虚血および蘇生中の脳イメージングおよび脳生理学的モニタリングのためのマウス心停止モデル

要約

このプロトコルは蘇生のための胸の圧迫を要求しない窒息の心停止の独特なマウス モデルを示す。このモデルは、心停止および蘇生中の脳生理学のダイナミクスをモニタリングおよびイメージングするのに役立ちます。

要約

ほとんどの心停止(CA)生存者は、さまざまな程度の神経学的欠損を経験します。CA誘発性脳損傷のメカニズムを理解し、効果的な治療法を開発するためには、実験的なCA研究が不可欠です。この目的のために、いくつかのマウスCAモデルが確立されています。これらのモデルのほとんどは、心肺蘇生法(CPR)のための胸骨圧迫を行うために、マウスを仰臥位に置きます。しかし、この蘇生手順では、CAおよび蘇生中の脳生理学のリアルタイムイメージング/モニタリングが困難になります。そのような重要な知識を得るために、本プロトコルは、胸骨圧迫CPRステップを必要としないマウス仮死CAモデルを提示する。このモデルにより、CA前のベースラインからCA後の早期再灌流までの血流、血管構造、電位、および脳組織酸素の動的変化を研究できます。重要なのは、このモデルが老齢マウスに適用されることです。したがって、このマウスCAモデルは、CAが脳生理に及ぼす影響を読み解くための重要なツールとなることが期待されます。

概要

心停止(CA)は依然として世界的な公衆衛生上の危機です¹。米国だけでも、年間356,000件以上の院外および290,000件の院内CA症例が報告されており、CAの被害者のほとんどは60歳以上です。特に、CA後の神経学的障害は生存者によく見られ、これらはCA管理にとって大きな課題となっている^2,3,4,5。CA後の脳病理学的変化と神経学的転帰への影響を理解するために、さまざまな神経生理学的モニタリングおよび脳組織モニタリング技術^が患者に適用されています6、^7、8、⁹、^10、11、12。近赤外分光法を用いて、CAラットのリアルタイム脳モニタリングも行われ、神経学的転帰を予測しています¹³。

しかし、マウスCAモデルでは、このようなイメージングアプローチは、自発循環を回復するために胸骨圧迫が必要であり、常にかなりの身体運動を伴い、したがって繊細なイメージング手順を妨げるため、複雑になっています。さらに、CAモデルは通常、マウスを仰臥位にして実施されますが、多くの脳イメージングモダリティではマウスを腹臥位にする必要があります。したがって、多くの場合、手術前の体の動きを最小限に抑えたマウスモデルが、CA手術前から蘇生後までのCA手術全体を通して脳のリアルタイムイメージング/モニタリングを行うために必要です。

以前、Zhangらは、脳イメージングに有用である可能性のあるマウスCAモデルを報告した¹⁴。彼らのモデルでは、CAはベクロニウムとエスモロールのボーラス注射とそれに続く人工呼吸器の停止によって誘発されました。彼らは、CAの5分後、蘇生混合物を注入することによって蘇生が達成できることを示しました。しかし、注目すべきことに、彼らのモデルでは、エスモロール注射の約10秒後にのみ循環停止が起こりました。.したがって、このモデルは、逮捕前の期間中の高炭酸ガス血症や組織低酸素症など、患者の窒息誘発性CAの進行を再現していません。

現在の外科的処置の全体的な目標は、マウスの臨床的窒息CAをモデル化し、その後、胸骨圧迫を伴わない蘇生を行うことです。したがって、このCAモデルは、マウスの脳生理学を研究するための複雑なイメージング技術の使用を可能にする¹⁵。

プロトコル

ここで説明するすべての手順は、研究における動物のケアと使用に関する国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って実施され、プロトコルはデューク動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、8〜10週齢のC57BL/6雄および雌マウスを使用しました。

1.手術の準備

1. デジタルスケールでマウスの重量を量り、4インチ x 4インチ x 7インチのプレキシガラス麻酔導入ボックスに入れます。
2. 麻酔気化器を5%イソフルランに、酸素流量計を30に、窒素流量計を70に調整します( 材料表を参照)。
3. 動物を誘導ボックスから取り出し、呼吸数が毎分30〜40呼吸に減少したら、手術台に仰臥位で横たえます。.
4. 鈍い鉗子で舌を引き出し、利き手ではない方の手で持ちます。利き手を使って喉頭鏡( 資料表参照)をマウスの口に挿入し、声帯を視覚化します。
5. 利き手でない方の手を使用して、ガイドワイヤーと20Gの静脈内カテーテルを口に挿入します。ガイドワイヤーを気管にそっと挿入します。
6. カテーテルの翼部分が鼻先と平らになるまで、カテーテルを気管に押し込みます。
   注:完全に麻酔されていないマウスは、気管を傷つけて気道出血を引き起こす可能性があるため、挿管しないでください。
7. 挿管したマウスを小動物用人工呼吸器( 材料表を参照)に接続し、イソフルランを1.5%に減らします。
8. マウスの体重を人工呼吸器のコントロールパネルに入力して、一回換気量と呼吸数を決定します。
9. ヒートランプの下でマウスを仰臥位に保ち、温度コントローラーで直腸温度を37°Cに保ちます。
10. 鼠径部を剃り、手術部位をヨウ素とアルコールで少なくとも3回消毒し( 材料表を参照)、無菌の外科用ドレープで患部を覆います。
11. 両眼に眼軟膏を塗布し、手術前に5 mg/kgのカルプロフェンを皮下投与する。
12. 手術用の滅菌器具パッケージを開封します。外科用ハサミで1cmの皮膚切開を行い、両側の大腿動脈にアクセスします。大腿遠位動脈を4-0の絹糸の1本鎖で解剖して結紮し(資料表を参照)、リドカインを1滴塗布します。
13. 大腿動脈近位部に動脈瘤クリップを装着し、クリップの遠位動脈に小さな切り込みを入れます。ポリエチレン10(PE-10、 資料表参照)カテーテルを左右の大腿動脈に挿入します。
    注:左の動脈ラインは血圧のモニタリングに使用され、右の動脈ラインは採血と蘇生混合物の注入に使用されます。
14. 50 μL の 1:10 ヘパリン化生理食塩水を各動脈ラインに注入して、ライン内の凝固を防ぎます。
15. マウスを腹臥位に回し、脳定位固定装置ヘッドフレームに取り付けます。
16. 3本の針電極(赤、緑、黒)を左腕、左脚、右腕に接続して、心電図(ECG、 材料表を参照)モニタリングを行います。
17. 脳血流モニタリングのために、0.5cmの皮膚切開部を通して、無傷の側頭蓋骨に柔軟なプラスチック繊維プローブを接着します。この手順は省略可能です。
18. 頭のてっぺんを剃り、手術部位をヨウ素とアルコールで少なくとも3回消毒し、滅菌手術用ドレーペルで患部を覆います。
19. 2.5cmの正中線皮膚切開部を切開し、4つの小さなリトラクターを使用して頭蓋骨表面全体を露出させ、脳イメージングを行います。
20. モニタリングイメージャー(レーザースペックルコントラストイメージャーなど、 材料表を参照)を頭の上に置きます。
    注:頭蓋骨の表面に数滴の生理食塩水を追加して、レーザースペックルコントラストイメージングを容易にすることができます。

2.心停止の誘発

1. 1 mLのプラスチックシリンジに26 μLの蘇生カクテルストック溶液を充填します。
   注:この溶液の各ミリリットルには、400 μLの1 mg / mLエピネフリン、500 μLの8.4%重炭酸ナトリウム、50 μLの1,000 U / mLヘパリン、および50 μLの0.9%塩化ナトリウムが含まれています( 材料表を参照)。
2. 体温が37°Cに達するまで待ちます。 酸素計を100%に調整して、血液を2分間酸素化します。
3. 酸素化された動脈血を右大腿動脈 から 最大200μLの吸血し、26μLの蘇生カクテルストック溶液を含む準備したプラスチックシリンジに入れます。
4. 酸素のスイッチを切り、窒素を100%に増やして酸素欠乏を誘発します。
   注意: 約45秒後、心臓は機能しなくなり、心拍数が急速に低下し、CAの発症を示します。約2分間の酸素欠乏の後、ECGモニタリングは収縮を示し、測定可能な全身血圧はなく、脳血流はごくわずかです。
5. 換気装置、イソフルラン気化器、温度コントローラー、窒素流量計の電源を切ります。蘇生に備えて酸素を100%に調整します。

3.蘇生手順

1. CA発症後8分で人工呼吸器をオンにします。
2. 蘇生カクテルと混合した酸素化された血液を、1分で右大腿動脈 を介して 血液循環に注入し始めます。
   注:注入は心拍数の漸進的な増加と血液灌流の回復につながります。やがて、自発循環(ROSC)の復活が達成される。

4. CA 後の回復

1. マウスを脳定位固定装置から取り外した後、マウスを仰臥位にし、PE-10カテーテルを大腿動脈から取り外します。
2. 0.25%ブピバカインを皮膚切開部に塗布し、6-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚切開部を縫合します( 材料表を参照)。皮膚切開部の表面に抗生物質軟膏を塗ります。
3. 自発呼吸が回復したら、マウスの人工呼吸器を外します。.
4. マウスを32°Cに制御された温度の回復チャンバーに移します。
5. 回復から2時間後、マウスを抜管し、ホームケージに戻します。脱水症状を防ぐために、0.5mLの生理食塩水を皮下に注入します。

結果

CAを誘導するために、マウスに1.5%イソフルランで麻酔をかけ、100%窒素で換気した。この状態は、45秒で重度の徐脈を引き起こしました(図1)。2分間の酸素欠乏後、心拍数は劇的に低下し(図2)、血圧は20mmHgを下回り、脳血流は完全に停止しました(図1)。イソフルランをオフにすると、体温は管理されなくなり、CA終了時には約32°...

ディスカッション

実験的CA研究では、窒息、塩化カリウム注射、または電流由来の心室細動がCA^16、17、¹⁸、¹⁹、^20、21、^22、23を誘発するために使用されています。通常、これらのCAモデル、特にマウスでは蘇生にC...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adrenalin	Par Pharmaceutical	NDC 42023-159-01
Alcohol swabs	BD	326895
Animal Bio Amp	ADInstruments	FE232
BP transducer	ADInstruments	MLT0699
Bridge Amp	ADInstruments	FE117
Heparin sodium injection, USP	Fresenius Kabi	NDC 63323-540-05
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser Doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Laser speckle imaging system	RWD	RFLSI III
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Micro clip	Roboz	RS-5431
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Needle electrode	ADInstruments	MLA1213	29 Ga, 1.5 mm socket
Nitrogen	Airgas	UN1066
Optic plastic fibre	Moor Instruments	POF500
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
PE-10 tubing	BD	427401	Polyethylene tubing
Povidone-iodine	CVS	955338
PowerLab 8/35	ADInstruments
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/ml
Small animal ventilator	Kent Scientific	RoVent Jr.
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chroride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
1 mL plastic syringe	BD	309659
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
6-0 nylon suture	Ethilon	1698G
8.4% sodium bicarbonate Inj., USP	Hospira	NDC 0409-6625-02
20 G IV catheter	BD	381534	20GA 1.6 IN
30 G PrecisionGlide needle	BD	305106	30 G X 1/2