Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Özet

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Özet

Spatiotemporal gen transkripsiyonu, transkripsiyonu kontrol etmek için hedef gen promotörleriyle fiziksel yakınlığa dayanan arttırıcılar ve susturucular gibi distal düzenleyici unsurlar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu düzenleyici elementlerin tanımlanması kolay olsa da, hedef genlerinin tahmin edilmesi zordur, çünkü çoğu hücre tipine özgüdür ve doğrusal genom dizisinde yüzlerce kilobaz ile ayrılabilir, diğer hedef olmayan genleri atlayabilir. Birkaç yıldır, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), distal düzenleyici elementlerin hedef genleriyle ilişkilendirilmesinde altın standart olmuştur. Bununla birlikte, PCHi-C, milyonlarca hücrenin mevcudiyetine dayanır ve birincil dokulardan yaygın olarak elde edilenler gibi nadir hücre popülasyonlarının incelenmesini yasaklar. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, genomun her genini kontrol eden distal düzenleyici elemanların repertuarını tanımlamak için uygun maliyetli ve özelleştirilebilir bir yöntem olan düşük girdili Capture Hi-C (liCHi-C) geliştirilmiştir. liCHi-C, PCHi-C ile benzer bir deneysel ve hesaplamalı çerçeveye dayanır, ancak minimum tüp değişiklikleri kullanarak, reaktif konsantrasyonunu ve hacimlerini değiştirerek ve adımları değiştirerek veya ortadan kaldırarak, kütüphane inşaatı sırasında minimum malzeme kaybını hesaba katar. Toplu olarak, liCHi-C, gelişimsel biyoloji ve hücresel fonksiyon bağlamında gen regülasyonu ve mekansal temporal genom organizasyonunun incelenmesini sağlar.

Giriş

Zamansal gen ekspresyonu, hücre farklılaşmasını ve nihayetinde organizma gelişimini yönlendirir ve değişimi, çok sayıda hastalıkla yakından ilişkilidir 1,2,3,4,5. Gen transkripsiyonu, proksimal (yani gen promotörleri) ve distal (örneğin, arttırıcılar veya susturucular) olarak sınıflandırılabilen düzenleyici elementlerin etkisiyle ince bir şekilde düzenlenir, ikincisi sıklıkla hedef genlerinden uzakta bulunur ve gen ekspresyonunu modüle etmek için kromatin döngüsü yoluyla fiziksel olarak onlarla etkileşime g....

Protokol

Minimum malzeme kaybını sağlamak için, (1) DNA düşük bağlayıcı tüpler ve uçlarla çalışın (bakınız Malzeme Tablosu), (2) ucu numunenin içine sokmak yerine tüp duvarına reaktifler yerleştirin ve (3) mümkünse, numuneyi yukarı ve aşağı pipetlemek yerine ters çevirerek numuneyi karıştırın ve numuneyi geri kazanmak için daha sonra aşağı doğru döndürün.

1. Hücre fiksasyonu

1. Süspansiyonda büyüyen hücreler
   1. 50.000 ila bir milyon hücre toplayın ve bunları düşük bağlanan 1.5 mL'lik bir DNA tüpüne yerleştirin.
      NOT: Bu çalışma için kullanılan hücre tipleri temsili sonuçlar bölümünde detaylandırılmıştır....

Tartışmalar

liCHi-C, PCHi-C'lerden benzer bir deneysel çerçeve kullanarak yüksek çözünürlüklü promotör interaktom kütüphaneleri oluşturma yeteneği sunar, ancak büyük ölçüde azaltılmış hücre sayısına sahiptir. Bu, fenol saflaştırma ve biyotin giderimi gibi gereksiz adımları ortadan kaldırarak büyük ölçüde elde edilir. Klasik çekirdek içi ligasyon Hi-C protokolü⁵⁷ ve sonraki türev tekniği PCHi-C'de, biyotin, daha sonra bilgilendirici olmayan DNA parçalarının aşağı ?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML