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要約

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture Hi-C(liCHi-C)により、以前は測定できなかった希少細胞型におけるこれらの相互作用の同定がどのように可能になるかを説明します。

要約

時空間的な遺伝子転写は、転写を制御するために標的遺伝子プロモーターとの物理的な近接に依存するエンハンサーやサイレンサーなどの遠位調節要素によって厳密に制御されています。これらの調節要素は同定が容易ですが、それらのほとんどは細胞型特異的であり、線形ゲノム配列において数百キロ塩基離れている可能性があり、他の非標的遺伝子をスキップするため、それらの標的遺伝子を予測することは困難です。数年前から、プロモーターキャプチャーHi-C(PCHi-C)は、遠位調節エレメントを標的遺伝子に関連付けるためのゴールドスタンダードでした。しかし、PCHi-Cは数百万の細胞の入手可能性に依存しており、初代組織から一般的に得られるような希少細胞集団の研究を禁止しています。この制限を克服するために、ゲノムの各遺伝子を制御する遠位調節要素のレパートリーを同定するための費用効果が高くカスタマイズ可能な方法である低入力Capture Hi-C(liCHi-C)が開発されました。liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験および計算フレームワークに依存していますが、チューブの変更を最小限に抑え、試薬の濃度と量を変更し、ステップを交換または排除することにより、ライブラリ構築中の材料損失を最小限に抑えます。liCHi-Cは、発生生物学と細胞機能の文脈における遺伝子制御と時空間ゲノム構成の研究を可能にします。

概要

時間的な遺伝子発現は細胞の分化を促進し、最終的には生物の発生を促進し、その変化は幅広い疾患と密接に関連しています1,2,3,4,5。遺伝子転写は、近位(すなわち、遺伝子プロモーター)および遠位(例えば、エンハンサーまたはサイレンサー)に分類され得る調節要素の作用によって細かく制御され、後者はしばしば標的遺伝子から遠くに位置し、クロマチンループを介してそれらと物理的に相互作用して遺伝子発現を調節する6,7,8。

ゲノム中の遠位調節領域の同定は、これらの領域が特異的なヒストン修飾9,10,11を有し、特異的な転写因子認識モチーフを含み、それらの募集プラットフォームとして機能するため、広く合意されている問題である12,13,14。その上、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー15,16の場合、それらはまた低ヌクレオソーム占有率17,18を有し、ノンコーディングeRNA19,20に転写される。

それにもかかわらず、各遠位調節要素の標的遺伝子を予測することはより困難です。多くの場合、遠位調節要素とその標的との間の相互作用は、細胞型および刺激特異的であり21,22、数百キロベースに及び、任意の方向に他の遺伝子を橋渡しし23,24,25、標的遺伝子または他の非介在遺伝子のイントロン領域内に位置し得る26,27.さらに、遠位調節要素は同時に複数の遺伝子を制御することもでき、逆もまた同様である28,29。この位置の複雑さは、それらの間の調節関連を特定することを妨げ、したがって、すべての細胞型における各調節要素の標的のほとんどは未知のままです。

近年、クロマチン相互作用を研究するための染色体立体構造捕捉(3C)技術の開発に大きなブームがありました。それらの中で最も広く使用されているHi-Cは、細胞のゲノム30のすべての断片間のすべての相互作用のマップを生成することを可能にする。しかし、制限断片レベルで有意な相互作用を検出するために、Hi-Cは超深部シーケンシングに依存しており、個々の遺伝子の調節状況を日常的に研究するためにそれを使用することを禁止しています。この経済的限界を克服するために、ChIA-PET 31、HiChIP32、およびその低入力対応物HiCuT33など、いくつかの濃縮ベースの3C技術が登場しました。これらの技術は、特定のタンパク質によって媒介されるゲノム全体の相互作用を濃縮するための抗体の使用に依存しています。それにもかかわらず、これらの3C技術のユニークな特徴は、それらのアプリケーションの悩みの種でもあります。ユーザーは、目的のタンパク質に対する高品質の抗体の入手可能性を頼りにしており、タンパク質の結合が動的である条件を比較することはできません。

プロモーター捕捉Hi−C(PCHi−C)は、これらの制限を回避する別の濃縮ベースの3C技術である34、35。PCHi-Cは、ビオチン化RNAプローブ濃縮システムを採用することにより、28,650個のヒトまたは27,595個のマウスアノテーション付き遺伝子プロモーター(プロモーターインタラクトームとも呼ばれる)と相互作用するゲノム領域のゲノムワイドな高解像度ライブラリを生成することができます。このアプローチにより、活性プロモーターと非活性プロモーターの両方の制限フラグメントレベルの分解能で有意な長距離相互作用を検出し、ヒストン修飾やタンパク質結合のダイナミクスとは無関係に、任意の条件間でプロモーター相互作用を堅牢に比較することができます。PCHi-Cは、細胞分化中のプロモーターの相互作用体再編成を同定するために近年広く使用されており36,37、転写因子の作用機序を同定し38,39、非コード変異体40,41,42,43,44,45によって疾患において調節解除される新しい潜在的な遺伝子および経路を発見する。46、47、48、新しいドライバ非コード変異49、50と並んで。さらに、捕捉システムを変更するだけで、この手法を生物学的問題に従ってカスタマイズして、任意のインタラクトーム(例えば、エンハンサーインタラクトーム51または非コード改変のコレクションのインタラクトーム41、52)を尋問することができる。

しかし、PCHi-Cは最低2,000万個の細胞に依存してこの技術を実行するため、発生生物学や臨床応用でよく使用されるような希少な細胞集団の研究が妨げられています。このため、PCHi-Cの実験フレームワークに基づいて、低細胞入力で高分解能プロモーター相互作用を形成するための費用効果が高くカスタマイズ可能な新しい方法である低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)を開発しました。最小限のチューブ交換、元のPCHi-Cプロトコルからのステップの交換または排除、反応量の大幅な削減、試薬濃度の変更で実験を行うことで、ライブラリの複雑さが最大化され、わずか50,000細胞で高品質のライブラリを生成することができます53。

低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)は、PCHi-Cに対してベンチマークされており、ヒト造血細胞分化中のプロモーター相互作用体再配線の解明、非コード変化によって制御解除される可能性のある新しい疾患関連遺伝子および経路の発見、および染色体異常の検出に使用されています53。ステップバイステップのプロトコルと技術によるさまざまな品質管理は、ライブラリの最終生成とその計算分析までここで詳しく説明します。

プロトコル

材料の損失を最小限に抑えるには、(1)DNA低結合チューブとチップ( 材料表を参照)を使用し、(2)チップをサンプル内に導入する代わりにチューブ壁に試薬を配置し、(3)可能であれば、サンプルを上下にピペッティングする代わりに反転によってサンプルを混合し、その後スピンダウンしてサンプルを回収します。

1.細胞固定

  1. 浮遊状態で増殖する細胞
    1. 50,000〜100万個の細胞を採取し、DNA低結合1.5 mLチューブに入れます。
      注:本研究に用いた細胞型は、代表的な結果のセクションで詳述されています。
    2. 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を600 x g (4°C)で5分間遠心分離し、ピペッティングで上清を除去します。
    3. 室温で10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1 mLのRPMI 1640に細胞を再懸濁します。
    4. メタノールを含まない16%ホルムアルデヒド143μLを加えて濃度2%にし、混合します。
    5. 室温で回転させながら細胞を10分間インキュベートし、細胞を固定します。
      注:10分間のインキュベーションでできるだけ正確になるようにしてください。細胞の過剰または過小固定は、ライブラリの品質の低下につながる可能性があります。
    6. 氷冷した1 Mグリシン164 μLを加えて反応を停止し、混合します。細胞を室温で回転させながら5分間インキュベートする。
    7. さらに細胞を氷上で15分間インキュベートし、~5分ごとに転倒させて混合します。
    8. 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。
    9. ペレットを氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLに再懸濁して細胞を洗浄します。
    10. 細胞を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。
      注:ペレット化された細胞は、液体窒素またはドライアイスで瞬間凍結し、-80°Cで保存できます。
  2. 接着細胞
    1. 培養皿内の細胞を1x PBSで洗浄します。
    2. 培養皿を覆うのに十分なRPMI 1640を室温で10%FBSおよびメタノールフリーの2%ホルムアルデヒドを添加したものを準備します。
    3. 添加した培地を細胞と一緒に培養皿に加え、室温で揺動させて細胞を固定しながら10分間インキュベートします。
      注:10分間のインキュベーションでできるだけ正確になるようにしてください。細胞の過剰または過小固定は、ライブラリの品質の低下につながる可能性があります。
    4. 1 Mのグリシンを0.125 Mまで添加して反応を停止し、揺動させて混合します。
    5. 細胞を室温で揺らしながら5分間インキュベートします。
    6. さらに細胞を4°Cで15分間インキュベートし、3〜4分ごとに揺動させて混合する。
    7. 培地を取り出し、冷たい1x PBSで細胞を洗浄します。
    8. 細胞をスクレイピングし、1.5 mL DNA低結合チューブに移します。培養皿を0.5〜1 mLの冷たい1 x PBSできれいに拭きます。
    9. 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。ペレット化された細胞は、液体窒素またはドライアイス中で瞬間凍結し、-80°Cで保存することができる。

2.溶解と消化

  1. 細胞を1 mLの低温溶解バッファー(表1)に再懸濁して、細胞膜を破壊します。緩衝液の添加だけで細胞を再懸濁するのに十分であるべきであるが、必要に応じて光ボルテックスによってさらに再懸濁することができる。
  2. 氷上で30分間インキュベートし、~5分ごとに反転させて混合します。核を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。核を500 μLの冷たい1.25倍制限バッファー2で再懸濁します( 材料表を参照)。
  3. 核を1,000 x g (4°C)で10分間遠心分離し、上清を除去します。核を179 μLの1.25x制限バッファー2に再懸濁します。
  4. 5.5 μLの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS; 材料表を参照)を加えて混合します。細胞は塊を形成することがあります。これは正常であり、ボルテックスによって可能な限り分解する必要があります。サンプルをサーモブロック中で37°Cで1時間インキュベートし、950 rpmで振とうします。
  5. 37.5 μLの10%トリトンX-100を加えてSDSをクエンチし、混合します。サンプルをサーモブロック中で37°Cで1時間インキュベートし、950 rpmで振とうします。
  6. 7.5 μLのHindIII(100 U / μL; 材料表を参照)を加えてクロマチンを消化し、混合します。サンプルをサーモブロック内で37°Cで一晩インキュベートし、950 rpmで振とうします。
  7. 翌朝、さらに2.5 μLのHindIII(100 U/μL)を加え、適切なクロマチン消化を確保するために、950 rpmで振とうしながら、サーモブロック中で37°Cで1時間サンプルをさらにインキュベートします。
    注意: 消化効率制御(ステップ5.1を参照)の一部として、20,000〜40,000核に相当するものを別のチューブに移して、未消化のコントロールを表します。消化後、同じ数の細胞を再び別のチューブに移して、消化されたコントロールを表します。出発物質の入手可能性が不足している場合は、別の実験として消化効率をテストすることをお勧めします。

3. ライゲーションと脱架橋

  1. サンプルを氷の上で冷やします。マスターミックスを調製し、制限フラグメントオーバーハングを充填してビオチン化するための試薬を添加します:3 μLの10x制限バッファー2、1 μLのヌクレアーゼフリー水、0.75 μLの10 mM dCTP、0.75 μLの10 mM dTTP、0.75 μLの10 mM dGTP、18.75 μLの0.4 mMビオチン-14-dATP、および5 μLの5 U/μL Klenow( 材料表を参照)。サンプルを37°Cで75分間インキュベートし、~15分ごとに転倒混合します。
  2. サンプルを氷の上で冷やします。マスターミックスを調製し、充填されたDNA末端をライゲーションするための試薬50 μL、20 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)2.5 μL、1 U/μL T4 DNAリガーゼ12.5 μL、およびヌクレアーゼフリー水173 μLを添加します( 材料表参照)。
  3. サンプルを16°Cで4〜6時間インキュベートし、~1時間ごとに反転混合します。さらに、サンプルを室温で30分間インキュベートします。30 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを加えてクロマチンを脱架橋し、混合します。サンプルを65°Cで一晩インキュベートします。
  4. 翌朝、さらに15 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを添加し、さらにサンプルを65°Cで2時間インキュベートして、適切なクロマチン脱架橋を確保します。

4. DNA精製

  1. サンプルを室温まで冷却し、フェノール-クロロホルム精製に適したチューブに移します。
  2. フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を1容量(545 μL)加えてDNAを精製し、激しく振とうして混合します。
  3. サンプルを室温で12,000 x g で5分間遠心分離し、上水相(545 μL)を2 mL DNA低結合チューブに移します。
  4. 以下の試薬を加えてDNAを沈殿させます:-20°Cに冷却した100%エタノール1,362.5 μL、3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)54.5 μL、共沈剤として15 mg/mLグリコーゲン2 μL。
  5. -80°Cで1時間、または-20°Cで一晩インキュベートします。
  6. サンプルを4°Cで16,000-21,000 x g で30分間遠心分離し、上清を除去します。DNAペレットは見えなければなりません。
  7. 1 mLの70%エタノールを加えてペレットを洗浄し、ボルテックスし、室温で16,000〜21,000 x g で10分間遠心分離します。
  8. 上清を取り除き、ペレットを風乾させます。DNAペレットを130 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。
  9. 蛍光定量によって濃度を評価します( 材料の表を参照)。精製した3C材料を-20°Cで数ヶ月間保管してから、プロトコルを進めてください。

5.オプションの品質管理

  1. 消化効率を評価します。前述のように、ステップ2.13で得られた未消化および消化されたコントロールに対して、脱架橋およびフェノール:クロロホルムDNA精製を実行します。DNAペレットをヌクレアーゼフリー水10 μLに再懸濁します。濃度を定量し、必要に応じて得られたDNAを4 ng/μLに希釈します。
  2. HindIIIターゲットの有無にかかわらず、オープンクロマチン遺伝子座にまたがるプライマーを用いて、未消化コントロールと消化コントロールの両方の4 ngのDNAを用いて定量PCRを実行します(プライマー設計については 表2 を参照)。以前に公開されたレポート35に従って消化の効率を計算します。
    注:ライゲーションの効率は、消化(%)= 100 -100/(2^[(HindIIIで消化されたCt-HindIIIなしで消化されたCt)-(HindIIIで消化されていないCt-HindIIIなしで消化されていないCt)])(表3を参照)を使用してパーセンテージとして計算され、これは未消化および消化されたコントロールの各プライマーペアについて得られた異なるCtsの差を考慮に入れています。
  3. 従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(0.2 mM dNTP、0.4 μmの両方のF+Rプライマー、0.1およびU/μLホットスタートポリメラーゼ)を実行して、長距離および短距離の細胞不変相互作用の両方にまたがるプライマーを使用して、相互作用検出の感度を評価します(プライマー設計については 表2 を参照)。50〜100 ngの3C材料(それぞれ短距離および長距離相互作用用)を使用し、次の条件を使用して増幅します:98°Cで15分間、続いて98°Cで30秒間、60°Cで1分間、72°Cで1分間、72°Cで10分間仕上げます。4°Cで保持する。
    注:得られたDNAの量が2 μg未満の場合は、相互作用パネル全体ではなく、長距離および短距離の相互作用のみを確認してください。
  4. 1.6%アガロースゲルを用いて1x トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)上で産物を実行し、対応するPCRアンプリコン54の存在を探します。
    注:ゲノムの予測不可能な「カットアンドペースト」により、不特異的なバンドが現れることがあります。正しいバンド サイズが観察されている限り、正しいものとしてカウントされます。
  5. 短距離PCR産物をHindIII、NheI( 材料表を参照)、酵素の両方またはなし(水)で差動的に消化し、1x TBE 1.6%アガロースゲル上で産物を流すことにより、ビオチン充填およびライゲーションの効率を評価します。正しいフィルインとライゲーションにより、以前のHindIIIターゲットが排除され、新しいNheIターゲットが作成されるため、アンプリコンはNheIの存在下でのみ切断する必要があります。
    注:材料の損失を最小限に抑えるために、相互作用コントロールから2.5 μLの短距離PCR産物を取り出し、5回再増幅してフィルインおよびライゲーションコントロールを実行します。

6.超音波処理

  1. サンプルの130μL(一部がコントロールに使用された場合はヌクレアーゼフリー水で補充)を超音波処理に適したキュベットに移します。
  2. ウォーターバス超音波処理器をセットアップし、次のパラメータを使用して超音波処理します( 材料表に記載されているモデルとキュベット用に最適化されています):デューティファクター:20%;ピーク入射電力:50;バーストあたりのサイクル数:200;時間:65秒;温度範囲:6-10°C(8°C最適)。
  3. サンプルを新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。

7.エンドリペア

  1. マスターミックスを調製し、超音波処理中に作成されたDNA断片の不均一な末端を修復するために次の試薬を追加します:18μLの10xライゲーションバッファー、18μLの2.5mM dNTPミックス、6.5μLの3U /μL T4 DNAポリメラーゼ、6.5μLの10U/μL T4 PNK、および1.3μLの5U/μLクレノウ( 材料の表を参照)。
  2. サンプルを20°Cで30分間インキュベートし、トリス低EDTA(TLE)バッファー( 表1を参照)を300 μLに補充します。

8.ビオチンプルダウン

  1. サンプルあたり150 μLのC1ストレプトアビジンビーズ( 材料表を参照)を1.5 mLチューブに移し、1.5 mLチューブマグネットの上に置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ちます。ビーズを残して上清を取り除きます。
  2. ビーズを400 μLの1xトゥイーンバッファー(TB; 表1を参照)で洗浄します。ビーズを洗浄するには、バッファーを追加し、ソフトボルテックスで再懸濁します。チューブを磁石に戻し、2〜3分、またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ちます。ビーズを残して上清を取り除きます。
  3. ビーズを300 μLの1xトゥイーンなしバッファー(NTB; 表1を参照)で洗浄します。ビーズを300 μLの2x NTBに再懸濁します( 表1を参照)。
    注意: 洗剤なしでバッファーで洗浄すると、ビーズがチューブ壁の周りにほこりの多い層を形成する可能性があります。これは正常であり、プロトコルの結果には影響しません。
  4. この300 μLのビーズを2x NTBで300 μLのサンプルと組み合わせます。室温で回転させながら15分間インキュベートし、ビオチンで有益なDNA断片を引き下げます。ライブラリはC1ストレプトアビジンビーズに貼り付けられています。
  5. ビーズを400 μLの1x NTBで洗浄します。ビーズを100 μLのTLEバッファーで洗浄し、その後35.7 μLのTLEバッファーに再懸濁します。

9. dATPテーリング、アダプターライゲーション、PCR増幅

  1. マスターミックスを調製し、修復されたDNA断片の末端をdATPテールするためにサンプルに次の試薬を追加します:5 μLの10x制限バッファー2、2.3 μLの10 mM dATP、および7 μLの5 U/μLクレノウエキソ-。サンプルを37°Cで30分間インキュベートします。
  2. サンプルをさらに65°Cで10分間インキュベートすることにより、Klenowexo-を不活性化します。 サンプルを氷の上で冷却します。ビーズを300 μLの1x TBで洗浄します。ビーズを300 μLの1x NTBで洗浄します。
  3. ビーズを100 μLの1xライゲーションバッファーで洗浄し、その後50 μLの1xライゲーションバッファーに再懸濁します。4 μLの15 μMプレアニールアダプターミックス( 表2を参照)と1 μLの2,000 U/μL T4 DNAリガーゼ( 材料表を参照)をサンプルに追加します。
  4. 室温で2時間インキュベートします。ビーズを400 μLの1x TBで洗浄します。ビーズを200 μLの1x NTBで洗浄します。ビーズを100 μlの1x制限バッファー2で洗浄します。
  5. ビーズを50 μLの1x制限バッファー2で洗浄し、その後、50 μLの1x制限バッファー2に再懸濁します。
  6. 以下の試薬を混合してPCR反応を調製し、ライブラリーを増幅します:ライブラリーを含む50 μLのビーズ、酵素を含む250 μLの2x PCRマスターミックス、12 μLのF+Rプライマー(各25 μM、 表2を参照)、および188 μLのヌクレアーゼフリー水。
  7. 98°Cで40秒、続いて98°Cで10秒、65°Cで30秒、72°Cで30秒、72°Cで10分間のXサイクルの条件でPCRを行います(PCR試薬ミックスを50 μLの反応に分割し、72°Cで10分間終了します)。4°Cで保持する。
    注:ライブラリキャプチャの前に500〜1,000 ngの出力を目指す二倍体細胞のプロトコルを最適化するための出発点として、次のサイクル数を使用します:8サイクルで100万個の細胞。10サイクルで250,000セル。12サイクルで50,000セル。
  8. 同じサンプルからのすべての50 μL反応液を1.5 mL DNA低結合チューブにプールし、1.5 mLチューブマグネットに置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁に付着するまで待ちます。
  9. ライブラリーを含む上清(500 μL)を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。上清の一部が失われた場合は、TLEバッファーを500 μLまで補充します。C1ストレプトアビジンビーズはもう必要ありません。
  10. 常磁性ビーズ精製(0.4-1容量)を用いて両面選択55 を行う。これにより、添加する常磁性ビーズのポリエチレングリコールと塩の濃度に応じて、大きすぎる(>1,000 bp)および小さすぎるフラグメントまたはPCRプライマー(<200 bp)を選択的に除去できます。
  11. 200 μL(0.4容量)のストックビーズをライブラリに加え、ボルテックスで混合します。室温で回転させながら10分間インキュベートする。
  12. 磁石の上に置き、2〜3分、またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ってから、ライブラリを含む上清(大きな断片なし)を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
  13. 750 μLのストックビーズを採取してビーズを濃縮し、磁石上の1.5 mLチューブに入れ、2〜3分またはすべてのビーズが壁に付着するまで待ち、上清を取り除き、300 μLの新しいストックビーズにボルテックスしてビーズを再懸濁します。
  14. この300μLの濃縮ビーズをサンプル(1容量)に加え、ボルテックスで混合します。室温で回転させながら10分間インキュベートする。磁石の上に置き、2〜3分、またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ってから、上清(小さなフラグメントとPCRプライマーを含む)を取り除きます。
  15. ビーズを1 mLの70%エタノールで3回洗浄します。これを行うには、ビーズ付きのチューブがまだ磁石上にある間にエタノールを追加し、ビーズを乱さないようにし、30〜60秒待ちます。その後、ビーズを乱さずに上清を除去します。
  16. ビーズを風乾させ、ボルテックスによって21 μLのTLEバッファーに再懸濁します。
    注:ビーズを過度に乾燥させると、DNAを溶出する際の収量が低下する可能性があります。エタノールから「光沢」がなくなった直後にTLEバッファーに再懸濁することを目指します。
  17. サンプルをサーモブロック中で37°Cで10分間インキュベートし、ビーズからライブラリを溶出します。チューブを磁石に入れ、ライブラリを含む上清を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
  18. 自動電気泳動によりサイズと濃度を定量化します( 材料表を参照)。精製されたHi-C材料は、プロトコルを進める前に-20°Cで数ヶ月間保存できます。

