Мышиная модель остановки сердца для визуализации мозга и мониторинга физиологии мозга во время ишемии и реанимации

Резюме

Данный протокол демонстрирует уникальную мышиную модель остановки сердца при асфиксии, не требующую компрессии грудной клетки для проведения реанимации. Эта модель полезна для мониторинга и визуализации динамики физиологии мозга при остановке сердца и реанимации.

Аннотация

Большинство людей, перенесших остановку сердца (КА), испытывают различные степени неврологического дефицита. Чтобы понять механизмы, лежащие в основе повреждения головного мозга, вызванного СА, и, следовательно, разработать эффективные методы лечения, необходимы экспериментальные исследования КА. С этой целью было создано несколько моделей CA для мышей. В большинстве этих моделей мышей помещают в положение лежа на спине, чтобы выполнить компрессию грудной клетки для сердечно-легочной реанимации (СЛР). Тем не менее, эта процедура реанимации затрудняет визуализацию/мониторинг физиологии мозга в режиме реального времени во время КА и реанимации. Для получения таких критически важных знаний в настоящем протоколе представлена модель СА асфиксии мыши, которая не требует этапа СЛР с компрессией грудной клетки. Эта модель позволяет изучать динамические изменения кровотока, структуры сосудов, электрических потенциалов и кислорода в тканях головного мозга от исходного уровня до ранней реперфузии после КА. Важно отметить, что эта модель применима к старым мышам. Таким образом, ожидается, что эта модель СА мыши станет важным инструментом для расшифровки влияния СА на физиологию мозга.

Введение

Остановка сердца (КА) остается глобальным кризисом общественного здравоохранения¹. Только в США ежегодно регистрируется более 356 000 внебольничных и 290 000 стационарных случаев КА, и большинство жертв КА старше 60 лет. Примечательно, что неврологические нарушения после КА распространены среди выживших, и они представляют собой серьезную проблему для ведения КА 2,3,4,5. Для понимания патологических изменений головного мозга после СА и их влияния на неврологические исходы были применены различные методы нейрофизиологического мониторинга и мониторинга тканей мозга у пациентов 6,7,8,9,10,11,12. Используя ближнюю инфракрасную спектроскопию, у крыс с СА также был проведен мониторинг мозга в режиме реального времени для прогнозирования неврологических исходов¹³.

Однако в мышиных моделях СА такой подход к визуализации был осложнен необходимостью компрессий грудной клетки для восстановления спонтанного кровообращения, что всегда влечет за собой значительные физические движения и, таким образом, препятствует деликатным процедурам визуализации. Кроме того, модели СА обычно выполняются с мышами в положении лежа на спине, в то время как мыши должны быть повернуты в положение лежа для многих методов визуализации мозга. Таким образом, во многих случаях требуется модель мыши с минимальными движениями тела во время операции для выполнения визуализации/мониторинга мозга в режиме реального времени во время всей процедуры СА, охватывающей период до СА до реанимации.

Ранее Zhang et al. сообщили о мышиной модели CA, которая может быть полезна для визуализации мозга¹⁴. В их модели КА индуцировали болюсными инъекциями векурония и эсмолола с последующим прекращением искусственной вентиляции легких. Они показали, что после 5 мин КА реанимация может быть достигнута путем инфузии реанимационной смеси. Примечательно, однако, что остановка кровообращения в их модели произошла только через 10 с после инъекции эсмолола. Таким образом, данная модель не повторяет прогрессирование асфиксийно-индуцированного КА у пациентов, включая гиперкапнию и гипоксию тканей в предарестном периоде.

Общей целью данной хирургической процедуры является моделирование клинической асфиксии СА у мышей с последующей реанимацией без компрессии грудной клетки. Таким образом, эта модель СА позволяет использовать сложные методы визуализации для изучения физиологии мозга у мышей¹⁵.

протокол

Все процедуры, описанные здесь, были проведены в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) по уходу и использованию животных в исследованиях, а протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Института Дьюка (IACUC). Для настоящего исследования были использованы самцы и самки мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель.

1. Хирургическая подготовка

1. Взвесьте мышь на цифровых весах и поместите ее в индукционную коробку для анестезии размером 4 x 4 x 7 дюймов из плексигласа.
2. Отрегулируйте испаритель анестезии на 5% изофлурана, расходомер кислорода на 30, а расходомер азота на 70 (см. Таблицу материалов).
3. Выньте животное из индукционного бокса и уложите его в лежачем положении на хирургическом столе, когда частота дыхания снизится до 30-40 вдохов в минуту.
4. Вытяните язык тупыми щипцами и удерживайте его недоминантной рукой. Доминирующей рукой вставьте ларингоскоп (см. Таблицу материалов) в рот мыши и визуализируйте голосовые связки.
5. Недоминантной рукой введите в рот проводник и внутривенный катетер 20 G. Аккуратно вставьте направляющий провод в трахею.
6. Введите катетер в трахею до тех пор, пока крылышко катетера не окажется на одном уровне с кончиком носа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не интубируйте мышь, которая не полностью обезболина, так как это может повредить трахею и вызвать кровотечение из дыхательных путей.
7. Подключите интубированную мышь к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких животных (см. таблицу материалов) и уменьшите уровень изофлурана до 1,5%.
8. Введите вес тела мыши в панель управления аппарата искусственной вентиляции легких, чтобы определить дыхательный объем и частоту дыхания.
9. Держите мышь в положении лежа на спине под тепловой лампой и поддерживайте ректальную температуру на уровне 37 °C с помощью регулятора температуры.
10. Побрить паховые области, продезинфицировать операционную область не менее трех раз йодом и спиртом (см. Таблицу материалов) и накрыть область стерильной хирургической простыней.
11. Нанесите глазную мазь на оба глаза и введите 5 мг/кг карпрофена подкожно перед операцией.
12. Откройте стерильную упаковку инструментов для операции. Сделайте разрез кожи диаметром 1 см хирургическими ножницами, чтобы получить доступ к бедренным артериям с обеих сторон. Рассекают и перевязывают дистальную бедренную артерию одной нитью шелкового шва 4-0 (см. таблицу материалов) и наносят одну каплю лидокаина.
13. Наложите зажим на аневризму в проксимальном отделе бедренной артерии и сделайте небольшой надрез на артерии дистальнее клипсы. Введите катетер из полиэтилена 10 (ПЭ-10, см. таблицу материалов) в левую и правую бедренные артерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левый артериальный катетер используется для контроля артериального давления, а правый – для забора крови и инфузии реанимационной смеси.
14. Введите 50 мкл гепаринизированного физиологического раствора в соотношении 1:10 в каждую артериальную линию, чтобы предотвратить свертывание крови в катетере.
15. Поверните мышь в положение лежа и установите ее на стереотаксическую рамку головы.
16. Подсоедините три игольчатых электрода (красный, зеленый и черный) к левой руке, левой ноге и правой руке для мониторинга электрокардиограммы (ЭКГ, см. Таблицу материалов).
17. Приклейте гибкий зонд из пластикового волокна к неповрежденному височной черепной коробке через разрез кожи 0,5 см для мониторинга мозгового кровотока. Этот шаг не является обязательным.
18. Побрейте верхнюю часть головы, продезинфицируйте операционную область не менее трех раз йодом и спиртом и накройте область стерильной хирургической драпелой.
19. Сделайте разрез кожи по средней линии длиной 2,5 см и с помощью четырех небольших ретракторов обнажите всю поверхность черепа для визуализации мозга.
20. Разместите над головой контрольный тепловизор (например, лазерный спекл-контрастный тепловизор, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько капель физиологического раствора могут быть добавлены на поверхность черепа, чтобы облегчить лазерную контрастную визуализацию.

2. Индукция остановки сердца

1. Наполните пластиковый шприц объемом 1 мл 26 мкл раствора реанимационного коктейля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый миллилитр этого раствора содержит 400 мкл 1 мг/мл адреналина, 500 мкл 8,4% бикарбоната натрия, 50 мкл 1000 ЕД/мл гепарина и 50 мкл 0,9% хлорида натрия (см. таблицу материалов).
2. Подождите, пока температура тела не достигнет 37 °C. Установите кислородомер на 100%, чтобы насытить кровь кислородом в течение 2 минут.
3. Набрать насыщенную кислородом артериальную кровь до 200 мкл через правую бедренную артерию в подготовленный пластиковый шприц, содержащий 26 мкл исходного раствора реанимационного коктейля.
4. Отключите кислород и увеличьте количество азота до 100%, чтобы вызвать аноксию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно через 45 с сердце перестает функционировать, и частота сердечных сокращений быстро снижается, что указывает на начало СА. Примерно через 2 минуты кислородного голодания мониторирование ЭКГ укажет на асистолию, не будет измеряемого системного артериального давления и пренебрежимо малого мозгового кровотока.
5. Выключите вентилятор, испаритель изофлурана, регулятор температуры и расходомер азота. Отрегулируйте уровень кислорода до 100% при подготовке к реанимации.

3. Реанимационная процедура

1. Включите аппарат искусственной вентиляции легких через 8 минут после начала СА.
2. Немедленно начать вливание изъятой оксигенированной крови, смешанной с реанимационным коктейлем, в кровообращение через правую бедренную артерию через 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузия приводит к постепенному увеличению частоты сердечных сокращений и восстановлению перфузии крови; В конце концов, достигается возврат спонтанной циркуляции (ROSC).

4. Восстановление после СА

1. Поместите мышь в положение лежа на спине после извлечения ее из стереотаксической рамки и извлеките катетеры PE-10 из бедренных артерий.
2. Нанесите 0,25% бупивакаина на разрез кожи и зашвите разрезы кожи нейлоновым шовным материалом 6-0 (см. Таблицу материалов). Нанесите мазь с антибиотиком на поверхность разреза кожи.
3. Отключите аппарат искусственной вентиляции легких мыши, когда самопроизвольное дыхание восстановится.
4. Переместите мышь в камеру восстановления с контролируемой температурой 32 °C.
5. Через 2 ч после выздоровления экстубируйте мышь и вернитесь в домашнюю клетку. Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание.

Результаты

Чтобы вызвать КА, мышь обезболивали 1,5% изофлураном и вентилировали 100% азотом. Это состояние приводило к тяжелой брадикардии через 45 с (рис. 1). Через 2 мин аноксии частота сердечных сокращений резко снизилась (рис. 2), артериальное давление снизилось ниже 20 ?...

Обсуждение

В экспериментальных исследованиях СА асфиксия, инъекции хлорида калия или фибрилляция желудочков, вызванная электрическим током, использовались для индуцирования СА 16,17,18,19,20,21,22,23.^...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adrenalin	Par Pharmaceutical	NDC 42023-159-01
Alcohol swabs	BD	326895
Animal Bio Amp	ADInstruments	FE232
BP transducer	ADInstruments	MLT0699
Bridge Amp	ADInstruments	FE117
Heparin sodium injection, USP	Fresenius Kabi	NDC 63323-540-05
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser Doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Laser speckle imaging system	RWD	RFLSI III
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Micro clip	Roboz	RS-5431
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Needle electrode	ADInstruments	MLA1213	29 Ga, 1.5 mm socket
Nitrogen	Airgas	UN1066
Optic plastic fibre	Moor Instruments	POF500
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
PE-10 tubing	BD	427401	Polyethylene tubing
Povidone-iodine	CVS	955338
PowerLab 8/35	ADInstruments
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/ml
Small animal ventilator	Kent Scientific	RoVent Jr.
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chroride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
1 mL plastic syringe	BD	309659
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
6-0 nylon suture	Ethilon	1698G
8.4% sodium bicarbonate Inj., USP	Hospira	NDC 0409-6625-02
20 G IV catheter	BD	381534	20GA 1.6 IN
30 G PrecisionGlide needle	BD	305106	30 G X 1/2