JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Экспрессия генов регулируется взаимодействием промоторов генов с дистальными регуляторными элементами. Здесь мы рассмотрим, как низкий входной захват Hi-C (liCHi-C) позволяет идентифицировать эти взаимодействия в редких типах клеток, которые ранее не поддавались измерению.

Аннотация

Пространственно-временная транскрипция генов жестко регулируется дистальными регуляторными элементами, такими как энхансеры и глушители, которые полагаются на физическую близость к своим целевым промоторам генов для контроля транскрипции. Хотя эти регуляторные элементы легко идентифицировать, их гены-мишени трудно предсказать, поскольку большинство из них специфичны для клеточного типа и могут быть разделены сотнями килобаз в линейной последовательности генома, пропуская другие нецелевые гены. В течение нескольких лет Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) был золотым стандартом ассоциации дистальных регуляторных элементов с их генами-мишенями. Тем не менее, PCHi-C полагается на наличие миллионов клеток, что запрещает изучение редких клеточных популяций, таких как те, которые обычно получают из первичных тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, был разработан низковходной захват Hi-C (liCHi-C), экономически эффективный и настраиваемый метод идентификации репертуара дистальных регуляторных элементов, контролирующих каждый ген генома. liCHi-C опирается на аналогичную экспериментальную и вычислительную структуру, что и PCHi-C, но, используя минимальные изменения трубок, изменяя концентрацию и объемы реагентов, а также заменяя или устраняя шаги, он учитывает минимальные потери материала при строительстве библиотеки. В совокупности liCHi-C позволяет изучать регуляцию генов и пространственно-временную организацию генома в контексте биологии развития и клеточной функции.

Введение

Временная экспрессия генов стимулирует дифференцировку клеток и, в конечном счете, развитие организма, и ее изменение тесно связано с широким спектром заболеваний 1,2,3,4,5. Транскрипция генов тонко регулируется действием регуляторных элементов, которые можно классифицировать как проксимальные (т.е. промоторы генов) и дистальные (например, энхансеры или глушители), последние из которых часто расположены далеко от своих генов-мишеней и физически взаимодействуют с ними посредством петли хроматина для модуляции экспрессии генов 6,7,8.

Идентификация дистальных регуляторных областей в геноме является широко согласованным вопросом, поскольку эти области содержат специфические модификации гистонов 9,10,11 и содержат специфические мотивы распознавания факторов транскрипции, выступая в качестве рекрутинговых платформ для них12,13,14. Кроме того, в случае энхансеров и суперэнхансеров 15,16 они также имеют низконуклеосомную занятость 17,18 и транскрибируются в некодирующие эРНК 19,20.

Тем не менее, гены-мишени каждого дистального регуляторного элемента труднее предсказать. Чаще всего взаимодействия между дистальными регуляторными элементами и их мишенями являются клеточными и специфическими для стимула 21,22, охватывают сотни килооснований, соединяя другие гены в любом направлении 23,24,25, и даже могут быть расположены внутри интронных областей их гена-мишени или других непромежуточных генов 26,27. Кроме того, дистальные регуляторные элементы также могут контролировать более одного гена одновременно, и наоборот28,29. Эта позиционная сложность препятствует выявлению регуляторных ассоциаций между ними, и, следовательно, большинство мишеней каждого регуляторного элемента в каждом типе клеток остаются неизвестными.

В последние годы наблюдается значительный бум в развитии методов захвата конформации хромосом (3C) для изучения хроматиновых взаимодействий. Наиболее широко используемый из них, Hi-C, позволяет создать карту всех взаимодействий между каждым фрагментом геномаклетки 30. Однако для обнаружения значимых взаимодействий на уровне рестрикционных фрагментов Hi-C полагается на сверхглубокое секвенирование, запрещая его использование для рутинного изучения регуляторного ландшафта отдельных генов. Чтобы преодолеть это экономическое ограничение, появилось несколько методов 3C на основе обогащения, таких как ChIA-PET31, HiChIP32 и его аналог HiCuT33 с низким энергопотреблением. Эти методы зависят от использования антител для обогащения полногеномных взаимодействий, опосредованных специфическим белком. Тем не менее, уникальная особенность этих методов 3C также является проклятием их применения; Пользователи рассчитывают на наличие высококачественных антител к интересующему белку и не могут сравнивать условия, в которых связывание белка является динамическим.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) — это еще один метод 3C на основе обогащения, который обходит эти ограничения34,35. Используя систему обогащения биотинилированного зонда РНК, PCHi-C может генерировать полногеномные библиотеки геномных областей с высоким разрешением, взаимодействующих с 28 650 промоторами генов, аннотированными человеком или 27 595 промоторами генов, также известными как промоторный интерактом. Такой подход позволяет выявлять значимые дальние взаимодействия при разрешении на уровне рестрикционных фрагментов как активных, так и неактивных промоторов, а также надежно сравнивать промоторные интерактомы между любыми условиями независимо от динамики модификаций гистонов или связывания с белками. PCHi-C широко используется в последние годы для идентификации промоторных интерактомных реорганизаций во время дифференцировкиклеток 36,37, идентификации механизма действия транскрипционных факторов38,39 и обнаружения новых потенциальных генов и путей, дерегулированных при заболевании некодирующими вариантами 40,41,42,43,44,45,46,47,48, наряду с мутациями нового драйвера, не кодирующими49,50. Кроме того, просто модифицируя систему захвата, этот метод может быть настроен в соответствии с биологическим вопросом для опроса любого интерактома (например, энхансерного интерактома 51 или интерактома набора некодирующих изменений41,52).

Тем не менее, PCHi-C полагается как минимум на 20 миллионов клеток для выполнения этого метода, что предотвращает изучение дефицитных клеточных популяций, таких как те, которые часто используются в биологии развития и клинических приложениях. По этой причине мы разработали Capture Hi-C с низким входом (liCHi-C), новый экономичный и настраиваемый метод, основанный на экспериментальной структуре PCHi-C для создания промоторных интерактомов высокого разрешения с низким входом клеток. Выполняя эксперимент с минимальными изменениями пробирок, заменяя или исключая этапы из исходного протокола PCHi-C, резко сокращая объемы реакции и изменяя концентрации реагентов, сложность библиотеки максимизируется, и можно создавать высококачественные библиотеки всего с 50 000 ячеек53.

Низковходной захват Hi-C (liCHi-C) был протестирован с PCHi-C и использовался для выяснения перенастройки промоторного интерактома во время дифференцировки гемопоэтических клеток человека, обнаружения потенциальных новых генов и путей, связанных с заболеванием, дерегулированных некодирующими изменениями, и выявления хромосомных аномалий53. Пошаговый протокол и различные элементы контроля качества с помощью этой техники подробно описаны здесь до окончательного создания библиотек и их вычислительного анализа.

протокол

Чтобы обеспечить минимальные потери материала, (1) работайте с пробирками и наконечниками с низким связыванием ДНК (см. Таблицу материалов), (2) поместите реагенты на стенку пробирки вместо того, чтобы вводить наконечник внутрь образца и, (3) если возможно, смешайте образец путем инверсии вместо пипетирования образца вверх и вниз, а затем вращайте вниз, чтобы восстановить образец.