10.ライブラリキャプチャ

  1. 500〜1,000 ngのライブラリで作業します。真空濃縮器を使用してDNAを乾燥させ、3.4 μLのヌクレアーゼフリー水に材料を再懸濁することにより、ライブラリを濃縮します。
  2. ターゲット濃縮キット( 材料表を参照)から次のブロッカーをサンプルに追加します:2.5 μLのブロッカー1、2.5 μLのブロッカー2、およびアダプター用の0.6 μLのカスタムオリゴブロッカー。
  3. 完全に再懸濁し、溶液を0.2 mLのPCRストリップに移し、サーモサイクラーで95°Cで5分間インキュベートした後、加熱した蓋で65°Cで5分間インキュベートします。チューブを65°Cでインキュベートしたままにします。
  4. サンプルあたりターゲット濃縮キット( 材料の表を参照)から以下の試薬を組み合わせてハイブリダイゼーション溶液を調製します(13 μL)。室温でベンチに保管してください:6.63 μLのHyb 1、0.27 μLのHyb 2、2.65 μLのHyb 3、および3.45 μLのHyb 4。
  5. ターゲット濃縮キットのRNaseブロック0.5 μLを、サンプルあたり1.5 μLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。サンプルあたり5 μLのビオチン化RNAを氷上で解凍し、2 μLの希釈RNaseブロックを加えます。室温でベンチに保管してください。
  6. 13 μLのハイブリダイゼーション溶液をRNaseを含む7 μLのビオチン化RNAに加え、よく混合します。
  7. 65°Cのサーモサイクラーで、ハイブリダイゼーション溶液とビオチン化RNA(20 μL)をブロックライブラリーに移します。チューブの蓋をしっかりと閉め、サーモサイクラーで65°Cで一晩インキュベートします。
    注:複数のサンプルを同時に実施する場合、サンプルの蒸発(RNA-DNAハイブリダイゼーションが最適ではない可能性があります)を最小限に抑えるには、マルチチャンネルピペットを使用してビオチン化RNAを各ライブラリに同時に移します。

11. ビオチンプルダウンとPCR増幅

  1. サンプルあたり50 μLのT1ストレプトアビジンビーズを1.5 mL DNA低結合チューブに移し、1.5 mLチューブマグネットに置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ちます。ビーズを残して上清を取り除きます。ターゲット濃縮キットからの200 μLの結合バッファーでビーズを3回洗浄します。
  2. ビーズを200 μLの結合バッファーに再懸濁します。65°Cのサーモサイクラーで、サンプルを再懸濁したT1ストレプトアビジンビーズに移し、室温で回転しながら30分間インキュベートします。
  3. ターゲット濃縮キットの洗浄バッファー1を200 μLでビーズを洗浄します。室温で回転させながら15分間インキュベートする。65°Cに加熱したターゲット濃縮キットからの200 μLの洗浄バッファー2でビーズを3回洗浄します。 サーモブロック中で65°Cで10分間インキュベートし、洗浄の合間に300 rpmで振とうします。
  4. ビーズを200 μLの1x制限バッファー2で洗浄し、その後、30 μLの1x制限バッファー2に再懸濁します。
  5. 以下の試薬を混合してPCR反応を調製し、ライブラリーを増幅します:ライブラリーを含む30 μLビーズ、酵素を含む150 μLの2x PCRマスターミックス、7.2 μLのF+Rプライマー(各25 μM、 表2を参照)、および112.8 μLのヌクレアーゼフリー水。
  6. 98°Cで40秒、続いて98°Cで10秒、65°Cで30秒、72°Cで30秒、72°Cで10分間の条件でPCRを行います。4°Cで保持する。
  7. 同じサンプルからのすべての50 μL反応液を1.5 mL DNA低結合チューブにプールし、1.5 mLチューブマグネットに置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁に付着するまで待ちます。
  8. ライブラリー(300 μL)を含む上清を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。上清の一部が失われた場合は、TLEバッファーを300 μLまで補充します。T1ストレプトアビジンビーズはもう必要ありません。
  9. 常磁性ビーズを使用してDNA精製を実行します(0.9ボリューム; 材料表を参照)。270 μLのストックビーズをサンプルに加え、ボルテックスで混合します。
  10. 室温で回転させながら10分間インキュベートする。
  11. 磁石の上に置き、2〜3分またはすべてのビーズが壁にくっつくまで待ってから、上清を取り除きます。
  12. ビーズを1 mLの70%エタノールで3回洗浄します。これを行うには、ビーズの入ったチューブがまだ磁石上にある間にエタノールを加え、ビーズを邪魔しないようにし、30〜60秒待ちます。その後、ビーズを乱さずに上清を除去します。
  13. ビーズを風乾させ、ボルテックスによって21 μLのTLEバッファーに再懸濁します。
    注:ビーズを過度に乾燥させると、DNAを溶出する際の収量が低下する可能性があります。エタノールから「光沢」がなくなった直後にTLEバッファーに再懸濁することを目指します。
  14. サンプルをサーモブロック中で37°Cで10分間インキュベートし、ビーズからライブラリを溶出します。
  15. チューブを磁石に入れ、ライブラリを含む上清を新しい1.5 mL DNA低結合チューブに移します。
  16. 自動電気泳動によりサイズと濃度を定量化します。

結果

liCHi-Cは、わずか50,000細胞で高品質で分解能の高いゲノムワイドプロモーターインタラクトームライブラリを生成する可能性を提供します53。これは、反応量の大幅な削減とプロトコル全体でのDNA低結合プラスチックウェアの使用に加えて、重大な材料損失が発生する元のプロトコルから不要なステップを削除することによって達成されます。これらには、脱架橋後のフェノ?...

ディスカッション

liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験フレームワークを使用して、細胞数を大幅に削減した高分解能プロモーターインタラクトームライブラリを生成する機能を提供します。これは、フェノール精製やビオチン除去などの不要なステップを排除することによって大きく達成されます。古典的な核内ライゲーションHi-Cプロトコル57 およびそれに続く派生技術PCHi-Cでは、ビオチンは、後?...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

原稿に対するフィードバックを提供してくれたハビエールラボの他のメンバーに感謝します。我々は、CERCAプログラム、カタルーニャ州政府、及びジョセップ・カレーラス財団の制度的支援に感謝する。この研究は、FEDER/スペイン科学イノベーション省(RTI2018-094788-A-I00)、欧州血液学会(4823998)、およびスペインがん協会(AECC)LABAE21981JAVIによって資金提供されました。BMJはラカイシャ銀行財団ジュニアリーダープロジェクト(LCF/BQ/PI19/11690001)から資金提供を受け、LRはAGAUR FIフェローシップ(2019FI-B00017)から資金提供を受け、LT-DはFPIフェローシップ(PRE2019-088005)から資金提供されています。バルセロナ自治大学の生化学および分子生物学博士課程の支援に感謝します。資金提供者の誰も、実験計画や原稿の執筆には関与していませんでした。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TFor ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 units/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesFor automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagentsAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biologyPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

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