Modello murino di arresto cardiaco per l'imaging cerebrale e il monitoraggio della fisiologia cerebrale durante l'ischemia e la rianimazione

Riepilogo

Questo protocollo dimostra un modello murino unico di arresto cardiaco per asfissia che non richiede compressione toracica per la rianimazione. Questo modello è utile per il monitoraggio e l'imaging delle dinamiche della fisiologia cerebrale durante l'arresto cardiaco e la rianimazione.

Abstract

La maggior parte dei sopravvissuti all'arresto cardiaco (CA) sperimenta vari gradi di deficit neurologici. Per comprendere i meccanismi che sono alla base del danno cerebrale indotto da CA e, successivamente, sviluppare trattamenti efficaci, la ricerca sperimentale sulla CA è essenziale. A tal fine, sono stati stabiliti alcuni modelli di CA del topo. Nella maggior parte di questi modelli, i topi vengono posti in posizione supina per eseguire la compressione toracica per la rianimazione cardiopolmonare (RCP). Tuttavia, questa procedura di rianimazione rende difficile l'imaging/monitoraggio in tempo reale della fisiologia cerebrale durante la CA e la rianimazione. Per ottenere tali conoscenze critiche, il presente protocollo presenta un modello murino di CA per asfissia che non richiede la fase di RCP di compressione toracica. Questo modello consente lo studio dei cambiamenti dinamici nel flusso sanguigno, nella struttura vascolare, nei potenziali elettrici e nell'ossigeno del tessuto cerebrale dal basale pre-CA alla riperfusione post-CA precoce. È importante sottolineare che questo modello si applica ai topi anziani. Pertanto, questo modello murino di CA dovrebbe essere uno strumento fondamentale per decifrare l'impatto della CA sulla fisiologia del cervello.

Introduzione

L'arresto cardiaco (CA) rimane una crisi di salute pubblica globale¹. Solo negli Stati Uniti vengono segnalati ogni anno più di 356.000 casi di CA extraospedaliera e 290.000 casi di CA in ospedale e la maggior parte delle vittime di CA ha più di 60 anni. In particolare, le compromissioni neurologiche post-CA sono comuni tra i sopravvissuti e rappresentano una sfida importante per la gestione della CA 2,3,4,5. Per comprendere i cambiamenti patologici cerebrali post-CA e i loro effetti sugli esiti neurologici, sono state applicate varie tecniche di monitoraggio neurofisiologico e del tessuto cerebrale nei pazienti 6,7,8,9,10,11,12. Utilizzando la spettroscopia nel vicino infrarosso, il monitoraggio cerebrale in tempo reale è stato eseguito anche nei ratti CA per prevedere gli esiti neurologici¹³.

Tuttavia, nei modelli murini di CA, tale approccio di imaging è stato complicato dalla necessità di compressioni toraciche per ripristinare la circolazione spontanea, che comporta sempre un notevole movimento fisico e, quindi, ostacola delicate procedure di imaging. Inoltre, i modelli di CA vengono normalmente eseguiti con topi in posizione supina, mentre i topi devono essere girati in posizione prona per molte modalità di imaging cerebrale. Pertanto, in molti casi è necessario un modello murino con un movimento minimo del corpo durante l'intervento chirurgico per eseguire l'imaging/monitoraggio in tempo reale del cervello durante l'intera procedura CA, che va dal pre-CA al post-rianimazione.

In precedenza, Zhang et al. hanno riportato un modello di CA murino che potrebbe essere utile per l'imaging cerebrale¹⁴. Nel loro modello, la CA è stata indotta da iniezioni in bolo di vecuronio ed esmololo seguite dalla cessazione della ventilazione meccanica. Hanno dimostrato che dopo 5 minuti di CA, la rianimazione potrebbe essere ottenuta infondendo una miscela di rianimazione. In particolare, tuttavia, l'arresto circolatorio nel loro modello si è verificato solo circa 10 secondi dopo l'iniezione di esmololo. Pertanto, questo modello non ricapitola la progressione della CA indotta da asfissia nei pazienti, compresa l'ipercapnia e l'ipossia tissutale durante il periodo pre-arresto.

L'obiettivo generale dell'attuale procedura chirurgica è quello di modellare l'asfissia clinica CA nei topi seguita da rianimazione senza compressioni toraciche. Questo modello di CA, quindi, consente l'uso di tecniche di imaging complesse per studiare la fisiologia del cervello nei topi¹⁵.

Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali nella ricerca e il protocollo è stato approvato dal Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6 di età compresa tra 8 e 10 settimane.

1. Preparazione chirurgica

1. Pesa un mouse su una bilancia digitale e mettilo in una scatola di induzione per anestesia in plexiglass da 4 pollici x 4 pollici x 7.
2. Regolare il vaporizzatore per anestesia al 5% di isoflurano, il flussometro dell'ossigeno a 30 e il flussometro dell'azoto a 70 (vedere la tabella dei materiali).
3. Estrarre l'animale dalla scatola di induzione e adagiarlo in posizione supina sul banco operatorio quando la sua frequenza respiratoria è scesa a 30-40 respiri al minuto.
4. Estrarre la lingua con una pinza smussata e tenerla con la mano non dominante. Usa la mano dominante per inserire un laringoscopio (vedi Tabella dei materiali) nella bocca del topo e visualizzare le corde vocali.
5. Utilizzare la mano non dominante per inserire un filo guida e un catetere endovenoso da 20 G nella bocca. Inserire delicatamente il filo guida nella trachea.
6. Spingere il catetere nella trachea fino a quando la parte alare del catetere non è a posto con la punta del naso.
   NOTA: Non intubare un topo che non è completamente anestetizzato poiché ciò potrebbe ferire la trachea e causare sanguinamento delle vie aeree.
7. Collegare il topo intubato a un ventilatore per animali di piccola taglia (vedere la tabella dei materiali) e ridurre l'isoflurano all'1,5%.
8. Inserire il peso corporeo del topo nel pannello di controllo del ventilatore per determinare il volume corrente e la frequenza respiratoria.
9. Tenere il mouse in posizione supina sotto una lampada riscaldante e mantenere la temperatura rettale a 37 °C con un termoregolatore.
10. Radere le aree inguinali, disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con iodio e alcol (vedere la tabella dei materiali) e coprire l'area con un telo chirurgico sterile.
11. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi e somministrare 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea prima dell'intervento.
12. Aprire la confezione sterile dello strumento per l'intervento chirurgico. Praticare un'incisione cutanea di 1 cm con forbici chirurgiche per accedere alle arterie femorali su entrambi i lati. Sezionare e legare l'arteria femorale distale con un singolo filo di sutura di seta 4-0 (vedi Tabella dei materiali) e applicare una goccia di lidocaina.
13. Applicare una clip per aneurisma all'arteria femorale prossimale e praticare un piccolo taglio sull'arteria distale rispetto alla clip. Inserire un catetere in polietilene 10 (PE-10, vedere Tabella dei materiali) nelle arterie femorali sinistra e destra.
    NOTA: La linea arteriosa sinistra viene utilizzata per il monitoraggio della pressione arteriosa, mentre quella destra viene utilizzata per il prelievo di sangue e l'infusione della miscela per la rianimazione.
14. Iniettare 50 μL di soluzione fisiologica eparinizzata 1:10 in ciascuna linea arteriosa per prevenire la coagulazione nella linea.
15. Ruotare il mouse in posizione prona e montarlo su un telaio per la testa stereotassica.
16. Collegare tre elettrodi ad ago (rosso, verde e nero) al braccio sinistro, alla gamba sinistra e al braccio destro per il monitoraggio dell'elettrocardiogramma (ECG, vedere la tabella dei materiali).
17. Incollare una sonda flessibile in fibra di plastica sul cranio temporale intatto attraverso un'incisione cutanea di 0,5 cm per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale. Questo passaggio è facoltativo.
18. Radere la parte superiore della testa, disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con iodio e alcol e coprire l'area con un telo chirurgico sterile.
19. Praticare un'incisione cutanea di 2,5 cm sulla linea mediana e utilizzare quattro piccoli divaricatori per esporre l'intera superficie del cranio per l'imaging cerebrale.
20. Posizionare un imager di monitoraggio (ad es. un imager a contrasto a macchie laser, vedere Tabella dei materiali) sopra la testa.
    NOTA: Alcune gocce di soluzione fisiologica possono essere aggiunte alla superficie del cranio per facilitare l'imaging con contrasto con macchioline laser.

2. Induzione dell'arresto cardiaco

1. Riempire una siringa di plastica da 1 mL con 26 μL di soluzione madre del cocktail per la rianimazione.
   NOTA: Ogni millilitro di questa soluzione contiene 400 μL di 1 mg/mL di epinefrina, 500 μL di bicarbonato di sodio all'8,4%, 50 μL di eparina 1.000 U/mL e 50 μL di cloruro di sodio allo 0,9% (vedere la tabella dei materiali).
2. Attendere che la temperatura corporea raggiunga i 37 °C. Regolare il misuratore di ossigeno al 100% per ossigenare il sangue per 2 minuti.
3. Prelevare il sangue arterioso ossigenato fino a 200 μL attraverso l'arteria femorale destra nella siringa di plastica preparata contenente 26 μL di soluzione madre per cocktail di rianimazione.
4. Spegnere l'ossigeno e aumentare l'azoto al 100% per indurre l'anossia.
   NOTA: Dopo circa 45 secondi, il cuore non funzionerà più e la frequenza cardiaca diminuirà rapidamente, indicando l'insorgenza di CA. Dopo circa 2 minuti di privazione di ossigeno, il monitoraggio ECG indicherà un'asistolia e non ci sarà alcuna pressione sanguigna sistemica misurabile e un flusso sanguigno cerebrale trascurabile.
5. Spegnere il ventilatore, il vaporizzatore di isoflurano, il regolatore di temperatura e il flussometro di azoto. Regolare l'ossigeno al 100% in preparazione alla rianimazione.

3. Procedura di rianimazione

1. Accendere il ventilatore dopo 8 minuti dall'insorgenza della CA.
2. Iniziare immediatamente a infondere il sangue ossigenato prelevato miscelato con il cocktail di rianimazione nella circolazione sanguigna attraverso l'arteria femorale destra in 1 minuto.
   NOTA: L'infusione porta ad un graduale aumento della frequenza cardiaca e al ripristino della perfusione sanguigna; alla fine, si ottiene il ritorno della circolazione spontanea (ROSC).

4. Recupero post-CA

1. Posizionare il topo in posizione supina dopo averlo rimosso dalla struttura stereotassica e rimuovere i cateteri PE-10 dalle arterie femorali.
2. Applicare bupivacaina allo 0,25% sull'incisione cutanea e suturare le incisioni cutanee utilizzando una sutura di nylon 6-0 (vedere la tabella dei materiali). Applicare un unguento antibiotico sulla superficie dell'incisione cutanea.
3. Scollegare il ventilatore per topi quando viene ripristinata la respirazione spontanea.
4. Trasferire il mouse in una camera di recupero a temperatura controllata di 32 °C.
5. Dopo 2 ore di recupero, estubare il topo e tornare nella gabbia di casa. Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea per prevenire la disidratazione.

Risultati

Per indurre la CA, il topo è stato anestetizzato con isoflurano all'1,5% e ventilato con azoto al 100%. Questa condizione ha portato a una grave bradicardia in 45 secondi (Figura 1). Dopo 2 minuti di anossia, la frequenza cardiaca si è ridotta drasticamente (Figura 2), la pressione sanguigna è scesa al di sotto di 20 mmHg e il flusso sanguigno cerebrale è cessato completamente (Figura 1). Quando l'isoflurano è stato spento, la...

Discussione

Negli studi sperimentali di CA, l'asfissia, le iniezioni di cloruro di potassio o la fibrillazione ventricolare derivata da corrente elettrica sono state utilizzate per indurre CA 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalmente, la RCP è necessaria per la rianimazion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adrenalin	Par Pharmaceutical	NDC 42023-159-01
Alcohol swabs	BD	326895
Animal Bio Amp	ADInstruments	FE232
BP transducer	ADInstruments	MLT0699
Bridge Amp	ADInstruments	FE117
Heparin sodium injection, USP	Fresenius Kabi	NDC 63323-540-05
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser Doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Laser speckle imaging system	RWD	RFLSI III
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Micro clip	Roboz	RS-5431
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Needle electrode	ADInstruments	MLA1213	29 Ga, 1.5 mm socket
Nitrogen	Airgas	UN1066
Optic plastic fibre	Moor Instruments	POF500
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
PE-10 tubing	BD	427401	Polyethylene tubing
Povidone-iodine	CVS	955338
PowerLab 8/35	ADInstruments
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/ml
Small animal ventilator	Kent Scientific	RoVent Jr.
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chroride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
1 mL plastic syringe	BD	309659
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
6-0 nylon suture	Ethilon	1698G
8.4% sodium bicarbonate Inj., USP	Hospira	NDC 0409-6625-02
20 G IV catheter	BD	381534	20GA 1.6 IN
30 G PrecisionGlide needle	BD	305106	30 G X 1/2