1. Фиксация клеток

  1. Клетки, растущие в суспензии
    1. Соберите от 50 000 до одного миллиона клеток и поместите их в пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типы клеток, используемые для настоящего исследования, подробно описаны в разделе репрезентативных результатов.
    2. Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 600 x g (при 4 °C) с помощью центрифуги с фиксированным ротором и удаляют надосадочную жидкость пипеткой.
    3. Ресуспендируют клетки в 1 мл RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при комнатной температуре.
    4. Добавьте 143 мкл 16% формальдегида, не содержащего метанола, чтобы достичь концентрации 2%, и перемешайте.
    5. Инкубируйте клетки в течение 10 минут, вращая при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь быть как можно более точными при 10-минутной инкубации. Чрезмерная или недостаточная фиксация ячеек может привести к снижению качества библиотеки.
    6. Погасите реакцию, добавив 164 мкл ледяного 1 М глицина, и перемешайте. Инкубируют ячейки в течение 5 мин, вращая при комнатной температуре.
    7. Далее инкубируют клетки в течение 15 мин на льду, перемешивая инверсией каждые ~5 мин.
    8. Центрифугируют клетки в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) с помощью центрифуги с фиксированным ротором и удаляют надосадочную жидкость.
    9. Промойте клетки, ресуспендировав гранулу в 1 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
    10. Центрифугируют клетки в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) и удаляют надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулированные ячейки могут быть заморожены в жидком азоте или сухом льду и храниться при -80 °C.
  2. Адгезивные клетки
    1. Вымойте клетки в чашке для культивирования с помощью 1x PBS.
    2. Приготовьте достаточное количество RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 2% формальдегида без метанола при комнатной температуре, чтобы покрыть чашку с культурой.
    3. Добавьте добавленную среду в культуральную чашку с клетками и выдерживайте в течение 10 минут, покачивая при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь быть как можно более точными при 10-минутной инкубации. Чрезмерная или недостаточная фиксация ячеек может привести к снижению качества библиотеки.
    4. Погасите реакцию, добавив 1 М глицина до 0,125 М, и перемешайте, покачивая.
    5. Инкубируют ячейки в течение 5 мин, покачивая при комнатной температуре.
    6. Далее инкубируют клетки в течение 15 мин при 4 °С, перемешивая качанием каждые 3-4 мин.
    7. Извлеките носитель и промойте ячейки холодным 1x PBS.
    8. Соскребите клетки и перенесите их в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл. Протрите культуральную чашку 0,5-1 мл холодного 1x PBS.
    9. Центрифугируют клетки в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) с помощью центрифуги с фиксированным ротором и удаляют надосадочную жидкость. Гранулированные ячейки могут быть заморожены в жидком азоте или сухом льду и храниться при температуре -80 °C.

2. Лизис и пищеварение

  1. Ресуспендируют клетки в 1 мл буфера холодного лизиса (таблица 1), чтобы разрушить клеточную мембрану. Одного добавления буфера должно быть достаточно для ресуспендирования клеток, но при необходимости они могут быть дополнительно ресуспендированы с помощью легкого вихря.
  2. Инкубировать на льду в течение 30 мин, перемешивая инверсией каждые ~5 мин. Центрифугируют ядра в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендируют ядра 500 мкл холодного 1,25-кратного ограничительного буфера 2 (см. Таблицу материалов).
  3. Центрифугируют ядра в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендировать ядра в 179 мкл 1,25-кратного рестрикционного буфера 2.
  4. Добавьте 5,5 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS; см. Таблицу материалов) и перемешайте. Клетки могут образовывать сгустки; Это нормально и должно быть максимально дезагрегировано путем вихря. Инкубировать образец в течение 1 ч при 37 °C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин.
  5. Погасите SDS, добавив 37,5 мкл 10% Triton X-100 и перемешайте. Инкубировать образец в течение 1 ч при 37 °C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин.
  6. Расщепите хроматин, добавив 7,5 мкл HindIII (100 ЕД / мкл; см. Таблицу материалов) и перемешайте. Инкубируйте образец в течение ночи при температуре 37 °C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин.
  7. На следующее утро добавьте дополнительные 2,5 мкл HindIII (100 ЕД/мкл) и далее инкубируйте образец в течение 1 часа при 37 ° C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин, чтобы обеспечить правильное переваривание хроматина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В рамках контроля эффективности сбраживания (см. этап 5.1) перенесите эквивалент от 20 000 до 40 000 ядер в другую пробирку, чтобы представить непереваренный контроль. После переваривания снова перенесите то же количество клеток в другую трубку, чтобы представить переваренный контроль. Рекомендуется проверить эффективность сбраживания в качестве отдельного эксперимента, если доступность исходного материала недостаточна.

3. Лигирование и декросслинкинг

  1. Охладите образец на льду. Приготовьте мастермикс и добавьте следующие реагенты для заполнения и биотинилирования выступов рестрикционного фрагмента: 3 мкл 10-кратного рестрикционного буфера 2, 1 мкл безнуклеазной воды, 0,75 мкл 10 мМ дХТФ, 0,75 мкл 10 мМ дТТП, 0,75 мкл 10 мМ дГТФ, 18,75 мкл 0,4 мМ биотин-14-дАТФ и 5 мкл 5 ЕД/мкл Кленоу (см. Таблицу материалов). Инкубируют образец в течение 75 мин при 37 °C, перемешивая инверсией каждые ~15 мин.
  2. Охладите образец на льду. Приготовьте мастермикс и добавьте следующие реагенты для перевязки заполненных концов ДНК: 50 мкл 10-кратного лигирующего буфера, 2,5 мкл 20 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 12,5 мкл 1 ЕД/мкл ДНК-лигазы T4 и 173 мкл безнуклеазной воды (см. Таблицу материалов).
  3. Инкубируют образец в течение 4-6 ч при 16 °C, перемешивая инверсией каждые ~1 ч. Далее инкубируют образец в течение 30 мин при комнатной температуре. Декросслинкуйте хроматин, добавив 30 мкл протеиназы К 10 мг/мл и перемешайте. Инкубируйте образец в течение ночи при температуре 65 °C.
  4. На следующее утро добавьте дополнительные 15 мкл 10 мг/мл протеиназы К и продолжайте инкубацию образца в течение 2 ч при 65 ° C, чтобы обеспечить надлежащую деслинковку хроматина.

4. Очистка ДНК

  1. Охладите образец до комнатной температуры и перенесите его в подходящую пробирку для очистки фенол-хлороформом.
  2. Добавьте 1 объем (545 мкл) фенола:хлороформ:изоамилового спирта (25:24:1) для очистки ДНК и перемешайте, энергично встряхивая.
  3. Центрифугируют образец в течение 5 мин при 12 000 x g при комнатной температуре и переносят верхнюю водную фазу (545 мкл) в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 2 мл.
  4. Добавьте следующие реагенты для осаждения ДНК: 1 362,5 мкл 100% этанола, охлажденного до -20 ° C, 54,5 мкл 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и 2 мкл 15 мг / мл гликогена в качестве соосаждителя.
  5. Инкубировать в течение 1 ч при -80 °C или в течение ночи при -20 °C.
  6. Центрифугируют образец в течение 30 мин при 16 000-21 000 x g при 4 ° C и удаляют надосадочную жидкость. Гранула ДНК должна быть видна.
  7. Вымойте гранулы, добавив 1 мл 70% этанола, встряхните и центрифугируйте в течение 10 минут при 16 000-21 000 x g при комнатной температуре.
  8. Удалите надосадочную жидкость и дайте грануле высохнуть на воздухе. Ресуспендировать гранулу ДНК в 130 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
  9. Оцените концентрацию с помощью флуорометрического количественного определения (см. Таблицу материалов). Храните очищенный материал 3C при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев, прежде чем приступить к протоколу.

5. Дополнительный контроль качества

  1. Оцените эффективность пищеварения. Выполните декросслинкинг и очистку фенол:хлороформ ДНК, как описано ранее, до непереваренного и переваренного контроля, полученного на шаге 2.13. Ресуспендировать гранулу ДНК в 10 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Количественно определите концентрацию и при необходимости разбавьте полученную ДНК до 4 нг/мкл.
  2. Проведите количественную ПЦР с 4 нг ДНК как непереваренной, так и переваренной контрольной группы, с праймерами, охватывающими открытый локус хроматина с мишенью HindIII и без нее (см. Таблицу 2 для дизайна праймера). Рассчитайте эффективность пищеварения в соответствии с ранее опубликованным отчетом35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность лигирования рассчитывается в процентах по формуле: переваривание (%) = 100 -100/(2^[(Ct переваренный с HindIII - Ct переваренный без HindIII) - (Ct непереваренный с HindIII - Ct непереваренный без HindIII)]) (см. Таблицу 3), которая учитывает дифференциал различных Cts, полученных для каждой пары праймеров в непереваренном и переваренном контроле.
  3. Оцените чувствительность обнаружения взаимодействия, выполнив обычную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (0,2 мМ dNTP, 0,4 мкм оба праймера F + R, 0,1 и U/мкл полимеразы горячего старта), при этом праймеры охватывают как дальние, так и ближние клеточно-инвариантные взаимодействия (см. Таблицу 2 для дизайна праймера). Используйте 50-100 нг материала 3C (для ближних и дальних взаимодействий соответственно) и усиливайте с использованием следующих условий: 98 ° C в течение 15 мин, затем 37 циклов 98 ° C в течение 30 с, 60 ° C в течение 1 мин, 72 ° C в течение 1 мин и заканчивайте 72 ° C в течение 10 мин. Хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если полученное количество ДНК составляет менее 2 мкг, проверяйте только дальнее и ближнее взаимодействие, а не всю панель взаимодействия.
  4. Запустите продукт на 1x трис-борат-ЭДТА (TBE) с использованием 1,6% агарозного геля и найдите наличие соответствующего ампликонаПЦР 54.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за непредсказуемого «вырезания и вставки» генома могут появиться неспецифические полосы. До тех пор, пока соблюдается правильный размер полосы, он считается правильным.
  5. Оцените эффективность заполнения и лигирования биотина путем дифференциального переваривания продукта ПЦР ближнего действия с HindIII, NheI (см. Таблицу материалов), обоими ферментами или без них (вода) и запуска продукта на 1x 1,6% агарозном геле TBE. Правильное заполнение и лигирование устраняют предыдущую мишень HindIII и создают новую мишень NheI, поэтому ампликон следует разрезать только в присутствии NheI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму потери материала, извлеките 2,5 мкл продукта ПЦР ближнего действия из средств контроля взаимодействия и повторно амплифицируйте его пять раз для выполнения контроля заполнения и лигирования.

6. Обработка ультразвуком

  1. Перенесите 130 мкл образца (долейте воду без нуклеазы, если некоторые из них использовались для контроля) в кювету, подходящую для обработки ультразвуком.
  2. Настройте ультразвуковой аппарат на водяной бане и ультразвук с использованием следующих параметров (оптимизированных для модели и кювет, описанных в Таблице материалов): Коэффициент заполнения: 20%; Мощность пикового падения: 50; циклов на серию: 200; время: 65 с; и диапазон температур: 6-10 °C (оптимально 8 °C).
  3. Перенесите образец в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.

7. Конечный ремонт

  1. Подготовьте мастер-микс и добавьте следующие реагенты для восстановления неровных концов фрагментов ДНК, созданных во время обработки ультразвуком: 18 мкл 10-кратного лигирующего буфера, 18 мкл смеси 2,5 мМ dNTP каждый, 6,5 мкл 3 ЕД / мкл ДНК-полимеразы T4, 6,5 мкл 10 ЕД / мкл T4 PNK и 1,3 мкл 5 ЕД / мкл Кленова (см. Таблицу материалов).
  2. Инкубируйте образец в течение 30 минут при 20 ° C и долейте буфер с низким содержанием ЭДТА (TLE) (см. Таблицу 1) до 300 мкл.

8. Вытягивание биотина

  1. Перенесите 150 мкл шариков стрептавидина C1 (см. Таблицу материалов) на образец в пробирку объемом 1,5 мл, поместите их на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене. Удалите надосадочную жидкость, оставив бусины.
  2. Промойте шарики 400 мкл 1x буфера для анимации (TB; см. Таблицу 1). Чтобы промыть бусины, добавьте буфер и ресуспендируйте их мягким вихрением. Поместите трубку обратно в магнит и подождите 2-3 минуты или пока все бусины не прилипнут к стене. Удалите надосадочную жидкость, оставив бусины.
  3. Промойте шарики 300 мкл 1x без буфера анимации (NTB; см. Таблицу 1). Ресуспендировать шарики в 300 мкл 2x NTB (см. Таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики могут образовывать пыльный слой вокруг стенки трубки при стирке буферами без моющего средства. Это нормально и не влияет на результат протокола.
  4. Объедините эти 300 мкл шариков в 2x NTB с 300 мкл образца. Инкубировать в течение 15 минут, вращая при комнатной температуре, чтобы вытащить информативные фрагменты ДНК с биотином. Библиотека теперь привязана к бусинам стрептавидина C1.
  5. Вымойте шарики 400 мкл 1x NTB. Промойте шарики 100 мкл буфера TLE, а затем ресуспендируйте их в 35,7 мкл буфера TLE.

9. дАТФ-хвост, лигирование адаптера и амплификация ПЦР

  1. Приготовьте мастермикс и добавьте в образец следующие реагенты для dATP-хвоста концов восстановленных фрагментов ДНК: 5 мкл 10-кратного рестрикционного буфера 2, 2,3 мкл 10 мМ дАТФ и 7 мкл 5 ЕД/мкл экзо-экзо-белка Кленова. Инкубировать образец в течение 30 мин при 37 °C.
  2. Инактивируйте экзо- Klenow путем дальнейшей инкубации образца в течение 10 минут при 65 °C. Охладите пробу на льду. Вымойте шарики 300 мкл 1x TB. Вымойте шарики 300 мкл 1x NTB.
  3. Промойте шарики 100 мкл 1x лигирующего буфера, а затем ресуспендируйте их в 50 мкл 1x лигирующего буфера. Добавьте в образец 4 мкл предварительно отожженной переходной смеси 15 мкМ (см. Таблицу 2) и 1 мкл 2,000 ЕД/мкл ДНК-лигазы T4 (см. Таблицу материалов).
  4. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Вымойте шарики 400 мкл 1x TB. Вымойте шарики 200 мкл 1x NTB. Промойте шарики 100 мкл 1x ограничительного буфера 2.
  5. Промойте шарики 50 мкл 1x ограничительного буфера 2, а затем ресуспендируйте их в 50 мкл 1x ограничительного буфера 2.
  6. Смешайте следующие реагенты для приготовления реакции ПЦР для амплификации библиотеки: 50 мкл шариков с библиотекой, 250 мкл 2x мастер-микса для ПЦР с ферментом, 12 мкл праймеров F + R (по 25 мкМ каждый; см. Таблицу 2) и 188 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
  7. Выполняйте ПЦР при следующих условиях (разделите смесь реагентов ПЦР на реакции по 50 мкл): 98 °C в течение 40 с, затем X циклы 98 °C в течение 10 с, 65 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с и закончите 72 °C в течение 10 мин. Хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующее количество циклов в качестве отправной точки для оптимизации протокола в диплоидных клетках, стремясь к выходу 500-1,000 нг до захвата библиотеки: один миллион клеток в течение восьми циклов; 250 000 ячеек за 10 циклов; 50 000 ячеек за 12 циклов.
  8. Объедините все реакции 50 мкл из одного и того же образца в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл, поместите ее на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стенке.
  9. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку (500 мкл), в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл. Долейте буфер TLE до 500 мкл, если часть надосадочной жидкости была потеряна. Шарики стрептавидина C1 больше не нужны.
  10. Выполняют двусторонний отбор55 с помощью парамагнитной очистки шариков (0,4-1 объем). Это позволяет селективно устранять слишком большие (>1000.н.) и слишком маленькие фрагменты или праймеры ПЦР (<200.н.), в зависимости от концентрации полиэтиленгликоля и соли добавленных парамагнитных шариков.
  11. Добавьте 200 мкл (0,4 объема) бусин в библиотеку и перемешайте вихревым способом. Инкубировать 10 мин, вращая при комнатной температуре.
  12. Поместите на магнит, подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене, и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку (без более крупных фрагментов), в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
  13. Сконцентрируйте шарики, взяв 750 мкл бусин, поместите их в пробирку объемом 1,5 мл на магните, подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене, удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте бусины, встряхнув 300 мкл новых бусин.
  14. Добавьте эти 300 мкл концентрированных шариков в образец (1 объем) и перемешайте вихревым способом. Инкубировать 10 мин, вращая при комнатной температуре. Поместите на магнит, подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене, и удалите надосадочную жидкость (содержащую более мелкие фрагменты и праймеры для ПЦР).
  15. Промойте шарики три раза 1 мл 70% этанола. Для этого добавьте этанол, пока трубка с шариками еще находится на магните, стараясь не потревожить шарики, и подождите 30-60 с. После этого удалите надосадочную жидкость, не нарушая бусины.
  16. Дайте шарикам высохнуть на воздухе и ресуспендируйте их в 21 мкл буфера TLE путем вихреобразования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная сушка шариков может снизить выход при элюировании ДНК. Стремитесь ресуспендировать их в буфере TLE сразу после того, как они перестанут быть «блестящими» от этанола.
  17. Инкубируйте образец в течение 10 мин при 37 °C в термоблоке, чтобы разбавить библиотеку от шариков. Поместите пробирку в магнит и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
  18. Количественно определите размер и концентрацию с помощью автоматизированного электрофореза (см. Таблицу материалов). Очищенный материал Hi-C можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев, прежде чем приступить к протоколу.

10. Захват библиотеки

  1. Работа с 500-1,000 нг библиотеки. Сконцентрируйте библиотеку, высушив ДНК с помощью вакуумного концентратора и ресуспендировав материал в 3,4 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
  2. Добавьте в образец следующие блокираторы из целевого набора для обогащения (см. Таблицу материалов): 2,5 мкл блокиратора 1, 2,5 мкл блокиратора 2 и 0,6 мкл специального олигоблокатора для адаптеров.
  3. Тщательно ресуспендировать, перенести раствор в полоску для ПЦР объемом 0,2 мл и инкубировать в термоциклере в течение 5 мин при 95 °C, а затем 5 мин при 65 °C с нагретой крышкой. Оставьте пробирку инкубироваться при температуре 65 °C.
  4. Приготовьте раствор для гибридизации, комбинируя следующие реагенты из набора для целевого обогащения (см. Таблицу материалов) на образец (13 мкл). Хранить на столе при комнатной температуре: 6,63 мкл Hyb 1, 0,27 мкл Hyb 2, 2,65 мкл Hyb 3 и 3,45 мкл Hyb 4.
  5. Разбавьте 0,5 мкл блока РНКазы из набора для обогащения мишени 1,5 мкл воды, не содержащей нуклеаз, на образец. Разморозьте 5 мкл биотинилированной РНК на образец на льду и добавьте к нему 2 мкл разбавленного блока РНКазы. Держать на скамейке при комнатной температуре.
  6. Добавьте 13 мкл гибридизационного раствора к 7 мкл биотинилированной РНК с РНКазой и хорошо перемешайте.
  7. Находясь на термоциклере при 65 °C, перенесите гибридизационный раствор с биотинилированной РНК (20 мкл) в заблокированную библиотеку. Плотно закройте крышку тюбика и выдержите в термоциклере в течение ночи при температуре 65 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму испарение образца (которое может привести к субоптимальной гибридизации РНК-ДНК) при одновременном проведении нескольких образцов, используйте многоканальную пипетку для одновременного переноса биотинилированной РНК в каждую библиотеку.

11. Вытягивание биотина и ПЦР-амплификация

  1. Перенесите 50 мкл шариков стрептавидина Т1 на образец в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл, поместите их на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене. Удалите надосадочную жидкость, оставив бусины. Трижды промойте шарики 200 мкл связующего буфера из набора для обогащения мишени.
  2. Ресуспендируют шарики в 200 мкл связывающего буфера. Находясь на термоциклере при 65 °C, перенесите образец в ресуспендированные гранулы стрептавидина T1 и инкубируйте в течение 30 мин, вращая при комнатной температуре.
  3. Вымойте шарики 200 мкл буфера для стирки 1 из целевого набора для обогащения. Инкубировать 15 мин, вращая при комнатной температуре. Трижды промойте шарики 200 мкл буфера для стирки 2 из набора для целевого обогащения, нагретого до 65 °C. Инкубировать в течение 10 мин при 65 °C в термоблоке, встряхивая при 300 об/мин между стирками.
  4. Промойте шарики 200 мкл 1x ограничительного буфера 2, а затем ресуспендируйте их в 30 мкл 1x ограничительного буфера 2.
  5. Смешайте следующие реагенты, чтобы приготовить реакцию ПЦР для амплификации библиотеки: 30 мкл шариков с библиотекой, 150 мкл 2x мастер-микса для ПЦР с ферментом, 7,2 мкл праймеров F + R (по 25 мкМ каждый; см. Таблицу 2) и 112,8 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
  6. Проведите ПЦР при следующих условиях (разделите смесь реагентов ПЦР на реакции по 50 мкл): 98 °C в течение 40 с, затем четыре цикла 98 °C в течение 10 с, 65 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с и закончите 72 °C в течение 10 мин. Хранить при температуре 4 °C.
  7. Объедините все реакции 50 мкл из одного и того же образца в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл, поместите ее на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стенке.
  8. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку (300 мкл), в новую низкосвязывающую пробирку ДНК объемом 1,5 мл. Долейте буфер TLE до 300 мкл, если часть надосадочной жидкости была потеряна. Шарики стрептавидина Т1 больше не нужны.
  9. Проведите очистку ДНК с помощью парамагнитных шариков (0,9 объема; см. Таблицу материалов). Добавьте в образец 270 мкл бусин и перемешайте вихревым способом.
  10. Инкубировать 10 мин, вращая при комнатной температуре.
  11. Поместите на магнит, подождите 2-3 минуты или пока все бусины не прилипнут к стене, и удалите надосадочную жидкость.
  12. Промойте шарики три раза 1 мл 70% этанола. Для этого добавьте этанол, пока трубка с шариками еще находится на магните, стараясь не потревожить шарики, и подождите 30-60 с. После этого удалите надосадочную жидкость, не нарушая бусины.
  13. Дайте шарикам высохнуть на воздухе и ресуспендируйте их в 21 мкл буфера TLE путем вихреобразования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная сушка шариков может снизить выход при элюировании ДНК. Стремитесь ресуспендировать их в буфере TLE сразу после того, как они перестанут быть «блестящими» от этанола.
  14. Инкубируйте образец в течение 10 мин при 37 °C в термоблоке, чтобы разбавить библиотеку от шариков.
  15. Поместите пробирку в магнит и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
  16. Количественно определите размер и концентрацию с помощью автоматизированного электрофореза.

Результаты

liCHi-C предлагает возможность создания высококачественных библиотек промоторных интерактомов с разрешением всего лишь 50 000клеток53. Это достигается за счет - помимо резкого сокращения объемов реакции и использования пластиковой посуды с низким связыванием ДНК во всем прото...

Обсуждение

liCHi-C предлагает возможность создания библиотек промоторных интерактомов с высоким разрешением, используя аналогичную экспериментальную структуру PCHi-C, но со значительно уменьшенным числом клеток. Это в значительной степени достигается за счет устранения ненужных этапов, таких как оч...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Мы благодарим остальных сотрудников лаборатории Хавьера за отзыв о рукописи. Мы благодарим Программу CERCA, Женералитат Каталонии и Фонд Хосепа Каррераса за институциональную поддержку. Эта работа финансировалась FEDER/Министерством науки и инноваций Испании (RTI2018-094788-A-I00), Европейской гематологической ассоциацией (4823998) и Испанской ассоциацией по борьбе с раком (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ финансируется проектом «Младший лидер» La Caixa Banking Foundation (LCF/BQ/PI19/11690001), LR финансируется стипендией AGAUR FI (2019FI-B00017), а LT-D финансируется стипендией FPI (PRE2019-088005). Мы благодарим докторскую программу по биохимии и молекулярной биологии из Автономного университета Барселоны за поддержку. Ни один из спонсоров не участвовал ни в одном из этапов разработки эксперимента или написания рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202TFor ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 units/mLNew England BiolabsM0201L
Tapestation 4200 instrumentAgilent TechnologiesFor automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagentsAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biologyPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML

Ссылки

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены