用于缺血和复苏期间脑成像和脑生理学监测的小鼠心脏骤停模型

摘要

该方案展示了一种独特的窒息性心脏骤停小鼠模型，该模型不需要胸外按压进行复苏。该模型可用于监测和成像心脏骤停和复苏期间的大脑生理动力学。

摘要

大多数心脏骤停 （CA） 幸存者会出现不同程度的神经功能缺损。为了了解支撑 CA 诱导的脑损伤的机制并随后开发有效的治疗方法，实验性 CA 研究至关重要。为此，已经建立了一些小鼠CA模型。在大多数这些模型中，将小鼠置于仰卧位，以便进行胸外按压以进行心肺复苏（CPR）。然而，这种复苏程序使得 CA 和复苏期间大脑生理学的实时成像/监测具有挑战性。为了获得这些关键知识，本方案提出了一种不需要胸外按压CPR步骤的小鼠窒息CA模型。该模型可以研究血流、血管结构、电位和脑组织氧的动态变化，从 CA 前基线到 CA 再灌注后早期。重要的是，该模型适用于老年小鼠。因此，该小鼠CA模型有望成为破译CA对大脑生理学影响的关键工具。

引言

心脏骤停 （CA） 仍是一场全球公共卫生危机¹.仅在美国，每年就报告超过 356,000 例院外 CA 病例和 290,000 例住院 CA 病例，大多数 CA 患者年龄超过 60 岁。值得注意的是，冠状动脉后神经损伤在幸存者中很常见，这对冠状动脉管理构成了重大挑战2,3,4,5。为了了解 CA 后脑病理变化及其对神经系统结果的影响，已在患者⁶、^7、8、9、¹⁰、^11、12 中应用了各种神经生理学监测和脑组织监测技术。使用近红外光谱，还对 CA 大鼠进行了实时脑部监测，以预测神经系统结果¹³。

然而，在小鼠 CA 模型中，由于需要胸外按压以恢复自发循环，这种成像方法变得复杂，这总是需要大量的身体运动，因此阻碍了精细的成像程序。此外，CA模型通常在小鼠仰卧位的情况下进行，而对于许多脑成像方式，小鼠必须转向俯卧位。因此，在许多情况下，需要在手术过程中具有最小身体运动的小鼠模型，以便在从CA前到复苏后的整个CA过程中对大脑进行实时成像/监测。

此前，Zhang 等人报道了一种可用于脑成像的小鼠 CA 模型¹⁴。在他们的模型中，CA是通过推注维库溴铵和艾司洛尔诱导的，然后停止机械通气。他们表明，在CA5分钟后，可以通过输注复苏混合物来实现复苏。然而，值得注意的是，在他们的模型中，循环停滞仅发生在艾司洛尔注射后约 10 秒。因此，该模型没有概括患者窒息诱导的 CA 的进展，包括逮捕前期间的高碳酸血症和组织缺氧。

目前外科手术的总体目标是模拟小鼠的临床窒息性CA，然后在没有胸外按压的情况下进行复苏。因此，该 CA 模型允许使用复杂的成像技术来研究小鼠的大脑生理学¹⁵。

研究方案

这里描述的所有程序都是根据美国国立卫生研究院 （NIH） 关于在研究中护理和使用动物的指南进行的，并且该协议已获得杜克大学动物护理和使用委员会研究所 （IACUC） 的批准。本研究采用8-10周龄的C57BL/6雄性和雌性小鼠。

1. 手术准备

1. 在数字秤上称量小鼠，并将其放入 4 英寸 x 4 英寸 x 7 英寸的有机玻璃麻醉诱导盒中。
2. 将麻醉汽化器调整为5%异氟烷，氧气流量计调整至30，氮气流量计调整至70（见 材料表）。
3. 将动物从诱导箱中取出，当其呼吸频率降至每分钟30-40次呼吸时，将其仰卧在手术台上。
4. 用钝镊子拉出舌头，用非惯用手握住舌头。用惯用手将喉镜（见 材料表）插入鼠标的嘴里，观察声带。
5. 用非惯用手将导丝和 20 G 静脉导管插入口腔。轻轻地将导丝插入气管。
6. 将导管推入气管，直到导管的翼部与鼻尖齐平。
   注意:不要给未完全麻醉的小鼠插管，因为这可能会损伤气管并导致气道出血。
7. 将插管的小鼠连接到小动物呼吸机（见 材料表），并将异氟醚降至1.5%。
8. 将鼠标的体重输入呼吸机的控制面板，以确定潮气量和呼吸频率。
9. 在加热灯下保持鼠标仰卧位，并用温度控制器将直肠温度保持在 37 °C。
10. 剃除腹股沟区域，用碘和酒精对手术区域进行至少三次消毒（见 材料表），并用无菌手术单覆盖该区域。
11. 在双眼上涂抹眼药膏，并在手术前皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。
12. 打开无菌器械包装进行手术。用手术剪刀做一个 1 厘米的皮肤切口，以进入两侧的股动脉。用单股4-0丝线缝合线解剖并结扎股动脉远端（见材料表），并应用一滴利多卡因。
13. 在股动脉近端应用动脉瘤夹，并在夹子远端的动脉上做一个小切口。将聚乙烯 10（PE-10，参见 材料表）导管插入左右股动脉。
    注意:左动脉管用于血压监测，而右动脉管用于抽血和复苏混合物输注。
14. 将 50 μL 1:10 肝素化盐水注射到每条动脉管路中，以防止管路凝血。
15. 将鼠标转到俯卧位，并将其安装在立体定位头架上。
16. 将三个针电极（红色、绿色和黑色）连接到左臂、左腿和右臂进行心电图（ECG，见 材料表）监测。
17. 通过0.5厘米的皮肤切口将柔性塑料纤维探针粘在完整的颞颅骨上，用于脑血流监测。此步骤是可选的。
18. 剃掉头顶，用碘和酒精对手术区域进行至少三次消毒，并用无菌手术帷幔覆盖该区域。
19. 切开一个2.5厘米的中线皮肤切口，用四个小牵开器暴露整个颅骨表面进行脑成像。
20. 在头顶上方放置一个监测成像仪（例如，激光散斑对比成像仪，见 材料表）。
    注意:可以在颅骨表面添加几滴生理盐水，以促进激光散斑对比成像。

2. 诱发心脏骤停

1. 用 26 μL 复苏混合物储备液填充 1 mL 塑料注射器。
   注:每毫升该溶液含有 400 μL 1 mg/mL 肾上腺素、500 μL 8.4% 碳酸氢钠、50 μL 1,000 U/mL 肝素和 50 μL 0.9% 氯化钠（参见 材料表）。
2. 等到体温达到37°C。 将氧气计调整至100%，使血液充氧2分钟。
3. 通过右股动脉将含氧动脉血抽取至200μL的塑料注射器中，该注射器含有26μL复苏混合物储备溶液。
4. 关闭氧气，将氮气增加到100%以引起缺氧。
   注意:大约 45 秒后，心脏将无法正常工作，心率将迅速下降，表明 CA 发作。缺氧约 2 分钟后，心电图监测将提示心脏停搏，并且不会有可测量的全身血压和可忽略不计的脑血流量。
5. 关闭呼吸机、异氟烷汽化器、温度控制器和氮气流量计。将氧气调节至100%，为复苏做准备。

3. 复苏程序

1. 在 CA 发作后 8 分钟打开呼吸机。
2. 立即开始在1分钟内 通过 右股动脉将抽出的含氧血液与复苏混合物混合到血液循环中。
   注意:输注导致心率逐渐增加和血液灌注恢复;最终，实现了自主循环（ROSC）的恢复。

4. CA 后恢复

1. 将鼠标从立体定位框架中取出后置于仰卧位，并从股动脉中取出PE-10导管。
2. 将0.25%布比卡因涂在皮肤切口上，并使用6-0尼龙缝合线缝合皮肤切口（见 材料表）。将抗生素软膏涂抹在皮肤切口表面。
3. 当自主呼吸恢复时，断开鼠标呼吸机。
4. 将鼠标转移到温度控制为32°C的恢复室中。
5. 恢复2小时后，拔管小鼠，并返回家笼。皮下注射 0.5 mL 生理盐水以防止脱水。

结果

为了诱导CA，用1.5%异氟烷麻醉小鼠，并用100%氮气通气。这种情况导致 45 秒内出现严重的心动过缓（图 1）。缺氧2分钟后，心率急剧降低（图2），血压降至20mmHg以下，脑血流完全停止（图1）。当异氟醚被关闭时，体温不再被控制，并在CA结束时缓慢下降到约32°C（图1）。

CA 8 分钟后，立...

讨论

在实验性 CA 研究中，窒息、氯化钾注射或电流衍生的心室颤动已被用于诱导 CA 16、^17、18、¹⁹、20、21、^22、23。通常，在这些 CA 模型中，复苏需要心肺复苏术，尤其是在小鼠中。我们配制了一种复?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adrenalin	Par Pharmaceutical	NDC 42023-159-01
Alcohol swabs	BD	326895
Animal Bio Amp	ADInstruments	FE232
BP transducer	ADInstruments	MLT0699
Bridge Amp	ADInstruments	FE117
Heparin sodium injection, USP	Fresenius Kabi	NDC 63323-540-05
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser Doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Laser speckle imaging system	RWD	RFLSI III
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Micro clip	Roboz	RS-5431
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Needle electrode	ADInstruments	MLA1213	29 Ga, 1.5 mm socket
Nitrogen	Airgas	UN1066
Optic plastic fibre	Moor Instruments	POF500
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
PE-10 tubing	BD	427401	Polyethylene tubing
Povidone-iodine	CVS	955338
PowerLab 8/35	ADInstruments
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/ml
Small animal ventilator	Kent Scientific	RoVent Jr.
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chroride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
1 mL plastic syringe	BD	309659
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
6-0 nylon suture	Ethilon	1698G
8.4% sodium bicarbonate Inj., USP	Hospira	NDC 0409-6625-02
20 G IV catheter	BD	381534	20GA 1.6 IN
30 G PrecisionGlide needle	BD	305106	30 G X 1/2