JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем пошаговый протокол проведения эксперимента по бесконтактному мечению (PL) на огурце (Cucumis sativus L.) с использованием белка AT4G18020 (APRR2)-AirID в качестве модели. Метод описывает конструирование вектора, трансформацию конструкта с помощью агроинфильтрации, инфильтрации биотина, экстракции белка и очистки меченых биотином белков с помощью метода аффинной очистки.

Аннотация

В клетках и растениях млекопитающих подходы к бесконтактному мечению (PL) с использованием модифицированной аскорбатпероксидазы (APEX) или биотинлигазы BirA Escherichia coli (известной как BioID) доказали свою эффективность в идентификации белок-белковых взаимодействий (ИПП). APEX, BioID и TurboID, обновленная версия BioID, имеют некоторые ограничения в дополнение к тому, что являются ценными технологиями. Недавно разработанная AirID, новая версия BioID для бесконтактной идентификации при белок-белковых взаимодействиях, преодолела эти ограничения. Ранее AirID использовался на животных моделях, в то время как текущее исследование демонстрирует использование AirID в растениях, и результаты подтвердили, что AirID лучше работает в растительных системах по сравнению с другими ферментами PL, такими как BioID и TurboID, для мечения белков, которые находятся ближе к белкам-мишеням. Ниже приведен пошаговый протокол определения партнеров по взаимодействию белков с использованием белка AT4G18020 (APRR2) в качестве модели. Методы описывают конструирование вектора, трансформацию конструкта путем агроинфильтрации, трансформацию биотина, экстракцию белков и обогащение меченых биотином белков методом аффинной очистки. В результате сделан вывод о том, что AirID является новым и идеальным ферментом для анализа ИПП в растениях. Метод может быть применен для изучения других белков в растениях.

Введение

Различные клеточные белки работают в рамках биологически регуляторной системы, а белок-белковые взаимодействия (ИПП) являются частью этой системы и основой многих клеточных процессов. Помимо ИПП, функция природных белков стимулируется посттрансляционно с помощью различных модификаций, таких как образование комплекса, убиквитинирование и фосфорилирование. Таким образом, изучение ИПП имеет важное значение для понимания возможной функции белков-мишеней. ИПП проводили с использованием различных технологий, таких как масс-спектрометрический анализ после иммунопреципитации (IP-MS анализ)1, дрожжевая двухгибридная система (Y2H)2, а также бесклеточные матрицы3. Эти методы исследовали различные жизненно важные открытия в области исследований. Однако у этих методов есть некоторые недостатки; Например, Y2H — это трудоемкая и дорогостоящая стратегия, которая требует создания библиотеки Y2H целевого вида.

Кроме того, в методе Y2H используются дрожжи, гетерологичный одноклеточный эукариотический организм, который не может точно отражать клеточное состояние высших эукариотических клеток. IP-MS не подходит для белков с высокой гидрофобностью и показывает низкую эффективность в улавливании слабых ИПП. Различные незаменимые белки в растениях, такие как нуклеотид-связывающий домен и лейкин-богатые повторы (NLR) белки и рецептороподобные киназы (RLK), экспрессируются на низком уровне и в основном взаимодействуют с другими белками переходно; Поэтому использование этих методов недостаточно для понимания механизмов, лежащих в основе регуляции этих белков3.

Новый метод, называемый бесконтактным биотинилированием (PB), помогает исследователям идентифицировать ИПП. PB зависит от ферментов PL, которые прикрепляются к интересующему белку (POI), и когда белок-партнер приближается к POI, PL прикрепляет химическую метку биотина к белку-партнеру. Кроме того, меченый белок может быть идентифицирован и может быстро узнать, какой белок-партнер присоединяется к белку-мишени5. Предыдущие исследования доказали, что BioID и TurboID являются успешными инструментами для получения ИПП, особенно в растениях, но у них есть определенныеограничения. BioID нуждается в высоком уровне биотина для мечения белков-партнеров, что занимает более 16 часов. По сравнению с BioID, TurboID более полезен, так как он мечет белок за 10 минут и может маркировать белок-партнер при комнатной температуре (RT). Он также токсичен для клеток в определенных условиях и помечает те белки, которые не проявляют взаимодействия с интересующим белком.

Чтобы преодолеть эти проблемы, AirID, разработанный Kido et al., более эффективен, чем остальные ферменты для мечения, хотя сходство последовательностей между BioID и AirID5 составляет 82%. Чтобы проверить эффективность AirID, мы провели эксперимент с использованием POI с известными ассоциатами. Этот эксперимент подтвердил, что AirID, несомненно, может маркировать ассоциированные белки в растительных клетках. AirID является ценным ферментом для анализа ИПП in vitro и в клетках. Он создает меньшую токсичность и менее ошибочен в процессах, занимаемых по времени, чем TurboID, для маркировки непартнеров, что приводит к гибели клетки. Это демонстрирует, что AirID является более конкурентоспособным, чем другие ферменты для мечения для бесконтактного биотинилирования. Он более точен, обладает большим потенциалом в процессах, занимающих время, и менее токсичен in vitro и в живых клетках. Текущий протокол описывает идентификацию взаимодействующих белков APRR2 с использованием AirID в качестве фермента PL; кроме того, метод может быть применен к другим белкам для исследования ИПП у видов растений.

протокол

1. Подготовка растительного сырья

  1. Cucumis sativus (Огурец) используется для экспериментального анализа. Поместите семена в воду, инкубируйте при температуре 50 °C в течение 20 мин, а затем поместите семена на фильтровальную бумагу на планшете Петри на 12-16 ч.
  2. После этого пересадите семена в горшки с почвой (приобретенные в магазине) и выращивайте в климатической камере при температуре 23 °C, световом и темном фотопериоде 16 часов.
  3. Держите растения в климатической камере в течение 3-4 недель, пока растения не достигнут 3 или 4 стадии листьев для успешной агроинфильтрации.

2. Создание AirID

  1. Используйте APRR2 в качестве белка-мишени и конструируйте APRR2-AirID под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (p35S: APRR2-AirID). Введите его в Gateway-совместимый бинарный вектор pEarleyGate1006 (предоставленный доктором Катрин Шрик из Университета штата Канзас) и синтезируйте фермент PL непосредственно в соответствии с последовательностью, приведенной в дополнительном файле 1.

3. Подготовка компетентных клеток

  1. Подготовка DH5α-компетентных клеток
    1. Инокулируют 2 мл LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л NaCl; pH = 7,0.) клетками E.Coli DH5α (непосредственно из замороженного сырья без размораживания) и выращивают в течение ночи (O/N) при 37 °C.
    2. Свежий посев 0,1%-0,5% посева из культуры O/N в 100 мл среды LB и выращивание клеток до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,4-0,6, а затем инкубируйте культуру при 4 °C в течение 30 минут.
    3. Поместите культуру в две центрифужные пробирки по 50 мл и отжим при 2500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Надосадочную жидкость выбросить, повторно суспендировать клетки в 10 мл 0,1 М ледяного CaCl2 и поставить на лед на 15 мин. Гранулируйте ячейки с отжимом 2500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    5. Повторно суспендируйте клетки в 1 мл ледяного 0,1 М CaCl2 + 20% глицерина, аликвотируйте 100 мкл в каждую пробирку объемом 1,5 мл и немедленно храните их при -80 °C.
  2. Подготовка компетентных клеток GV3101
    1. Инокулируют 2 мл LB (содержащего 50 мкг/мл гентамицина и 25 мкг/мл рифампицина) с одной колонией GV3101. Инкубируют культуру O/N при 28 °C при встряхивании при 250 об/мин.
    2. Инокулируют 200 мл LB 1 мл насыщенной ночной культуры. Встряхивайте культуру при 250 об/мин, инкубируя ее при 28 °C, пока наружный диаметр600 не станет равным 0,5.
    3. Переложите культуру в четыре предварительно охлажденные стерильные центрифужные пробирки объемом 50 мл и поставьте на лед на 30 мин.
    4. Гранулируйте ячейки при 2500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и положите гранулы на лед.
    5. Ресуспендируйте клетки в 10 мл 0,1 М ледяного раствора CaCl2 . Объедините клетки в одну предварительно охлажденную пробирку Oakridge объемом 50 мл.
    6. Гранулируйте клетки при 1 000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл ледяного раствора CaCl2 . Поставить на лед на 30 мин.
    7. Гранулируйте клетки при 1 000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 2 мл 0,1 М ледяного раствора CaCl2 .
    8. Дозируют клетки в аликвоту объемом 50 мкл в предварительно охлажденные стерильные полипропиленовые пробирки. Храните ячейки при температуре -80 °C.

4. Агроинфильтрация

  1. Сначала переносят плазмиду на агробактерию
    1. Перенесите 2,5 мкл плазмиды, полученной на этапе 2.1, в компетентные клетки штамма agrobacterium tumefaciens GV3101 и инкубируйте на льду в течение 30 мин.
    2. Переложите пробирку с плазмидой и соответствующими клетками в жидкий азот на 3 мин.
    3. Тепловой шок при 37 °C в течение 5 мин в инкубаторе, а затем положите трубку на лед на 2 мин.
    4. Добавьте 1000 мкл среды LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л NaCl; рН = 7,0) в агробактерию и инкубируйте при 30 °C и 118 об/мин в течение 1 ч.
    5. Центрифуга при 3 000 x g в течение 2 мин при 4 °C.
    6. Выбросьте верхние 800 мкл раствора и перемешайте оставшийся раствор. Затем нанесите его на LB (как указано в шаге 4.1.4 с добавлением агара и 50 мкг/мл канамицина для плазмиды и 50 мкг/мл гентамицина и 25 мкг/мл рифампицина для компетентных клеток GV3010). Выдерживают при температуре 30 °C в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше выбрать несколько колоний и провести ПЦР для подтверждения интересующего гена7.
  2. Возьмите несколько колоний бактерий с планшетов и поместите их в среду LB вместе с соответствующими антибиотиками (см. шаг 4.1.6). Инкубируют при 30 °C и 218 об/мин в течение 36-48 ч.
  3. Центрифугируйте ячейки при 3 000 x g в течение 2 мин при 4 °C. Ресуспендируйте клетки до OD600 = 1,0 в агроинфильтрационном буфере (10 мМ MgCl2, 10 мМ MES, pH = 5,6, 250 мкМ ацетосирингона).
  4. Инфильтрируйте посевной материал (полученный из шага 4.3) в (абаксиальный) эпидермис с помощью безыгольного шприца объемом 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше проникнуть во весь лист и выбрать репликацию. Для 4-5 растений используют один конструкт. На каждый лист достаточно 1,5 мл ресуспендированных агробактерий.
  5. Выдерживают растения в течение 36 ч в климатической камере при освещении 16 ч (около 75 мкмоль·м-2·с-1) и 8 ч темном фотопериоде при 23 °C.
  6. Через 36 ч после инфильтрации конструкции инфильтрат 1 мл 5 мкМ биотина (в 10 мМ растворе MgCl2 ) в уже отфильтрованные листья конструкции.
  7. Выдержите обработанные растения еще 4-12 ч перед сбором листовой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно предыдущему исследованию, целевой белок достигает пика через 36 часов, поэтому выберите 36 инфильтраций биотина hpi 4,6. Продолжительность инкубации биотина зависит от целевого исследования, но, согласно текущему эксперименту, 8-часовой инкубационный период больше подходит для мечения белков.

5. Отбор проб

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы для отбора проб должны быть стерильными, чтобы избежать загрязнения кератином, а все этапы протокола должны выполняться в среде, свободной от загрязнения.

  1. Срежьте инфильтрированные листья и быстро перенесите их в жидкий азот, чтобы избежать разложения белка.
  2. Проводить предварительное определение белка с помощью иммуноблоттинг-анализа6; это настоятельно рекомендуется перед ко-иммунопреципитацией (Co-IP).

6. Извлечение общего белка из листьев

  1. Измельчите листья с помощью пестика и ступки, быстро добавьте 2 мл 1x PBS-BSA PH 7,4 и медленно измельчите.
  2. Возьмите коническую пробирку объемом 15 мл, поместите фильтр для быстрого фильтрующего материала поверх конической пробирки, перенесите смесь образцов в пробирку через фильтр для быстрого фильтра фильтрующего материала и держите ее на льду.
  3. Переложите образцы в пробирку объемом 2 мл и добавьте 1% коктейль из ингибитора белка.
  4. Перемешайте содержимое, поворачивая вверх и вниз 7-8 раз, и центрифугируйте при 1 000 x g в течение 2 мин при 4 °C.
  5. Переложите верхний растворитель образцов в новые пробирки по 2 мл, добавьте 10% β-D-мальтозида (β-D.M) и поместите на лед на 5 мин. Центрифуга при 20 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.

7. Уравновешивайте колонну обессоливания

  1. Центрифугируйте колонку при 1 000 x g в течение 1 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отметьте одну сторону колонны и убедитесь, что отмеченная сторона обращена наружу во время всех процессов центрифугирования.
  2. Снимите верхнюю и нижнюю крышки колонны и центрифугу при 1 000 x g в течение 2 минут при 4 °C.
  3. Выбросьте жидкий раствор из сборной трубки колонки и добавьте 5 мл 1x буфера PBS для промывки.
  4. Центрифугируйте колонку при 1 000 x g в течение 2 мин при 4 °C.
  5. Повторите шаги 7.3 и 7.4 не менее пяти раз.

8. Промывка магнитных бусин

  1. Возьмите пробирку объемом 1,5 мл и добавьте в нее 50 мкл магнитных шариков, конъюгированных стрептавидин-С1.
  2. Добавьте 1 мл 1x PBS-BSA для мытья, тщательно перемешайте и поставьте на магнитную подставку на 3 минуты. Выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Повторите шаг 8.2 не менее трех раз.
  4. После каждой промывки помещайте пробирку на магнитную решетку, чтобы адсорбировать шарики к одной стороне трубки, чтобы удалить буфер для стирки.

9. Обогащение биотинилированными белками

  1. Добавьте 2 мл образцов в колонку и центрифугируйте при 1 000 x g в течение 8 мин при 4 °C.
  2. Добавьте 1 мл обессоленного белкового экстракта к 50 мкл магнитных шариков, конъюгированных стрептавидин-С1, чтобы уравновесить их.
  3. Поместите пробирку на вращатель на нормальной скорости, чтобы раствор тщательно перемешался и инкубировался при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут.
  4. Поместите шарики на магнитную стойку на 3 минуты при RT или до тех пор, пока они не соберутся на одной стороне трубки, чтобы осторожно удалить надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 1 мл промывочного буфера I (2% SDS в воде), вращайте на RT в течение 2 мин на ротаторе и повторите шаг 9.4.
  6. Поместите пробирку на ротатор в RT на 2 минуты после добавления 1 мл промывочного буфера II (50 мМ HEPES: pH = 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% дезоксихолевой кислоты [w/v] и 1% Triton X-100). Повторите шаг 9.4.
  7. Добавьте 1 мл промывочного буфера III (10 мМ Tris-HCl: pH = 7,4, 250 мМ LiCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% дезоксихолевой кислоты [w/v], 1% NP40 [v/v]) и вращайте с помощью шейкера в течение 2 мин при RT. Затем повторите шаг 9.4.
  8. Чтобы удалить моющее средство, добавьте 1,7 мл 50 мМ Tris-HCl (pH = 7,5) и повторите шаг 9.4. Повторите этот шаг еще раз.
  9. Промыть шарики шесть раз по 2 мин каждый в 1 мл 50 мМ буфера бикарбоната аммония при RT и повторить шаг 9.4.
  10. Добавьте 50 мкл белкового экстракта, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 12% (w/v) сахарозы (Suc), 2% (w/v) лаурилсульфата лития и 1,5% (w/v) дитиотрейтола к гранулам, обработайте тепловым шоком в инкубаторе при 100 °C в течение 5 мин и выполните шаг 9.4. Храните надосадочную жидкость при температуре -80 °C для анализа ЖХ-МС/МС.

Результаты

Согласно предыдущим исследованиям, ген огурца APRR2 является геном-кандидатом, который контролирует цвет белых незрелых плодов8. Здесь был разработан протокол с использованием AirID в качестве фермента бесконтактного мечения для поиска взаимодействующего белка-партнера...

Обсуждение

В текущем эксперименте AirID использовался для бесконтактного мечения, которое Kido et al. разработали с помощью алгоритма реконструкции предковых ферментов с использованием большого набора данных генома и пяти обычныхферментов BirA. Случайные мутации использовались в традицио?...

Раскрытие информации

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 32000197 X.H.), Специального финансового гранта Китайского фонда постдокторантуры (грант No 2019T120467 X.H.)

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetosyringoneBeijing solaribo science and technology Co.LtdS1519
Acryl/Bis 30% solutionSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
Agarosetsingke (Shanghai) Co.LtdTSJ001
Ammonium bicarbonateSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdG313BA0018
BiotinBBI life SciencesG908BA0012
CaCl2BBI life SciencesE209BA0008
Competent cells GV3101Made in the current experiment
Desalting columnThermo scientificWC321753
Deoxycholic acidSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdG818BA0029
DH5α competent cellsMade in the current experimentE.coli DH5α
β-D-maltosideBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Shanghai) Co.LtdE104BA0029
GlycineSangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd161BA0031
HEPESBeijing solaribo science and technology Co.LtdH8090
LiClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH209BA0003
MESBeijing solaribo science and technology Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay3429963Quick filtration material filter
MgCl2Beijing solaribo science and technology Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdH324BA0003
NP40Sangon Biotech (Shanghai) Co.LtdN8030
Protein inhibitor cocktailBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD5820172
SDSBeijing Scolario Science and Tech Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdS9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beadsEnriching Biotechnology7E511E1Magnetic beads
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co.LtdGB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Shanghai) Co.LtdF828BA0020
TryptoneThermo scientificLP0042

Ссылки

  1. Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
  2. Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
  3. Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
  4. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
  5. Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
  6. Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
  7. Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
  8. Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
  9. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  10. Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
  11. Gingras, A. -. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  12. Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
  13. Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

AirIDPLAPEXEscherichia coli BirABioIDTurboIDRestrictionsNovel VersionPlant SystemsAT4G18020 APRR2 Protein

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены