İskemi ve Resüsitasyon Sırasında Beyin Görüntüleme ve Beyin Fizyolojisinin İzlenmesi için Fare Kardiyak Arrest Modeli

Özet

Bu protokol, resüsitasyon için göğüs kompresyonunu gerektirmeyen benzersiz bir asfiksi kardiyak arrest fare modelini göstermektedir. Bu model, kardiyak arrest ve resüsitasyon sırasında beyin fizyolojisinin dinamiklerini izlemek ve görüntülemek için kullanışlıdır.

Özet

Kardiyak arrestten (CA) kurtulanların çoğu, değişen derecelerde nörolojik defisit yaşarlar. CA kaynaklı beyin hasarının temelini oluşturan mekanizmaları anlamak ve daha sonra etkili tedaviler geliştirmek için deneysel CA araştırması esastır. Bu amaçla, birkaç fare CA modeli oluşturulmuştur. Bu modellerin çoğunda, kardiyopulmoner resüsitasyon (CPR) için göğüs kompresyonu yapmak üzere fareler sırtüstü pozisyona yerleştirilir. Bununla birlikte, bu resüsitasyon prosedürü, CA ve resüsitasyon sırasında beyin fizyolojisinin gerçek zamanlı görüntülenmesini / izlenmesini zorlaştırır. Bu tür kritik bilgileri elde etmek için mevcut protokol, göğüs kompresyon CPR adımını gerektirmeyen bir fare asfiksisi CA modeli sunar. Bu model, kan akışındaki, vasküler yapıdaki, elektriksel potansiyellerdeki ve beyin dokusu oksijenindeki dinamik değişikliklerin CA öncesi başlangıçtan erken CA sonrası reperfüzyona kadar incelenmesine izin verir. Daha da önemlisi, bu model yaşlı fareler için geçerlidir. Bu nedenle, bu fare CA modelinin, CA'nın beyin fizyolojisi üzerindeki etkisini deşifre etmek için kritik bir araç olması beklenmektedir.

Giriş

Kardiyak arrest (CA) küresel bir halk sağlığı krizi olmaya devam ediyor¹. Yalnızca ABD'de yılda 356.000'den fazla hastane dışı ve 290.000'den fazla hastane içi CA vakası bildirilmektedir ve CA kurbanlarının çoğu 60 yaşın üzerindedir. Özellikle, CA sonrası nörolojik bozukluklar hayatta kalanlar arasında yaygındır ve bunlar CA yönetimi için büyük bir zorluk teşkil etmektedir 2,3,4,5. CA sonrası beyin patolojik değişikliklerini ve bunların nörolojik sonuçlar üzerindeki etkilerini anlamak için 6,7,8,9,10,11,12 numaralı hastalarda çeşitli nörofizyolojik monitörizasyon ve beyin dokusu monitörizasyon teknikleri uygulanmıştır. Yakın kızılötesi spektroskopi kullanılarak, nörolojik sonuçları tahmin etmek için CA sıçanlarında gerçek zamanlı beyin izleme de yapılmıştır¹³.

Bununla birlikte, murin CA modellerinde, böyle bir görüntüleme yaklaşımı, her zaman önemli fiziksel hareket gerektiren ve dolayısıyla hassas görüntüleme prosedürlerini engelleyen spontan dolaşımı eski haline getirmek için göğüs kompresyonlarına duyulan ihtiyaç nedeniyle karmaşıklaşmıştır. Ayrıca, CA modelleri normalde sırtüstü pozisyonda farelerle gerçekleştirilirken, birçok beyin görüntüleme modalitesi için farelerin yüzüstü pozisyona döndürülmesi gerekir. Bu nedenle, CA öncesinden resüsitasyon sonrasına kadar uzanan tüm CA prosedürü boyunca beynin gerçek zamanlı görüntülemesini/izlenmesini gerçekleştirmek için birçok durumda ameliyat sırasında minimum vücut hareketine sahip bir fare modeli gereklidir.

Daha önce, Zhang ve ark. beyin görüntüleme için yararlı olabilecek bir fare CA modeli bildirmiştir¹⁴. Modellerinde CA, vekuronyum ve esmololün bolus enjeksiyonları ve ardından mekanik ventilasyonun kesilmesi ile indüklendi. 5 dakikalık CA'dan sonra, bir resüsitasyon karışımı infüze edilerek resüsitasyonun sağlanabileceğini gösterdiler. Bununla birlikte, özellikle, modellerinde dolaşım durması, esmolol enjeksiyonundan sadece yaklaşık 10 saniye sonra meydana geldi. Bu nedenle, bu model, tutuklama öncesi dönemde hiperkapni ve doku hipoksisi dahil olmak üzere hastalarda asfiksinin neden olduğu CA'nın ilerlemesini özetlemez.

Mevcut cerrahi prosedürün genel amacı, farelerde klinik asfiksi CA'yı ve ardından göğüs kompresyonları olmadan resüsitasyonu modellemektir. Bu nedenle, bu CA modeli, farelerde beyin fizyolojisini incelemek için karmaşık görüntüleme tekniklerinin kullanılmasına izin verir¹⁵.

Protokol

Burada açıklanan tüm prosedürler, araştırmalarda hayvanların bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür ve protokol, Duke Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Enstitüsü (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için 8-10 haftalık C57BL/6 erkek ve dişi fareler kullanıldı.

1. Cerrahi hazırlık

1. Bir fareyi dijital bir ölçekte tartın ve pleksiglas anestezi indüksiyon kutusunda 4 inç x 4 inç x 7 içine yerleştirin.
2. Anestezi buharlaştırıcısını %5 izoflurana, oksijen akış ölçeri 30'a ve nitrojen akış ölçeri 70'e ayarlayın (bkz.
3. Hayvanı indüksiyon kutusundan çıkarın ve solunum hızı dakikada 30-40 nefese düştüğünde cerrahi tezgahta sırtüstü pozisyonda yatırın.
4. Dili künt forseps ile dışarı çekin ve baskın olmayan elinizi kullanarak tutun. Farenin ağzına bir laringoskop (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirmek ve ses telini görselleştirmek için baskın elinizi kullanın.
5. Ağza bir kılavuz tel ve 20 G intravenöz kateter yerleştirmek için baskın olmayan elinizi kullanın. Kılavuz teli yavaşça trakeaya yerleştirin.
6. Kateterin kanat kısmı burun ucu ile aynı hizaya gelene kadar kateteri soluk borusuna itin.
   NOT: Tam olarak uyuşturulmamış bir fareyi entübe etmeyin çünkü bu, trakeaya zarar verebilir ve hava yolu kanamasına neden olabilir.
7. Entübe fareyi küçük bir hayvan ventilatörüne bağlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve izofluranı %1,5'e düşürün.
8. Tidal hacmi ve solunum hızını belirlemek için farenin vücut ağırlığını ventilatörün kontrol paneline girin.
9. Fareyi bir ısı lambasının altında sırtüstü pozisyonda tutun ve bir sıcaklık kontrol cihazı ile rektal sıcaklığı 37 °C'de tutun.
10. Kasık bölgelerini tıraş edin, cerrahi bölgeyi en az üç kez iyot ve alkolle dezenfekte edin (bkz . Malzeme Tablosu) ve bölgeyi steril bir cerrahi örtü ile örtün.
11. Her iki göze göz merhemi sürün ve ameliyattan önce deri altına 5 mg/kg carprofen uygulayın.
12. Ameliyat için steril alet paketini açın. Her iki taraftaki femoral arterlere erişmek için cerrahi makasla 1 cm'lik bir cilt kesisi yapın. Distal femoral arteri tek bir 4-0 ipek sütür ipliği ile diseke edin ve bağlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir damla lidokain uygulayın.
13. Proksimal femoral artere bir anevrizma klipsi uygulayın ve klipsin distalindeki arterde küçük bir kesi yapın. Sol ve sağ femoral arterlere bir polietilen 10 (PE-10, Malzeme Tablosuna bakınız) kateter yerleştirin.
    NOT: Sol arter hattı kan basıncı izleme için, sağ hat ise kan alma ve resüsitasyon karışımı infüzyonu için kullanılır.
14. Hattaki pıhtılaşmayı önlemek için her bir arteriyel çizgiye 50 μL 1:10 heparinize salin enjekte edin.
15. Fareyi yüzüstü konuma getirin ve stereotaksik bir kafa çerçevesine monte edin.
16. Elektrokardiyogram (EKG, Malzeme Tablosuna bakınız) izleme için sol kola, sol bacağa ve sağ kola üç iğne elektrotu (kırmızı, yeşil ve siyah) bağlayın.
17. Serebral kan akışının izlenmesi için 0,5 cm'lik bir cilt kesisinden sağlam temporal kafatasına esnek bir plastik fiber prob yapıştırın. Bu adım isteğe bağlıdır.
18. Başın üstünü tıraş edin, cerrahi bölgeyi iyot ve alkolle en az üç kez dezenfekte edin ve bölgeyi steril bir cerrahi örtü ile örtün.
19. 2,5 cm'lik bir orta hat cilt kesisi kesin ve beyin görüntüleme için tüm kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için dört küçük ekartör kullanın.
20. Başın üzerine bir izleme görüntüleyicisi (örneğin, bir lazer benek kontrast görüntüleyici, Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin.
    NOT: Lazer benek kontrast görüntülemeyi kolaylaştırmak için kafatası yüzeyine birkaç damla salin eklenebilir.

2. Kardiyak arrest indüksiyonu

1. 1 mL'lik bir plastik şırıngayı 26 μL resüsitasyon kokteyli stok çözeltisi ile doldurun.
   NOT: Bu çözeltinin her mililitresi 400 μL 1 mg/mL epinefrin, 500 μL %8.4 sodyum bikarbonat, 50 μL 1.000 U/mL heparin ve 50 μL %0.9 sodyum klorür içerir (bkz.
2. Vücut ısısı 37 °C'ye ulaşana kadar bekleyin. Kanı 2 dakika oksijenlendirmek için oksijen ölçeri %100'e ayarlayın.
3. Oksijenli arteriyel kanı sağ femoral arter yoluyla 200 μL'ye kadar 26 μL resüsitasyon kokteyli stok solüsyonu içeren hazırlanmış plastik şırıngaya çekin.
4. Oksijeni kapatın ve anoksiyi indüklemek için nitrojeni %100'e yükseltin.
   NOT: Yaklaşık 45 saniye sonra kalp çalışmaz ve kalp atış hızı hızla azalır, bu da CA'nın başladığını gösterir. Yaklaşık 2 dakikalık oksijen yoksunluğundan sonra, EKG izlemesi bir asistol gösterecek ve ölçülebilir sistemik kan basıncı ve ihmal edilebilir serebral kan akışı olmayacaktır.
5. Vantilatörü, izofluran buharlaştırıcıyı, sıcaklık kontrol cihazını ve nitrojen akış ölçeri kapatın. Resüsitasyona hazırlanırken oksijeni %100'e ayarlayın.

3. Resüsitasyon prosedürü

1. CA başlangıcından 8 dakika sonra ventilatörü açın.
2. Resüsitasyon kokteyli ile karıştırılan geri çekilmiş oksijenli kanı hemen 1 dakika içinde sağ femoral arter yoluyla kan dolaşımına vermeye başlayın.
   NOT: İnfüzyon, kalp atış hızında kademeli bir artışa ve kan perfüzyonunun restorasyonuna yol açar; sonunda, spontan dolaşımın (ROSC) geri dönüşü sağlanır.

4. CA sonrası kurtarma

1. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkardıktan sonra sırtüstü pozisyona getirin ve PE-10 kateterlerini femoral arterlerden çıkarın.
2. Cilt kesisine %0.25 bupivakain uygulayın ve 6-0 naylon sütür kullanarak cilt kesilerini dikin (bkz. Cilt kesisinin yüzeyine antibiyotik merhem sürün.
3. Spontan solunum geri geldiğinde fare ventilatörünün bağlantısını kesin.
4. Fareyi 32 °C kontrollü sıcaklığa sahip bir kurtarma odasına aktarın.
5. 2 saatlik iyileşmeden sonra, fareyi ekstübe edin ve ev kafesine geri dönün. Dehidrasyonu önlemek için deri altına 0.5 mL normal salin enjekte edin.

Sonuçlar

CA'yı indüklemek için, fare% 1.5 izofluran ile uyuşturuldu ve% 100 nitrojen ile havalandırıldı. Bu durum 45 saniyede şiddetli bradikardiye yol açtı (Şekil 1). 2 dakikalık anoksiden sonra, kalp hızı önemli ölçüde azaldı (Şekil 2), kan basıncı 20 mmHg'nin altına düştü ve serebral kan akışı tamamen durdu (Şekil 1). İzofluran kapatıldığı için, vücut ısısı artık yönetilemedi ve CA'nın sonunda y...

Tartışmalar

Deneysel CA çalışmalarında, CA 16,17,18,19,20,21,22,23'ü indüklemek için asfiksi^, potasyum klorür enjeksiyonları veya elektrik akımı kaynaklı ventriküler fibrilasyon kullanılmıştır. Normalde, bu CA modellerinde, özellikle farelerde resüsi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adrenalin	Par Pharmaceutical	NDC 42023-159-01
Alcohol swabs	BD	326895
Animal Bio Amp	ADInstruments	FE232
BP transducer	ADInstruments	MLT0699
Bridge Amp	ADInstruments	FE117
Heparin sodium injection, USP	Fresenius Kabi	NDC 63323-540-05
Isoflurane	Covetrus	NDC 11695-6777-2
Laser Doppler perfusion monitor	Moor Instruments	moorVMS-LDF1
Laser speckle imaging system	RWD	RFLSI III
Lubricant eye ointment	Bausch + Lomb	339081
Micro clip	Roboz	RS-5431
Mouse rectal probe	Physitemp	RET-3
Needle electrode	ADInstruments	MLA1213	29 Ga, 1.5 mm socket
Nitrogen	Airgas	UN1066
Optic plastic fibre	Moor Instruments	POF500
Otoscope	Welchallyn	728	2.5 mm Speculum
Oxygen	Airgas	UN1072
PE-10 tubing	BD	427401	Polyethylene tubing
Povidone-iodine	CVS	955338
PowerLab 8/35	ADInstruments
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	6100701	Injectable 50 mg/ml
Small animal ventilator	Kent Scientific	RoVent Jr.
Temperature controller	Physitemp	TCAT-2DF
Triple antibioric & pain relief	CVS	NDC 59770-823-56
Vaporizer	RWD	R583S
0.25% bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1159-18
0.9% sodium chroride	ICU Medical	NDC 0990-7983-03
1 mL plastic syringe	BD	309659
4-0 silk suture	Look	SP116	Black braided silk
6-0 nylon suture	Ethilon	1698G
8.4% sodium bicarbonate Inj., USP	Hospira	NDC 0409-6625-02
20 G IV catheter	BD	381534	20GA 1.6 IN
30 G PrecisionGlide needle	BD	305106	30 G X 1/2