希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

要約

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture Hi-C(liCHi-C)により、以前は測定できなかった希少細胞型におけるこれらの相互作用の同定がどのように可能になるかを説明します。

要約

時空間的な遺伝子転写は、転写を制御するために標的遺伝子プロモーターとの物理的な近接に依存するエンハンサーやサイレンサーなどの遠位調節要素によって厳密に制御されています。これらの調節要素は同定が容易ですが、それらのほとんどは細胞型特異的であり、線形ゲノム配列において数百キロ塩基離れている可能性があり、他の非標的遺伝子をスキップするため、それらの標的遺伝子を予測することは困難です。数年前から、プロモーターキャプチャーHi-C(PCHi-C)は、遠位調節エレメントを標的遺伝子に関連付けるためのゴールドスタンダードでした。しかし、PCHi-Cは数百万の細胞の入手可能性に依存しており、初代組織から一般的に得られるような希少細胞集団の研究を禁止しています。この制限を克服するために、ゲノムの各遺伝子を制御する遠位調節要素のレパートリーを同定するための費用効果が高くカスタマイズ可能な方法である低入力Capture Hi-C(liCHi-C)が開発されました。liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験および計算フレームワークに依存していますが、チューブの変更を最小限に抑え、試薬の濃度と量を変更し、ステップを交換または排除することにより、ライブラリ構築中の材料損失を最小限に抑えます。liCHi-Cは、発生生物学と細胞機能の文脈における遺伝子制御と時空間ゲノム構成の研究を可能にします。

概要

時間的な遺伝子発現は細胞の分化を促進し、最終的には生物の発生を促進し、その変化は幅広い疾患と密接に関連しています1,2,3,4,5。遺伝子転写は、近位(すなわち、遺伝子プロモーター)および遠位(例えば、エンハンサーまたはサイレンサー)に分類され得る調節要素の作用によって細かく制御され、後者はしばしば標的遺伝子から遠くに位置し、クロマチンループを介してそれらと物理的に相互作用して遺伝子発現を調節する^6,7,8。

ゲノム中の遠位調節領域の同定は、これらの領域が特異的なヒストン修飾9,10,11を有し、特異的な転写因子認識モチーフを含み、それらの募集プラットフォームとして機能するため、広く合意されている問題である^12,13,14

プロトコル

材料の損失を最小限に抑えるには、(1)DNA低結合チューブとチップ( 材料表を参照)を使用し、(2)チップをサンプル内に導入する代わりにチューブ壁に試薬を配置し、(3)可能であれば、サンプルを上下にピペッティングする代わりに反転によってサンプルを混合し、その後スピンダウンしてサンプルを回収します。

1.細胞固定

1. 浮遊状態で増殖する細胞
   1. 50,000〜100万個の細胞を採取し、DNA低結合1.5 mLチューブに入れます。
      注:本研究に用いた細胞型は、代表的な結果のセクションで詳述されています。
   2. 固定角度ローター遠心分離機を使用して細胞を600 x g (4°C)で5分間遠心分離し、ピペッティングで上清を除去します。
   3. 室温で10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した1 mLのRPMI 1640に細胞を再懸濁します。
   4. メタノールを含まない16%ホルムアルデヒド143μLを加えて濃度2%にし、混合します。
   5. 室温で回転させながら細胞を10分間インキュベートし、細胞を固定します。
      注:10分間のインキュベーションでできるだけ正確になるようにしてください。細胞の過剰または過小固定は、ライブラリの品質の低下につながる可能性があります。
   6. 氷冷した1 Mグリシン....

ディスカッション

liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験フレームワークを使用して、細胞数を大幅に削減した高分解能プロモーターインタラクトームライブラリを生成する機能を提供します。これは、フェノール精製やビオチン除去などの不要なステップを排除することによって大きく達成されます。古典的な核内ライゲーションHi-Cプロトコル⁵⁷ およびそれに続く派生技術PCHi-Cでは、ビオチンは、後?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML