système à deux hybrides de levure (Y2H)², ainsi que les puces acellulaires³. Ces méthodes ont permis d’explorer diverses découvertes vitales dans le domaine de la recherche. Cependant, ces méthodes présentent certains inconvénients ; par exemple, l’an 202 est une stratégie longue et coûteuse qui nécessite la création de la bibliothèque Y2H de l’espèce cible.

De plus, la technique Y2H utilise de la levure, un organisme eucaryote unicellulaire hétérologue, qui ne pourrait pas refléter avec précision l’état cellulaire des cellules eucaryotes supérieures. L’IP-MS n’est pas adaptée aux protéines à forte hydrophobicité et montre une faible efficacité dans la capture des IPP faibles. Diverses protéines essentielles dans les plantes, telles que le domaine de liaison aux nucléotides et les protéines contenant des répétitions riches en leucine (NLR) et les kinases de type récepteur (RLK), sont exprimées à un faible niveau et interagissent principalement avec d’autres protéines de manière transitoire ; L’utilisation de ces méthodes est donc insuffisante pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la régulation de ces protéines³.

Une nouvelle technique appelée biotinylation de proximité (PB) aide les chercheurs à identifier les IPP. La PB dépend des enzymes PL, qui se fixent à la protéine d’intérêt (POI), et lorsque la protéine partenaire s’approche du POI, la PL attache une étiquette chimique de biotine à la protéine partenaire. De plus, la protéine marquée peut être identifiée et peut rapidement savoir quelle protéine partenaire se fixe à la protéine cible⁵. Des études antérieures ont prouvé que BioID et TurboID sont des outils efficaces pour les IPP, en particulier chez les plantes, mais qu’ils présentent certaines limites⁴. BioID a besoin d’un niveau élevé de biotine pour marquer les protéines partenaires, ce qui prend plus de 16 h. Par rapport au BioID, le TurboID est plus avantageux car il marque les protéines en 10 minutes et peut marquer la protéine partenaire à température ambiante (RT). Il est également toxique pour les cellules dans certaines conditions et marque les protéines qui ne montrent pas d’interaction avec la protéine d’intérêt.

Pour surmonter ces problèmes, AirID, développé par Kido et al., est plus efficace que le reste des enzymes de marquage, bien que la similitude de séquence soit de 82% entre BioID et AirID⁵. Pour vérifier l’efficacité d’AirID, nous avons mené une expérience en utilisant un POI avec des associés connus. Cette expérience a confirmé qu’AirID pouvait sans aucun doute marquer les protéines associées dans les cellules végétales. AirID est une enzyme précieuse pour l’analyse des IPP in vitro et dans les cellules. Il crée moins de toxicité et est moins erroné dans les processus qui prennent du temps que TurboID pour marquer les non-partenaires, conduisant à la mort de la cellule. Il démontre qu’AirID est plus compétitif que d’autres enzymes de marquage pour la biotinylation de proximité. Il est plus précis, a plus de potentiel dans les processus qui prennent du temps et moins toxique in vitro et dans les cellules vivantes. Le protocole actuel décrit l’identification des protéines en interaction d’APRR2 à l’aide d’AirID en tant qu’enzyme PL ; De plus, la méthode peut être appliquée à d’autres protéines pour étudier les IPP chez les espèces végétales.

Protocole

1. Préparation du matériel végétal

1. Cucumis sativus (Concombre) est utilisé pour l’analyse expérimentale. Mettez les graines dans l’eau, incubez-les à 50 °C pendant 20 min, puis placez-les sur du papier filtre sur une plaque de Pétri pendant 12 à 16 h.
2. Ensuite, transférez les graines dans des pots contenant de la terre (achetés dans le commerce) et cultivez-les dans une chambre climatique à une température de 23 °C et à une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité.
3. Maintenez les plantes dans la chambre climatique pendant 3-4 semaines jusqu’à ce que les plantes atteignent 3 ou 4 stades foliaires pour une agro-infiltration réussie.

2. Construire AirID

1. Utiliser APRR2 comme protéine cible et construire APRR2-AirID sous le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (p35S : APRR2-AirID). Introduisez-le dans le vecteur binaire compatible avec Gateway pEarleyGate100⁶ (fourni par le Dr Kathrin Schrick, Université d’État du Kansas), et synthétisez l’enzyme PL directement selon la séquence fournie dans le fichier supplémentaire 1.

3. Préparation des cellules compétentes

1. Préparation de cellules compétentes pour la DH5α
   1. Inoculer les 2 mL de LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl ; pH = 7,0.) avec des cellules E.Coli DH5α (directement à partir du bouillon congelé sans décongélation) et cultiver pendant la nuit (O/N) à 37 °C.
   2. Inoculez fraîchement 0,1 % à 0,5 % d’inoculum de la culture O/N dans 100 mL de milieu LB et faites croître les cellules jusqu’à ce que OD₆₀₀ atteigne entre 0,4 et 0,6, puis incubez la culture à 4 °C pendant 30 min.
   3. Placer la culture dans deux tubes à centrifuger de 50 ml et essorer à 2500 x g pendant 5 min à 4 °C.
   4. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 10 mL de CaCl₂ glacé à 0,1 M et laisser reposer sur de la glace pendant 15 minutes. Arroser les cellules avec un essorage de 2500 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de 0,1 M CaCl₂ + 20 % de glycérol, aliquote 100 μL dans chaque tube de 1,5 mL, et les conserver immédiatement à -80 °C.
2. Préparation des cellules compétentes GV3101
   1. Inoculer 2 mL de LB (contenant 50 μg/mL de gentamycine et 25 μg/mL de rifampicine) avec une seule colonie de GV3101. Incuber la culture O/N à 28 °C en agitant à 250 tr/min.
   2. Inoculez 200 mL de LB avec 1 mL d’une culture saturée pendant la nuit. Agiter la culture à 250 tr/min tout en l’incubant à 28 °C jusqu’à ce que le diamètre extérieur₆₀₀ soit égal à 0,5.
   3. Transférez la culture dans quatre tubes à centrifuger stériles de 50 ml pré-réfrigérés et mettez-la sur de la glace pendant 30 minutes.
   4. Pelleter les alvéoles à 2500 x g pendant 10 min à 4 °C. Jetez le surnageant et placez les granulés sur de la glace.
   5. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de solution glacée de CaCl2 à 0,1 M. Regroupez les cellules dans un tube Oakridge de 50 ml pré-réfrigéré.
   6. Pelleter les cellules à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de solution glacée de CaCl₂ . Laisser reposer sur de la glace pendant 30 min.
   7. Pelleter les cellules à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de solution glacée de CaCl₂ à 0,1 M.
   8. Distribuer les cellules dans une aliquote de 50 μL dans des tubes stériles en polypropylène pré-réfrigérés. Conservez les cellules à -80 °C.

4. Agro-infiltration

1. Tout d’abord, transférez le plasmide à l’agrobactérie
   1. Transférer 2,5 μL du plasmide généré à l’étape 2.1 aux cellules compétentes de la souche GV3101 d’agrobacterium tumefaciens et incuber sur glace pendant 30 min.
   2. Transférer le tube contenant le plasmide et les cellules compétentes dans de l’azote liquide pendant 3 min.
   3. Choc thermique à 37 °C pendant 5 min dans un incubateur, puis mettre le tube sur de la glace pendant 2 min.
   4. Ajouter 1 000 μL de milieu LB (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure et 10 g/L de NaCl ; pH = 7,0) à l’agrobactérie et incuber à 30 °C et 118 tr/min pendant 1 h.
   5. Centrifuger à 3 000 x g pendant 2 min à 4 °C.
   6. Jeter les 800 μL supérieurs de la solution et mélanger le reste de la solution. Ensuite, posez-le sur LB (comme mentionné à l’étape 4.1.4 ajouté avec de la gélose et 50 μg/mL de kanamycine pour le plasmide et 50 μg/mL de gentamycine et 25 μg/mL de rifampicine pour les cellules compétentes GV3010). Incuber les plaques à 30 °C pendant 48 h.
      REMARQUE : Il est préférable de prélever des colonies et d’effectuer une PCR pour confirmer le gène d’intérêt⁷.
2. Prélevez quelques colonies bactériennes sur les plaques et mettez-les dans un milieu LB avec des antibiotiques appropriés (voir l’étape 4.1.6). Incuber à 30 °C et 218 tr/min pendant 36-48 h.
3. Centrifuger les cellules à 3 000 x g pendant 2 minat 4 °C. Remettre les cellules en suspension à OD₆₀₀ = 1,0 dans un tampon d’agro-infiltration (10 mM MgCl₂, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acétosyringone).
4. Infiltrer l’inoculum (généré à partir de l’étape 4.3) dans l’épiderme (abaxial) à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 mL.
   REMARQUE : Il est préférable d’infiltrer toute la feuille et de choisir de répliquer. Pour 4-5 plantes, utilisez une construction. Pour chaque feuille, 1,5 mL d’agrobactéries remises en suspension suffisent.
5. Maintenir les plantes pendant 36 h dans l’enceinte climatique avec une lumière de 16 h (environ 75 μmol·^m-2·^s-1) et une photopériode sombre de 8 h à 23 °C.
6. Après 36 h d’infiltration de la construction, infiltrer 1 mL de biotine à 5 μM (dans une solution de MgCl₂ à 10 mM) dans les feuilles déjà filtrées de la construction.
7. Maintenez les plantes traitées pendant 4 à 12 heures supplémentaires avant de récolter le tissu foliaire.
   REMARQUE : Selon l’étude précédente, la protéine cible culmine à 36 h, choisissez donc des infiltrations de biotine 36 hpi ^4,6. La durée d’incubation de la biotine dépend de l’étude cible, mais selon l’expérience actuelle, une période d’incubation de 8 h est plus appropriée pour le marquage des protéines.

5. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE : Tous les matériaux pour le prélèvement d’échantillons doivent être stériles pour éviter la contamination par la kératine, et toutes les étapes du protocole doivent être effectuées dans un environnement exempt de contamination.

1. Coupez les feuilles infiltrées et transférez-les rapidement à l’azote liquide pour éviter la dégradation des protéines.
2. Effectuer la pré-détection des protéines par immunoblot^{d’analyses 6} ; ceci est fortement recommandé avant la co-immunoprécipitation (Co-IP).

6. Extraction des protéines totales de la feuille

1. Broyez les feuilles à l’aide d’un pilon et d’un mortier, ajoutez rapidement 2 mL de 1x PBS-BSA PH 7,4 et broyez lentement.
2. Prenez un tube conique de 15 ml, placez un filtre à matériau de filtration rapide sur le tube conique, transférez le mélange d’échantillons dans le tube à travers le filtre à matériau de filtration rapide et gardez-le sur de la glace.
3. Transférez les échantillons dans un tube de 2 ml et ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de protéines à 1 %.
4. Mélangez le contenu en tournant 7 à 8 fois vers le haut et vers le bas et centrifugez à 1 000 x g pendant 2 min à 4 °C.
5. Transférez le solvant supérieur des échantillons dans de nouveaux tubes de 2 ml, ajoutez 10 % de β-D-maltoside (β-D.M) et placez-le sur de la glace pendant 5 minutes. Centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min à 4 °C.

7. Équilibrer la colonne de dessalage

1. Centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 1 min à 4 °C.
   REMARQUE : Marquez un côté de la colonne et assurez-vous que le côté marqué est orienté vers l’extérieur pendant tous les processus de centrifugation.
2. Retirez les couvercles supérieur et inférieur de la colonne et centrifugez à 1 000 x g pendant 2 min à 4 °C.
3. Jetez la solution liquide du tube de collecte de la colonne et ajoutez 5 mL de tampon PBS 1x pour le lavage.
4. Centrifuger la colonne à 1 000 x g pendant 2 min à 4 °C.
5. Répétez les étapes 7.3 et 7.4 au moins cinq fois.

8. Lavage des perles magnétiques

1. Prenez un tube de 1,5 mL et ajoutez 50 μL de billes magnétiques conjuguées streptavidine-C1.
2. Ajouter 1 mL de 1x PBS-BSA pour le lavage, bien mélanger et placer sur le support magnétique pendant 3 min. Jeter le surnageant.
3. Répétez l’étape 8.2 au moins trois fois.
4. Après chaque lavage, placez le tube sur la grille magnétique pour adsorber les billes vers un côté du tube afin d’éliminer le tampon de lavage.

9. Enrichissement des protéines biotinylées

1. Ajouter 2 mL d’échantillons dans la colonne et centrifuger à 1 000 x g pendant 8 min à 4 °C.
2. Ajouter 1 mL d’extrait protéique dessalé à 50 μL de billes magnétiques conjuguées streptavidine-C1 pour les équilibrer.
3. Placez le tube sur le rotateur à vitesse normale pour que la solution se mélange bien et incube à température ambiante (RT) pendant 30 minutes.
4. Placez les billes sur la grille magnétique pendant 3 min à RT, ou jusqu’à ce qu’elles se rassemblent d’un côté du tube, pour retirer délicatement le surnageant.
5. Ajouter 1 mL de tampon de lavage I (2 % SDS dans l’eau), faire tourner à RT pendant 2 min sur un rotateur et répéter l’étape 9.4.
6. Placez le tube sur le rotateur à RT pendant 2 min après avoir ajouté 1 mL de tampon de lavage II (50 mM HEPES : pH = 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM d’EDTA, 0,1 % d’acide désoxycholique [p/v] et 1 % de Triton X-100). Répétez l’étape 9.4.
7. Ajouter 1 mL de tampon de lavage III (10 mM Tris-HCl : pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % d’acide désoxycholique [p/v], 1 % NP40 [v/v]) et faire tourner à l’aide d’un agitateur pendant 2 min à RT. Ensuite, répétez l’étape 9.4.
8. Pour éliminer le détergent, ajoutez 1,7 mL de Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5) et répétez l’étape 9.4. Répétez cette étape une fois de plus.
9. Lavez les billes six fois pendant 2 minutes chacune dans 1 mL de tampon bicarbonate d’ammonium à 50 mM à RT et répétez l’étape 9.4.
10. Ajouter 50 μL de l’extrait protéique contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 12 % (p/v) de saccharose (Suc), 2 % (p/v) de laurylsulfate de lithium et 1,5 % (p/v) de dithiothréitol aux billes, effectuer un choc thermique dans l’incubateur à 100 °C pendant 5 min et suivre l’étape 9.4. Stocker le surnageant à -80 °C pour l’analyse LC-MS/MS.

Résultats

Selon des recherches antérieures, le gène du concombre APRR2 est le gène candidat qui contrôle la couleur blanche des fruits immatures⁸. Ici, un protocole a été développé en utilisant AirID comme enzyme de marquage de proximité pour trouver la protéine partenaire d’interaction d’APRR2 dans le concombre. La construction a été transférée sur les feuilles de concombre, et après 36 h après l’infiltration, la biotine a été transférée. Après 48 h, les échant...

Discussion

Dans l’expérience actuelle, AirID a été utilisé pour le marquage de proximité, que Kido et al. ont développé grâce à un algorithme de reconstruction enzymatique ancestrale utilisant un grand ensemble de données génomiques et cinq enzymes BirA conventionnelles⁵. Les mutations aléatoires ont été utilisées dans l’ingénierie évolutive traditionnelle des protéines pour améliorer l’activité ^9,10 car les mutations aléat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	S1519
Acryl/Bis 30% solution	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	1510KA4528
Agar	BioFroxx GmbH	D64683
Agarose	tsingke (Shanghai) Co.Ltd	TSJ001
Ammonium bicarbonate	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G313BA0018
Biotin	BBI life Sciences	G908BA0012
CaCl2	BBI life Sciences	E209BA0008
Competent cells GV3101	Made in the current experiment
Desalting column	Thermo scientific	WC321753
Deoxycholic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	G818BA0029
DH5α competent cells	Made in the current experiment		E.coli DH5α
β-D-maltoside	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S818
EDTA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	E104BA0029
Glycine	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	161BA0031
HEPES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	H8090
LiCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H209BA0003
MES	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	M8019
MiraCloth	EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay	3429963	Quick filtration material filter
MgCl2	Beijing solaribo science and technology Co.Ltd	20200819
NaCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	H324BA0003
NP40	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	N8030
Protein inhibitor cocktail	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S3450
PVDF	BIO-RAD	5820172
SDS	Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd	S1015
Silwet	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads	Enriching Biotechnology	7E511E1	Magnetic beads
TEMED	Servicebio	G2056
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	GB03BA007
Tris-HCl	Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd	F828BA0020
Tryptone	Thermo scientific	LP0042