Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Zusammenfassung

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Zusammenfassung

Die räumlich-zeitliche Gentranskription wird durch distale regulatorische Elemente wie Enhancer und Silencer streng reguliert, die auf die physische Nähe zu ihren Zielgenpromotoren angewiesen sind, um die Transkription zu kontrollieren. Obwohl diese regulatorischen Elemente leicht zu identifizieren sind, sind ihre Zielgene schwer vorherzusagen, da die meisten von ihnen zelltypspezifisch sind und in der linearen Genomsequenz durch Hunderte von Kilobasen getrennt sein können, wodurch andere Nicht-Zielgene übersprungen werden. Seit einigen Jahren ist Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) der Goldstandard für die Assoziation von distalen regulatorischen Elementen mit ihren Zielgenen. PCHi-C ist jedoch auf die Verfügbarkeit von Millionen von Zellen angewiesen, was die Untersuchung seltener Zellpopulationen, wie sie üblicherweise aus primären Geweben gewonnen werden, verbietet. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine kostengünstige und anpassbare Methode zur Identifizierung des Repertoires an distalen regulatorischen Elementen, die jedes Gen des Genoms steuern. liCHi-C basiert auf einem ähnlichen experimentellen und rechnerischen Rahmen wie PCHi-C, aber durch minimale Röhrchenwechsel, Modifikation der Reagenzienkonzentration und -volumina sowie Austausch oder Eliminierung von Schritten wird ein minimaler Materialverlust während des Bibliotheksaufbaus verursacht. Insgesamt ermöglicht liCHi-C die Untersuchung der Genregulation und der raumzeitlichen Genomorganisation im Kontext der Entwicklungsbiologie und der zellulären Funktion.

Einleitung

Die zeitliche Genexpression treibt die Zelldifferenzierung und letztendlich die Entwicklung von Organismen voran, und ihre Veränderung steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheiten 1,2,3,4,5. Die Gentranskription wird durch die Wirkung von regulatorischen Elementen fein reguliert, die als proximal (d. h. Genpromotoren) und distale (z. B. Enhancer oder Silencer) klassifiziert werden können, von denen letztere häufig weit von ihren Zielgenen entfernt sind und physisch mit ihnen durch Chromati....

Protokoll

Um einen minimalen Materialverlust zu gewährleisten, (1) arbeiten Sie mit DNA-Röhrchen und -Spitzen mit geringer Bindung (siehe Materialtabelle), (2) platzieren Sie Reagenzien an der Röhrchenwand, anstatt die Spitze in die Probe einzuführen, und (3) mischen Sie die Probe nach Möglichkeit durch Inversion, anstatt die Probe auf und ab zu pipettieren, und schleudern Sie sie anschließend nach unten, um die Probe zu gewinnen.

1. Fixierung der Zellen

1. Zellen, die in Suspension wachsen
   1. Ernten Sie 50.000 bis eine Million Zellen und legen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit geringer DNA-Bindung.
      HI....

Diskussion

liCHi-C bietet die Möglichkeit, hochauflösende Promotor-Interaktom-Bibliotheken zu generieren, indem ein ähnlicher experimenteller Rahmen wie PCHi-Cs verwendet wird, jedoch mit einer stark reduzierten Zellzahl. Dies wird in hohem Maße durch den Wegfall unnötiger Schritte wie Phenolreinigung und Biotinentfernung erreicht. Beim klassischen Hi-C-Protokoll⁵⁷ für die Ligatur im Zellkern und seiner nachfolgenden Derivatetechnik PCHi-C wird Biotin aus nicht-ligierten Restriktionsfragmenten entfernt.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML