Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares

Résumé

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Résumé

La transcription des gènes spatio-temporels est étroitement régulée par des éléments régulateurs distaux, tels que les amplificateurs et les silencieux, qui s’appuient sur la proximité physique avec leurs promoteurs de gènes cibles pour contrôler la transcription. Bien que ces éléments régulateurs soient faciles à identifier, leurs gènes cibles sont difficiles à prédire, car la plupart d’entre eux sont spécifiques au type cellulaire et peuvent être séparés par des centaines de kilobases dans la séquence linéaire du génome, ignorant d’autres gènes non cibles. Depuis plusieurs années, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) est l’étalon-or pour l’association d’éléments régulateurs distaux à leurs gènes cibles. Cependant, PCHi-C repose sur la disponibilité de millions de cellules, interdisant l’étude de populations de cellules rares telles que celles couramment obtenues à partir de tissus primaires. Pour surmonter cette limitation, une méthode de capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C), une méthode rentable et personnalisable pour identifier le répertoire d’éléments régulateurs distaux contrôlant chaque gène du génome, a été développée. liCHi-C s’appuie sur un cadre expérimental et informatique similaire à celui de PCHi-C, mais en utilisant des changements de tube minimes, en modifiant la concentration et les volumes de réactifs, et en échangeant ou en éliminant les étapes, il tient compte des pertes de matériaux minimales lors de la construction de la bibliothèque. Collectivement, liCHi-C permet l’étude de la régulation des gènes et de l’organisation spatio-temporelle du génome dans le contexte de la biologie du développement et de la fonction cellulaire.

Introduction

L’expression génique temporelle entraîne la différenciation cellulaire et, en fin de compte, le développement de l’organisme, et son altération est étroitement liée à une large pléthore de maladies 1,2,3,4,5. La transcription des gènes est finement régulée par l’action d’éléments régulateurs, qui peuvent être classés comme proximaux (promoteurs de gènes) et distaux (par exemple, amplificateurs ou silencieux), ces derniers étant fréquemment situés loin de leurs gènes cibles et interagissent physiquement avec....

Protocole

Pour assurer une perte matérielle minimale, (1) travailler avec des tubes et des embouts à faible liaison d’ADN (voir le tableau des matériaux), (2) placer des réactifs sur la paroi du tube au lieu d’introduire l’embout à l’intérieur de l’échantillon et, (3) si possible, mélanger l’échantillon par inversion au lieu de pipeter l’échantillon de haut en bas, et tourner vers le bas par la suite pour récupérer l’échantillon.

1. Fixation cellulaire

1. Cellules se développant en suspension
   1. Récoltez de 50 000 à un million de cellules et placez-les dans un tube de 1,5 ml à faible liaison.
      REMARQUE :....

Discussion

liCHi-C offre la capacité de générer des bibliothèques d’interactomes promoteurs haute résolution en utilisant un cadre expérimental similaire à celui de PCHi-C, mais avec un nombre de cellules considérablement réduit. Ceci est grandement réalisé en éliminant les étapes inutiles, telles que la purification du phénol et l’élimination de la biotine. Dans le protocole⁵⁷ classique de ligature dans le noyau et sa technique dérivée ultérieure PCHi-C, la biotine est retirée des fra.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP	Invitrogen	19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
1 M Tris pH 8.0	Invitrogen	AM9855G
10x NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS	Fisher Scientific	BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer	New England Biolabs	B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free	Thermo Scientific	28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9000S
5 M NaCl	Invitrogen	AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes	Qiuantabio	2302820	For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification	Integrated DNA Technologies	-	Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers	Nunc	179693	Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)	Any brand
CHiCAGO R package	1.14.0
CleanNGS beads	CleanNA	CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Promega	U120A, U121A, U122A, U123A	Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	30108051
DNA LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL	New England Biolabs	M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65002	For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads	Invitrogen	65602	For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2	Invitrogen	12321D	Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute	VWR	20821.321
FBS, qualified	Gibco	10270-106	Or any other brand
Glycine	Fisher BioReagents	BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant	Invitrogen	AM9515	Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP	0.8.2
HindIII, 100 U/µL	New England Biolabs	R0104T
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL	New England Biolabs	M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)	ZeroTip	PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials	Covaris	520045	For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL	New England Biolabs	R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water	Sigma-Aldrich	W4502
PCR primers for quality controls	Integrated DNA Technologies	-
PCR strips and caps	Agilent Technologies	410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA	Sigma-Aldrich	P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531L	For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)	Roche	11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche	3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit	Invitrogen	Q33230	For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes	Invitrogen	Q32856
rCutsmart buffer	New England Biolabs	B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX	Gibco	61870-010	Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology	PanReac AppliChem	A0676
Sodium acetate pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library	Agilent Technologies	5190-4831	Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1	Agilent Technologies	5190-8645	Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter	Agilent Technologies	931107	Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	15224025	For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL	New England Biolabs	M0202T	For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL	New England Biolabs	M0203L
T4 PNK 10000 units/mL	New England Biolabs	M0201L
Tapestation 4200 instrument	Agilent Technologies		For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents	Agilent Technologies	5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,	For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology	PanReac AppliChem	A4975
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML