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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Résumé

La transcription des gènes spatio-temporels est étroitement régulée par des éléments régulateurs distaux, tels que les amplificateurs et les silencieux, qui s’appuient sur la proximité physique avec leurs promoteurs de gènes cibles pour contrôler la transcription. Bien que ces éléments régulateurs soient faciles à identifier, leurs gènes cibles sont difficiles à prédire, car la plupart d’entre eux sont spécifiques au type cellulaire et peuvent être séparés par des centaines de kilobases dans la séquence linéaire du génome, ignorant d’autres gènes non cibles. Depuis plusieurs années, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est l’étalon-or pour l’association d’éléments régulateurs distaux à leurs gènes cibles. Cependant, PCHi-C repose sur la disponibilité de millions de cellules, interdisant l’étude de populations de cellules rares telles que celles couramment obtenues à partir de tissus primaires. Pour surmonter cette limitation, une méthode de capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une méthode rentable et personnalisable pour identifier le répertoire d’éléments régulateurs distaux contrôlant chaque gène du génome, a été développée. liCHi-C s’appuie sur un cadre expérimental et informatique similaire à celui de PCHi-C, mais en utilisant des changements de tube minimes, en modifiant la concentration et les volumes de réactifs, et en échangeant ou en éliminant les étapes, il tient compte des pertes de matériaux minimales lors de la construction de la bibliothèque. Collectivement, liCHi-C permet l’étude de la régulation des gènes et de l’organisation spatio-temporelle du génome dans le contexte de la biologie du développement et de la fonction cellulaire.

Introduction

L’expression génique temporelle entraîne la différenciation cellulaire et, en fin de compte, le développement de l’organisme, et son altération est étroitement liée à une large pléthore de maladies 1,2,3,4,5. La transcription des gènes est finement régulée par l’action d’éléments régulateurs, qui peuvent être classés comme proximaux (promoteurs de gènes) et distaux (par exemple, amplificateurs ou silencieux), ces derniers étant fréquemment situés loin de leurs gènes cibles et interagissent physiquement avec eux par boucle de chromatine pour moduler l’expression des gènes 6,7,8.

L’identification des régions régulatrices distales dans le génome est une question qui fait l’objet d’un large consensus, puisque ces régions abritent des modifications spécifiques des histones 9,10,11 et contiennent des motifs spécifiques de reconnaissance des facteurs de transcription, agissant comme des plates-formes de recrutement pour eux12,13,14. En outre, dans le cas des amplificateurs et des super-amplificateurs 15,16, ils ont également une faible occupation des nucléosomes 17,18 et sont transcrits en ARNe non codants 19,20.

Néanmoins, les gènes cibles de chaque élément régulateur distal sont plus difficiles à prédire. Le plus souvent, les interactions entre les éléments régulateurs distaux et leurs cibles sont de type cellulaire et spécifiques au stimulus 21,22, couvrent des centaines de kilobases, reliant d’autres gènes dans n’importe quelle direction 23,24,25, et peuvent même être situées à l’intérieur des régions introniques de leur gène cible ou d’autres gènes non intermédiaires 26,27. De plus, les éléments régulateurs distaux peuvent également contrôler plus d’un gène à la fois, et vice versa28,29. Cette complexité positionnelle empêche de déterminer les associations régulatrices entre eux et, par conséquent, la plupart des cibles de chaque élément régulateur dans chaque type de cellule restent inconnues.

Au cours des dernières années, il y a eu un essor significatif dans le développement des techniques de capture de conformation chromosomique (3C) pour étudier les interactions de la chromatine. Le plus utilisé d’entre eux, Hi-C, permet de générer une carte de toutes les interactions entre chaque fragment du génome d’une cellule30. Cependant, pour détecter des interactions significatives au niveau des fragments de restriction, Hi-C s’appuie sur le séquençage ultra-profond, interdisant son utilisation pour étudier systématiquement le paysage régulateur des gènes individuels. Pour surmonter cette limitation économique, plusieurs techniques 3C basées sur l’enrichissement ont émergé, telles que-PET31, HiChIP 32 et son homologue à faible intrant HiCuT33. Ces techniques dépendent de l’utilisation d’anticorps pour enrichir les interactions à l’échelle du génome médiées par une protéine spécifique. Néanmoins, la caractéristique unique de ces techniques 3C est également le fléau de leur application; Les utilisateurs comptent sur la disponibilité d’anticorps de haute qualité pour la protéine d’intérêt et ne peuvent pas comparer les conditions dans lesquelles la liaison de la protéine est dynamique.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est une autre technique 3C basée sur l’enrichissement qui contourne ces limitations34,35. En utilisant un système d’enrichissement de sonde à ARN biotinylé, PCHi-C est capable de générer des bibliothèques à haute résolution à l’échelle du génome de régions génomiques interagissant avec 28 650 promoteurs de gènes annotés par des humains ou 27 595 souris, également connus sous le nom d’interactome promoteur. Cette approche permet de détecter des interactions significatives à longue distance à la résolution au niveau des fragments de restriction des promoteurs actifs et inactifs, et de comparer de manière robuste les interactomes promoteurs entre n’importe quelle condition, indépendamment de la dynamique des modifications des histones ou de la liaison aux protéines. Le PCHi-C a été largement utilisé ces dernières années pour identifier les réorganisations d’interactomes promoteurs au cours de la différenciation cellulaire 36,37, identifier le mécanisme d’action des facteurs de transcription38,39 et découvrir de nouveaux gènes et voies potentiels dérégulés dans la maladie par des variantes non codantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, aux côtés de nouvelles mutations non codantes49,50. En outre, en modifiant simplement le système de capture, cette technique peut être personnalisée en fonction de la question biologique pour interroger n’importe quel interactome (par exemple, l’interactome amplificateur 51 ou l’interactome d’une collection d’altérations non codantes41,52).

Cependant, PCHi-C s’appuie sur un minimum de 20 millions de cellules pour effectuer la technique, ce qui empêche l’étude de populations cellulaires rares telles que celles souvent utilisées en biologie du développement et dans les applications cliniques. Pour cette raison, nous avons développé le Capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une nouvelle méthode rentable et personnalisable basée sur le cadre expérimental de PCHi-C pour générer des interactomes promoteurs à haute résolution avec une entrée cellulaire faible. En effectuant l’expérience avec un minimum de changements de tube, en échangeant ou en éliminant des étapes du protocole PCHi-C original, en réduisant considérablement les volumes de réaction et en modifiant les concentrations de réactifs, la complexité de la bibliothèque est maximisée et il est possible de générer des bibliothèques de haute qualité avec aussi peu que 50 000 cellules53.

Le Hi-C à capture à faible entrée (liCHi-C) a été comparé au PCHi-C et utilisé pour élucider le recâblage de l’interactome promoteur au cours de la différenciation des cellules hématopoïétiques humaines, découvrir de nouveaux gènes et voies potentiellement associés à la maladie dérégulés par des altérations non codantes et détecter des anomalies chromosomiques53. Le protocole étape par étape et les différents contrôles de qualité à travers la technique sont détaillés ici jusqu’à la génération finale des bibliothèques et leur analyse informatique.

Protocole

Pour assurer une perte matérielle minimale, (1) travailler avec des tubes et des embouts à faible liaison d’ADN (voir le tableau des matériaux), (2) placer des réactifs sur la paroi du tube au lieu d’introduire l’embout à l’intérieur de l’échantillon et, (3) si possible, mélanger l’échantillon par inversion au lieu de pipeter l’échantillon de haut en bas, et tourner vers le bas par la suite pour récupérer l’échantillon.

1. Fixation cellulaire

  1. Cellules se développant en suspension
    1. Récoltez de 50 000 à un million de cellules et placez-les dans un tube de 1,5 ml à faible liaison.
      REMARQUE : Les types de cellules utilisés pour la présente étude sont détaillés dans la section des résultats représentatifs.
    2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 600 x g (à 4 °C) à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe et retirer le surnageant par pipetage.
    3. Resuspendre les cellules dans 1 mL de RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à température ambiante.
    4. Ajouter 143 μL de formaldéhyde à 16 % sans méthanol pour atteindre une concentration de 2 % et mélanger.
    5. Incuber les cellules pendant 10 min tout en tournant à température ambiante pour fixer les cellules.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi précis que possible avec l’incubation de 10 minutes. Une sur- ou une sous-fixation des cellules peut entraîner une diminution de la qualité de la bibliothèque.
    6. Éteindre la réaction en ajoutant 164 μL de glycine 1 M glacée et mélanger. Incuber les cellules pendant 5 min, en tournant à température ambiante.
    7. Incuber ensuite les cellules pendant 15 minutes sur de la glace, en mélangeant par inversion toutes les ~5 minutes.
    8. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe et retirer le surnageant.
    9. Lavez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS).
    10. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) et retirer le surnageant.
      REMARQUE: Les cellules granulées peuvent être surgelées dans de l’azote liquide ou de la glace sèche et stockées à -80 ° C.
  2. Cellules adhérentes
    1. Lavez les cellules dans le plat de culture avec 1x PBS.
    2. Préparer suffisamment de RPMI 1640 complété par 10% de FBS et de formaldéhyde sans méthanol à 2% à température ambiante pour couvrir la boîte de culture.
    3. Ajouter le milieu supplémenté à la capsule de culture avec les cellules et incuber pendant 10 min, en berçant à température ambiante pour fixer les cellules.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi précis que possible avec l’incubation de 10 minutes. Une sur- ou une sous-fixation des cellules peut entraîner une diminution de la qualité de la bibliothèque.
    4. Éteindre la réaction en ajoutant 1 M de glycine jusqu’à 0,125 M et mélanger par balancement.
    5. Incuber les cellules pendant 5 min, en les berçant à température ambiante.
    6. Incuber ensuite les cellules pendant 15 min à 4 °C, en mélangeant en berçant toutes les 3-4 minutes.
    7. Retirez le support et lavez les cellules avec du PBS 1x froid.
    8. Grattez les cellules et transférez-les dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL. Essuyez le plat de culture avec 0,5-1 mL de 1x PBS froid.
    9. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe et retirer le surnageant. Les cellules granulées peuvent être surgelées dans de l’azote liquide ou de la glace sèche et stockées à -80 °C.

2. Lyse et digestion

  1. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon de lyse froide (tableau 1) pour perturber la membrane cellulaire. L’ajout du tampon seul devrait suffire à remettre les cellules en suspension, mais elles peuvent être remises en suspension si nécessaire par vortex lumineux.
  2. Incuber sur la glace pendant 30 min, en mélangeant par inversion toutes les ~5 min. Centrifuger les noyaux pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez les noyaux en suspension avec 500 μL de tampon de restriction froid 1,25x 2 (voir le tableau des matériaux).
  3. Centrifuger les noyaux pendant 10 min à 1 000 x g (à 4 °C) et retirer le surnageant. Resuspendre les noyaux dans 179 μL de tampon de restriction 1,25x 2.
  4. Ajouter 5,5 μL de dodécylsulfate de sodium à 10 % (FDS; voir le tableau des matières) et mélanger. Les cellules peuvent former des amas ; Ceci est normal et doit être désagrégé autant que possible par vortex. Incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min.
  5. Éteignez la FDS en ajoutant 37,5 μL de Triton X-100 à 10 % et mélangez. Incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min.
  6. Digérer la chromatine en ajoutant 7,5 μL de HindIII (100 U/μL; voir le tableau des matières) et mélanger. Incuber l’échantillon pendant une nuit à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min.
  7. Le lendemain matin, ajoutez 2,5 μL supplémentaires de HindIII (100 U/μL) et incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C dans un thermobloc, en agitant à 950 tr/min pour assurer une bonne digestion de la chromatine.
    REMARQUE : Dans le cadre des contrôles de l’efficacité de la digestion (voir étape 5.1), transférer l’équivalent de 20 000 à 40 000 noyaux dans un autre tube pour représenter le témoin non digéré. Après la digestion, transférer à nouveau le même nombre de cellules dans un autre tube pour représenter le contrôle digéré. Il est recommandé de tester l’efficacité de la digestion dans le cadre d’une expérience distincte si la disponibilité de la matière première est rare.

3. Ligature et réticulation

  1. Refroidir l’échantillon sur de la glace. Préparer un mélange principal et ajouter les réactifs suivants pour remplir et biotinyler les surplombs de fragments de restriction : 3 μL de tampon de restriction 10x 2, 1 μL d’eau sans nucléase, 0,75 μL de 10 mM de dCTP, 0,75 μL de 10 mM dTTP, 0,75 μL de 10 mM dGTP, 18,75 μL de 0,4 mM de biotine-14-dATP et 5 μL de 5 U/μL de Klenow (voir le tableau des matériaux). Incuber l’échantillon pendant 75 min à 37 °C, en mélangeant par inversion toutes les ~15 min.
  2. Refroidir l’échantillon sur de la glace. Préparez un mélange principal et ajoutez les réactifs suivants pour ligaturer les extrémités d’ADN remplies : 50 μL de tampon de ligature 10x, 2,5 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 20 mg/mL, 12,5 μL d’ADN ligase T4 à 1 U/μL et 173 μL d’eau exempte de nucléases (voir le tableau des matériaux).
  3. Incuber l’échantillon pendant 4-6 h à 16 °C, en mélangeant par inversion toutes les ~1 h. De plus, incuber l’échantillon pendant 30 minutes à température ambiante. Dissocier la chromatine en ajoutant 30 μL de 10 mg/mL de protéinase K et mélanger. Incuber l’échantillon pendant une nuit à 65 °C.
  4. Le lendemain matin, ajouter 15 μL supplémentaires de 10 mg/mL de protéinase K et incuber davantage l’échantillon pendant 2 h à 65 °C pour assurer une réticulation adéquate de la chromatine.

4. Purification de l’ADN

  1. Refroidir l’échantillon à température ambiante et le transférer dans un tube approprié pour la purification phénol-chloroforme.
  2. Ajouter 1 volume (545 μL) de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) pour purifier l’ADN et mélanger en agitant vigoureusement.
  3. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 12 000 x g à température ambiante et transférer la phase aqueuse supérieure (545 μL) dans un tube à faible liaison d’ADN de 2 mL.
  4. Ajouter les réactifs suivants pour précipiter l’ADN : 1 362,5 μL d’éthanol à 100 % refroidi à -20 °C, 54,5 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 2 μL de glycogène à 15 mg/mL comme coprécipitant.
  5. Incuber pendant 1 h à -80 °C ou une nuit à -20 °C.
  6. Centrifuger l’échantillon pendant 30 min à 16 000-21 000 x g à 4 °C et retirer le surnageant. La pastille d’ADN doit être visible.
  7. Lavez la pastille en ajoutant 1 mL d’éthanol à 70 %, en tourbillonnant et en centrifugeant pendant 10 minutes à 16 000-21 000 x g à température ambiante.
  8. Retirez le surnageant et laissez sécher le granulé à l’air. Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 130 μL d’eau exempte de nucléase.
  9. Évaluer la concentration par quantification fluorométrique (voir le tableau des matériaux). Conservez le matériau 3C purifié à -20 °C pendant plusieurs mois avant de procéder au protocole.

5. Contrôles de qualité facultatifs

  1. Évaluer l’efficacité de la digestion. Effectuer la réticulation et la purification de l’ADN phénol:chloroforme, comme décrit précédemment, aux contrôles non digérés et digérés obtenus à l’étape 2.13. Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 10 μL d’eau sans nucléase. Quantifier la concentration et diluer l’ADN obtenu, si nécessaire, à 4 ng/μL.
  2. Effectuer une PCR quantitative avec 4 ng d’ADN des témoins non digérés et digérés, avec des amorces couvrant un locus de chromatine ouvert avec et sans cible HindIII (voir le tableau 2 pour la conception de l’amorce). Calculer l’efficacité de la digestion à la suite d’un rapport précédemment publié35.
    NOTE: L’efficacité de la ligature est calculée en pourcentage à l’aide de la formule: digestion (%) = 100 -100/(2^[(Ct digéré avec HindIII - Ctdigested sans HindIII) - (Ct non digéré avec HindIII - Ct non digéré sans HindIII)]) (voir tableau 3), qui prend en compte la différence des différents Cts obtenus pour chaque paire d’amorces chez les témoins non digérés et digérés.
  3. Évaluer la sensibilité de la détection d’interaction en effectuant une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) conventionnelle (0,2 mM de dNTP, 0,4 μm d’amorces F + R, 0,1 et U/μL de polymérase à démarrage), avec des amorces couvrant les interactions cellulaires invariantes à longue et à courte portée (voir le tableau 2 pour la conception de l’amorce). Utiliser 50-100 ng de matériau 3C (pour les interactions à courte et longue portée, respectivement) et amplifier dans les conditions suivantes : 98 °C pendant 15 min, suivi de 37 cycles de 98 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 min, et terminer à 72 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.
    REMARQUE: Si la quantité d’ADN obtenue est inférieure à 2 μg, ne vérifiez qu’une interaction à longue et à courte portée au lieu de l’ensemble du panel d’interaction.
  4. Exécutez le produit sur 1x tris-borate-EDTA (TBE) en utilisant du gel d’agarose à 1,6% et recherchez la présence de l’amplicon PCR54 correspondant.
    REMARQUE: En raison du « copier-coller » imprévisible du génome, des bandes non spécifiques peuvent apparaître. Tant que la taille de bande correcte est respectée, elle est comptée comme correcte.
  5. Évaluer l’efficacité du remplissage et de la ligature de la biotine en digérant différemment un produit de PCR à courte portée avec HindIII, NheI (voir le tableau des matériaux), les deux enzymes ou aucune (eau), et en faisant fonctionner le produit sur un gel d’agarose 1,6% de TBE 1x. Un remplissage et une ligature corrects éliminent la cible HindIII précédente et créent une nouvelle cible NheI, de sorte que l’amplicon ne doit être coupé qu’en présence de NheI.
    REMARQUE : Pour minimiser les pertes de matière, récupérez 2,5 μL d’un produit PCR à courte portée des contrôles d’interaction et réamplifiez-le cinq fois pour effectuer les contrôles de remplissage et de ligature.

6. Sonication

  1. Transférer les 130 μL de l’échantillon (compléter avec de l’eau sans nucléase si une partie a été utilisée pour les témoins) dans une cuvette adaptée à la sonication.
  2. Installez un sonicateur à bain-marie et sonicatez en utilisant les paramètres suivants (optimisés pour le modèle et les cuvettes décrits dans le tableau des matériaux) : facteur de service: 20%; puissance d’incidence de pointe: 50; cycles par rafale: 200; temps: 65 s; et plage de température: 6-10 °C (8 °C optimal).
  3. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.

7. Réparation finale

  1. Préparez un mastermix et ajoutez les réactifs suivants pour réparer les extrémités inégales des fragments d’ADN créées pendant la sonication : 18 μL de tampon de ligature 10x, 18 μL de mélange dNTP 2,5 mM chacun, 6,5 μL de 3 U/μL d’ADN polymérase T4, 6,5 μL de 10 U/μL T4 PNK et 1,3 μL de 5 U/μL de Klenow (voir le tableau des matériaux).
  2. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 20 °C et compléter avec un tampon Tris-low EDTA (TLE) (voir tableau 1) jusqu’à 300 μL.

8. Extraction de biotine

  1. Transfèrent 150 μL de billes de streptavidine C1 (voir le tableau des matières) par échantillon dans un tube de 1,5 mL, placez-les sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2 à 3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur. Retirez le surnageant, en laissant les perles derrière.
  2. Lavez les billes avec 400 μL de 1x tampon Tween (TB; voir le tableau 1). Pour laver les perles, ajoutez le tampon et remettez-les en suspension par vortex doux. Replacez le tube dans l’aimant et attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur. Retirez le surnageant, en laissant les perles derrière.
  3. Lavez les billes avec 300 μL de tampon 1x sans préadolescent (NTB; voir le tableau 1). Remettez les billes en suspension dans 300 μL de 2x NTB (voir le tableau 1).
    REMARQUE: Les billes peuvent former une couche poussiéreuse autour de la paroi du tube lors du lavage avec des tampons sans détergent. Ceci est normal et n’affecte pas le résultat du protocole.
  4. Combinez ces 300 μL de billes dans 2x NTB avec les 300 μL de l’échantillon. Incuber pendant 15 min, en tournant à température ambiante pour abattre les fragments d’ADN informatifs avec de la biotine. La bibliothèque est maintenant collée aux perles de streptavidine C1.
  5. Laver les billes avec 400 μL de 1x NTB. Lavez les billes avec 100 μL de tampon TLE et remettez-les ensuite en suspension dans 35,7 μL de tampon TILE.

9. dATP-tailing, ligature de l’adaptateur et amplification PCR

  1. Préparer un mélange principal et ajouter les réactifs suivants à l’échantillon pour dATP-tail les extrémités des fragments d’ADN réparés: 5 μL de tampon de restriction 10x 2, 2,3 μL de 10 mM dATP et 7 μL de 5 U/μL Klenow exo-. Incuber l’échantillon pendant 30 min à 37 °C.
  2. Inactiver Klenow exo- en incubant davantage l’échantillon pendant 10 min à 65 °C. Refroidir l’échantillon sur de la glace. Lavez les billes avec 300 μL de 1x TB. Lavez les billes avec 300 μL de 1x NTB.
  3. Lavez les billes avec 100 μL de 1x tampon de ligature et remettez-les ensuite en suspension dans 50 μL de 1x tampon de ligature. Ajouter 4 μL de mélange d’adaptateurs précuits de 15 μM (voir le tableau 2) et 1 μL d’ADN ligase T4 de 2 000 U/μL (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon.
  4. Incuber pendant 2 h à température ambiante. Lavez les billes avec 400 μL de 1x TB. Lavez les billes avec 200 μL de 1x NTB. Laver les billes avec 100 μl de 1x tampon de restriction 2.
  5. Laver les billes avec 50 μL de 1x tampon de restriction 2 et les remettre ensuite en suspension dans 50 μL de 1x tampon de restriction 2.
  6. Mélanger les réactifs suivants pour préparer la réaction de PCR afin d’amplifier la bibliothèque : 50 μL de billes avec la bibliothèque, 250 μL de 2x mélanges maîtres PCR avec enzyme, 12 μL d’amorces F + R (25 μM chacune; voir Tableau 2) et 188 μL d’eau sans nucléase.
  7. Effectuer la PCR dans les conditions suivantes (diviser le mélange de réactifs PCR en réactions de 50 μL) : 98 °C pendant 40 s, suivi de X cycles de 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s, et terminer à 72 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.
    REMARQUE: Utilisez le nombre de cycles suivant comme point de départ pour optimiser le protocole dans les cellules diploïdes visant une sortie de 500 à 1 000 ng avant la capture de la bibliothèque: un million de cellules pour huit cycles; 250 000 cellules pour 10 cycles; 50 000 cellules pour 12 cycles.
  8. Regroupez toutes les réactions de 50 μL du même échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL, placez-le sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur.
  9. Transférer le surnageant contenant la bibliothèque (500 μL) dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL. Complétez avec un tampon TLE à 500 μL si une partie du surnageant a été perdue. Les billes de streptavidine C1 ne sont plus nécessaires.
  10. Effectuer une sélection recto-verso55 en utilisant la purification paramagnétique des billes (volume 0,4-1). Cela permet l’élimination sélective des fragments trop gros (>1 000 pb) et trop petits ou des amorces PCR (<200 pb), en fonction de la concentration de polyéthylène glycol et du sel des billes paramagnétiques ajoutées.
  11. Ajouter 200 μL (0,4 volume) de billes de bouillon à la bibliothèque et mélanger par vortex. Incuber pendant 10 min, en tournant à température ambiante.
  12. Placer sur un aimant, attendre 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur, et transférer le surnageant contenant la bibliothèque (sans les plus gros fragments) dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.
  13. Concentrez les billes en prenant 750 μL de billes de bouillon, placez-les dans un tube de 1,5 mL sur un aimant, attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur, retirez le surnageant et remettez les perles en suspension en tourbillonnant dans 300 μL de nouvelles billes de stock.
  14. Ajouter ces 300 μL de billes concentrées à l’échantillon (1 volume) et mélanger par vortex. Incuber pendant 10 min, en tournant à température ambiante. Placer sur un aimant, attendre 2-3 min ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur, et retirer le surnageant (contenant les plus petits fragments et les amorces PCR).
  15. Lavez les billes trois fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Pour ce faire, ajoutez l’éthanol pendant que le tube avec les perles est encore sur l’aimant, en essayant de ne pas déranger les perles, et attendez 30-60 s. Ensuite, retirez le surnageant sans déranger les perles.
  16. Laisser sécher les billes à l’air libre et les remettre en suspension dans 21 μL de tampon TLE par vortex.
    REMARQUE: Un séchage excessif des billes peut réduire le rendement lors de l’élution de l’ADN. Essayez de les remettre en suspension dans un tampon TLE immédiatement après qu’ils ne soient plus « brillants » de l’éthanol.
  17. Incuber l’échantillon pendant 10 min à 37 °C dans un thermobloc pour éluer la bibliothèque des billes. Placez le tube dans un aimant et transférez le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.
  18. Quantifier la taille et la concentration par électrophorèse automatisée (voir le tableau des matériaux). Le matériau Hi-C purifié peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs mois avant de procéder au protocole.

10. Capture de bibliothèque

  1. Travailler avec 500-1 000 ng de la bibliothèque. Concentrez la bibliothèque en séchant l’ADN à l’aide d’un concentrateur sous vide et en remettant le matériau en suspension dans 3,4 μL d’eau sans nucléase.
  2. Ajoutez les bloqueurs suivants du kit d’enrichissement cible (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon : 2,5 μL de bloqueur 1, 2,5 μL de bloqueur 2 et 0,6 μL de bloqueur d’oligo personnalisé pour les adaptateurs.
  3. Bien remettre en suspension, transférer la solution sur une bandelette de PCR de 0,2 mL et incuber dans un thermocycleur pendant 5 min à 95 °C, puis 5 min à 65 °C avec un couvercle chauffant. Laisser le tube en incubation à 65 °C.
  4. Préparer la solution d’hybridation en combinant les réactifs suivants du kit d’enrichissement cible (voir Tableau des matériaux) par échantillon (13 μL). Conserver sur le banc à température ambiante : 6,63 μL de Hyb 1, 0,27 μL de Hyb 2, 2,65 μL de Hyb 3 et 3,45 μL de Hyb 4.
  5. Diluer 0,5 μL de bloc de RNase du kit d’enrichissement cible avec 1,5 μL d’eau exempte de nucléases par échantillon. Décongeler 5 μL de l’ARN biotinylé par échantillon sur glace et y ajouter les 2 μL du bloc RNase dilué. Conserver sur le banc à température ambiante.
  6. Ajouter les 13 μL de la solution d’hybridation aux 7 μL de l’ARN biotinylé avec la RNase et bien mélanger.
  7. Sur le thermocycleur à 65 °C, transférer la solution d’hybridation avec l’ARN biotinylé (20 μL) dans la bibliothèque bloquée. Fermez fermement le couvercle du tube et incuber dans le thermocycleur pendant une nuit à 65 °C.
    REMARQUE: Pour minimiser l’évaporation de l’échantillon (qui peut conduire à une hybridation ARN-ADN sous-optimale) lors de la réalisation de plusieurs échantillons en même temps, utilisez une pipette multicanal pour transférer l’ARN biotinylé à chaque bibliothèque en même temps.

11. Extraction de biotine et amplification PCR

  1. Transférez 50 μL de billes de streptavidine T1 par échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL, placez-les sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2 à 3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur. Retirez le surnageant, en laissant les perles derrière. Lavez les billes trois fois avec 200 μL du tampon de liaison du kit d’enrichissement cible.
  2. Remettez les billes en suspension dans 200 μL de tampon de liaison. Sur le thermocycleur à 65 °C, transférer l’échantillon dans les billes de streptavidine T1 en suspension et incuber pendant 30 minutes, en tournant à température ambiante.
  3. Lavez les billes avec 200 μL de tampon de lavage 1 du kit d’enrichissement cible. Incuber pendant 15 min, en tournant à température ambiante. Laver les billes trois fois avec 200 μL de tampon de lavage 2 du kit d’enrichissement cible chauffé à 65 °C. Incuber pendant 10 min à 65 °C dans un thermobloc, en agitant à 300 tr/min entre les lavages.
  4. Laver les billes avec 200 μL de 1x tampon de restriction 2 et les remettre ensuite en suspension dans 30 μL de 1x tampon de restriction 2.
  5. Mélanger les réactifs suivants pour préparer la réaction de PCR afin d’amplifier la bibliothèque : 30 μL de billes avec la bibliothèque, 150 μL de 2x mélanges maîtres PCR avec enzyme, 7,2 μL d’amorces F + R (25 μM chacune; voir le tableau 2) et 112,8 μL d’eau sans nucléase.
  6. Effectuer la PCR dans les conditions suivantes (diviser le mélange de réactifs PCR en réactions de 50 μL) : 98 °C pendant 40 s, suivi de quatre cycles de 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s, et terminer avec 72 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.
  7. Regroupez toutes les réactions de 50 μL du même échantillon dans un tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL, placez-le sur un tube magnétique de 1,5 mL et attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les billes soient collées au mur.
  8. Transférer le surnageant contenant la bibliothèque (300 μL) dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL. Complétez avec un tampon TLE à 300 μL si une partie du surnageant a été perdue. Les billes de streptavidine T1 ne sont plus nécessaires.
  9. Effectuer une purification de l’ADN à l’aide de billes paramagnétiques (0,9 volume; voir le tableau des matériaux). Ajouter 270 μL de billes de bouillon à l’échantillon et mélanger par vortex.
  10. Incuber pendant 10 min, en tournant à température ambiante.
  11. Placez sur un aimant, attendez 2-3 minutes ou jusqu’à ce que toutes les perles soient collées au mur et retirez le surnageant.
  12. Lavez les billes trois fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %. Pour ce faire, ajoutez l’éthanol pendant que le tube avec les perles est encore sur l’aimant, en essayant de ne pas déranger les perles, et attendez 30-60 s. Ensuite, retirez le surnageant sans déranger les perles.
  13. Laisser sécher les billes à l’air libre et les remettre en suspension dans 21 μL de tampon TLE par vortex.
    REMARQUE: Un séchage excessif des billes peut réduire le rendement lors de l’élution de l’ADN. Essayez de les remettre en suspension dans un tampon TLE immédiatement après qu’ils ne soient plus « brillants » de l’éthanol.
  14. Incuber l’échantillon pendant 10 min à 37 °C dans un thermobloc pour éluer la bibliothèque des billes.
  15. Placez le tube dans un aimant et transférez le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube à faible liaison d’ADN de 1,5 mL.
  16. Quantifier la taille et la concentration par électrophorèse automatisée.

Résultats

liCHi-C offre la possibilité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs de haute qualité et à résolution à l’échelle du génome avec aussi peu que 50 000 cellules53. Ceci est accompli en supprimant les étapes inutiles du protocole d’origine des volumes de réaction et l’utilisation de produits en plastique à faible liaison de l’ADN tout au long du protocole. Il s’agit notamment de la purification du phénol après réticulation, de l’élimination de la biotine,...

Discussion

liCHi-C offre la capacité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs haute résolution en utilisant un cadre expérimental similaire à celui de PCHi-C, mais avec un nombre de cellules considérablement réduit. Ceci est grandement réalisé en éliminant les étapes inutiles, telles que la purification du phénol et l’élimination de la biotine. Dans le protocole57 classique de ligature dans le noyau et sa technique dérivée ultérieure PCHi-C, la biotine est retirée des fra...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les autres membres du laboratoire Javierre pour leurs commentaires sur le manuscrit. Nous remercions le programme CERCA, la Generalitat de Catalunya et la Fondation Josep Carreras pour leur soutien institutionnel. Ce travail a été financé par FEDER/Ministère espagnol de la Science et de l’Innovation (RTI2018-094788-A-I00), l’Association européenne d’hématologie (4823998) et l’Association espagnole contre le cancer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ est financé par le projet Junior Leader de la Caixa Banking Foundation (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR est financé par une bourse AGAUR FI (2019FI-B00017) et LT-D est financé par une bourse FPI (PRE2019-088005). Nous remercions le programme de doctorat en biochimie et biologie moléculaire de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour son soutien. Aucun des bailleurs de fonds n’a été impliqué à aucun moment dans la conception expérimentale ou la rédaction du manuscrit.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TFor ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 units/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesFor automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagentsAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biologyPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

Références

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

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