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要約

この研究では、水サンプル中の3つの主要なクレードから レプトスピラ を検出するために、ドットブロットアプリケーションを設計しました。この方法により、ジゴキシゲニン標識プローブによって特異的に標的とされる最小限のDNA量を同定でき、抗ジゴキシゲニン抗体によって容易に検出されます。このアプローチは、スクリーニングの目的にとって貴重で満足のいくツールです。

要約

ドットブロットは、キャリアDNAの存在下でプローブハイブリダイゼーションによって特異的に標的とされる最小限の量のDNAの同定を可能にする、シンプル、高速、高感度、および汎用性の高い技術です。これは、ナイロン膜などの不活性固体支持体に既知の量のDNAを、ドットブロット装置を利用して電気泳動分離なしで転写することに基づいています。ナイロン膜は、高い核酸結合能(400μg / cm2)、高強度、および正または中性に帯電しているという利点があります。使用されるプローブは、ジゴキシゲニン(DIG)で標識された18〜20塩基の非常に特異的なssDNAフラグメントです。プローブは レプトスピラ DNAと結合します。プローブが標的DNAとハイブリダイズすると、抗ジゴキシゲニン抗体によって検出され、X線フィルムで明らかになった発光によって簡単に検出できます。発光のあるドットは、目的のDNA断片に対応します。この方法では、プローブの非同位体標識を採用しており、半減期が非常に長い場合があります。この標準的な免疫標識の欠点は、同位体プローブよりも感度が低いことです。それにもかかわらず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とドットブロットアッセイを組み合わせることで軽減されます。このアプローチにより、ターゲット配列の濃縮とその検出が可能になります。さらに、よく知られている標準の段階希釈と比較した場合の定量的アプリケーションとして使用できます。ここでは、水サンプル中の3つの主要なクレードから レプトスピラ を検出するためのドットブロットアプリケーションを紹介します。この方法論は、遠心分離によって濃縮された大量の水に適用して、レプトスパイラルDNAの存在の証拠を提供することができます。これは、一般的なスクリーニング目的にとって貴重で満足のいくツールであり、水中に存在する可能性のある他の培養不可能な細菌に使用できるため、生態系の理解が向上します。

概要

ヒトのレプトスピラ症は、主に環境源に由来します1,2。湖、川、小川でのレプトスピラの存在は、野生生物、および最終的にこれらの水域と接触する可能性のある家畜および生産動物の間でのレプトスピラ症の伝播の指標です1,3,4。さらに、レプトスピラは、下水、停滞水、水道水などの非天然水源で確認されています5,6。

レプトスピラは世界中に分布する細菌であり7,8、その保存と伝播における環境の役割はよく認識されています。レプトスピラは、さまざまなpHとミネラル9の飲料水、および天然の水域1で生存できます。また、蒸留水10中で長期間生存することができ、一定のpH(7.8)下では、最大152日間生存する可能性があります11。さらに、レプトスピラは、過酷な条件を生き残るために細菌コンソーシアムで相互作用する可能性があります12,13。アゾスピリルムやスフィンゴモナスを含む淡水中のバイオフィルムの一部である可能性があり、49°Cを超える温度に成長し、耐えることさえできます14,15。また、浸水した土壌で増殖し、最大379日間生存し続けることができ16、17,18年もの間病気を引き起こす能力を維持します。しかし、水域内の生態学と、それが水域内でどのように分布しているかについてはほとんど知られていません。

その発見以来、レプトスピラ属の研究は血清学的検査に基づいていました。分子技術がこのスピロヘータの研究でより普及したのは今世紀になってからでした。ドットブロットは、(1)16S rRNAおよび単純配列反復(ISSR)に基づく同位体プローブ19,20、(2)尿に適用されるヒトレプトスピラ症に対するナノゴールドベースの免疫測定法21、または(3)ウシ尿サンプル22に対する抗体ベースのアッセイとして、その同定にはほとんど使用されていません.この技術は、もともと同位体プローブに基づいていたため、使用されなくなりました。しかし、PCRと組み合わせることで、より高度な結果が得られることはよく知られた技術であり、非同位体プローブを使用しているため安全であると考えられています。PCRは、サンプル中に微量に見られる可能性のある特定のDNA断片を増幅することにより、レプトスピラDNAの濃縮に重要な役割を果たします。各PCRサイクル中に、標的DNA断片の量が反応で2倍になります。反応の終わりに、アンプリコンは100万倍以上になりました23。PCRによって増幅された生成物は、アガロース電気泳動では見えないことが多いが、ドットブロット24,25,26のDIG標識プローブとの特異的ハイブリダイゼーションによって見えるようになる。

ドットブロット法は、シンプルで堅牢で、多数のサンプルに適しているため、リソースが限られているラボでも利用することができます。これは、(1)口腔細菌27、(2)食物や糞便などの他のサンプルタイプ28、および(3)培養不可能な細菌の同定29を含むさまざまな細菌研究で採用されており、多くの場合、他の分子技術と一致しています。ドットブロット技術によって提供される利点の中には、(1)メンブレンは高い結合能力を持ち、200μg/ cm2 以上の核酸および最大400μg / cm2に結合することができる。(2)ドットブロットの結果は、特別な機器を必要とせずに視覚的に解釈でき、(3)室温(RT)で何年も保存することができます。

レプトスピラ属は、病原性、中間性、および腐生性のクレードに分類されています30,31。これらのクレード間の区別は、lipL41、lipL32、および16S rRNAなどの特定の遺伝子に基づいて達成できます。LipL32は病原性クレードに存在し、さまざまな血清学的および分子的ツールで高い感受性を示しますが、腐生植物種には存在しません21。ハウスキーピング遺伝子lipL41は、その安定した発現で知られており、分子技術32に使用され、16S rRNA遺伝子はそれらの分類に利用されています。

この方法は、遠心分離によって濃縮された大量の水に適用できます。これにより、水域内のさまざまなポイントと深さを評価して、レプトスパイラルDNAの存在とそれが属するクレードを検出できます。このツールは、生態学的および一般的なスクリーニング目的の両方に有用であり、水中に存在する可能性のある他の培養不可能な細菌を検出するためにも使用できます。

さらに、PCRおよびドットブロットアッセイは、高度な機器や高価な機器を持たないラボであっても、幅広いラボにとって技術的および経済的に手頃な価格です。この研究は、ジゴキシゲニンベースのドットブロットを、天然の水域から収集された水サンプル中の3つの レプトスピラ クレードの同定に適用することを目的としています。

細菌株
12の レプトスピラ 血清型動物(Autumnalis、Bataviae、Bratislava、Canicola、Celledoni、Grippothyphosa、Hardjoprajitno、Icterohaemorrhagiae、Pomona、Pyrogenes、Tarassovi、およびWolffi)がこの研究に含まれました。これらの血清型は、メキシコ国立自治大学獣医学部微生物学・免疫学科のコレクションの一部であり、現在、微小凝集試験(MAT)に使用されています。

すべての レプトスピラ 血清型動物はEMJHで培養され、それらのDNAは市販のDNA抽出キットを使用して抽出されました( 材料の表を参照)。12種類の血清型のゲノムDNA混合物を 、レプトスピラ 病原性クレードのポジティブコントロールとして使用した。 レプトスピラ 中間体クレードのポジティブコントロールとして、 Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6由来のゲノムDNAが含まれ、 レプトスピラ 腐生菌クレードのポジティブコントロールとして、 Leptospira biflexa serovar Patoc Patoc株Patoc IのゲノムDNAも含まれていた。

ネガティブコントロールは、空のプラスミド、非血縁細菌(Ureaplasma urealyticum、黄色ブドウ球菌、Brucella abortus、Salmonella typhimurium、赤痢菌、肺炎桿菌、Acinetobacter baumannii、 および 大腸菌 )のDNA、および非テンプレートコントロールとして機能するPCRグレードの水で構成されていました。

水のサンプル
12の試験グラブサンプルは、Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center(CIBAC)から層別でたらめなサンプリング法を使用して収集されました(19°16'54" N 99°6'11" W)。これらのサンプルは、表層、10、30 cmの3つの深さで採取されました(図1A、B)。水の収集手順は、絶滅危惧種や保護種に影響を与えませんでした。各サンプルは、滅菌済みの15 mL微量遠心チューブに収集しました。サンプルを採取するために、各チューブを水に静かに沈め、選択した深さで充填してから密封しました。サンプルは22°Cに維持され、処理のためにすぐに実験室に運ばれました。

各サンプルは、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに8000 x g で20分間遠心分離して濃縮しました。このステップは、すべてのサンプルが1本のチューブに濃縮されるまで繰り返され、DNA抽出に使用されました(図1C)。

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図1:遠心分離による水サンプルの濃度(A)採水池、(B)自然の流れ。(C)遠心分離ベースの水サンプル処理を必要な回数だけ繰り返します(n)。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

DNA抽出
全DNAは、製造元の指示に従って市販のゲノムDNAキットを使用して単離しました( 材料の表を参照)。DNA抽出物を20μLの溶出緩衝液中で溶出し、DNA濃度をUV分光光度計で260〜280nmで測定し、使用するまで4°Cで保存した。

PCR増幅
PCRターゲットは、16個のS rRNA、lipL41、およびlipL32遺伝子であり、レプトスピラ属のDNAを同定し、病原性、腐生性、および中間体の3つのクレードを区別することができます。プライマーとプローブの設計は、Ahmedら、Azaliら、Bourhyら、Weissら、およびBrangerらによる以前の研究に基づいていました33,34,35,36,37。各プローブ、プライマー、および増幅フラグメントの配列は、表1に記載され、参照配列とのアラインメントは、補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4、および補足ファイル5に記載されている。PCR試薬とサーモサイクル条件は、プロトコルのセクションに記載されています。

増幅産物は、TAE(40 mM Tris 塩基、20 mM 酢酸、1 mM EDTA、pH 8.3)中の 1% アガロースゲル上で電気泳動分離し、エチジウムブロマイド検出を行い、エチジウムブロマイド検出を行い、補足図 1 に示すように可視化しました。各血清型から得られたゲノムDNAは、病原性レプトスピラのL.インターロガン(4, 691, 184 bp)38、腐生性レプトスピラのL. biflexa(3, 956, 088 bp)39のゲノムサイズに基づいて、各PCR反応において6 x 106から1 x 104ゲノム当量コピー(GEq)の範囲の濃度で使用されました。 L. fainei serovar Hurstbridge株BUT6(4、267、324 bp)のゲノムサイズ(アクセッション番号AKWZ00000000.2)。

プローブの感度は、各実験で各病原性血清型、 L. biflexa serovar Patoc Patoc I株、および L. fainei serovar Hurstbridge株BUT6のDNAで評価されました。PCRおよびドットブロットハイブリダイゼーションアッセイの特異性を評価するために、非血縁細菌由来のDNAを含めました。

表1:レプトスピラの病原性、腐生菌、および中間クレードを同定するための産物を増幅するためのPCRプライマーおよびプローブ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ
DNAサンプルを入れる穴がドット状になっており、真空吸引で所定の位置に固定するように吸引すると、この形状になることからドットブロットと呼ばれる手法です。この手法は、Kafatos et al.40によって開発されました。この技術により、各PCR陽性サンプル中のレプトスピラを半定量化できます。プロトコルは、室温でNaOH 0.4Mによる変性で構成され、6 x 106〜104レプトスパイアに対応する30ng〜0.05ngのレプトスピラDNAを含むサンプルを、96ウェルドットブロット装置でナイロンメンブレンにブロットします。固定化後、DNAは120mJのUV光にさらされることによって膜に結合します。各DNAプローブは、3'末端の末端トランスフェラーゼ触媒ステップによってジゴキシゲニン-11dUTPと結合される(ジゴキシゲニンは、レポーターとして使用されるジギタリス・プルプレアから得られる植物ステロイドである41)。標識されたDNAプローブ(50 pmol)を特定の温度で標的DNAに厳密にハイブリダイズした後、DNAハイブリッドは、その基質CSPDと共有結合した抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ抗体との化学発光反応によって可視化されます。発光は、X線フィルムへの曝露によって捕捉されます(図2)。

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図2:PCRドットブロットアッセイの手順のステップ。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1.サンプル調製

  1. 各水サンプルを1.5 mLの微量遠心チューブに濃縮し、8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 このステップを必要な回数繰り返して、サンプルを250 μLの容量に濃縮します。
  2. 製造元の指示に従ってDNA抽出キットを使用してください( 材料の表を参照)。
  3. 使用するドットブロットプローブに従って特異的PCRを実施します(表1)。
    1. 各水サンプルまたはリファレンスゲノムDNAから、1 X バッファー、2.5 ユニットの Taq ポリメラーゼ、各プライマー 1 μM、各 dNTP 0.2 mM、1.5 mM MgCl2、および各水サンプルまたはリファレンスゲノム DNA のターゲット DNA 100 ng を含む最終容量 25 μL の PCR チューブで増幅を行います。
    2. サーモサイクル条件に従ってサーモサイクラーでPCR反応をプログラムします(表2)。
    3. 使用するまで反応液を4°Cで保存してください。
  4. ブロットする各PCR産物10 μLを、96ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
  5. 各ウェルに40 μLのTEを加え、ピペッティングで混合します。
    注:96ウェルプレートは密封し、4°Cで一晩保存できます。 補足ファイル6 に記載されている指示に従って、プロトコルのバッファーと溶液を準備します。 図3 は、サンプル調製のステップを示しています。

表2:16S、lipL41、およびlipL32遺伝子のPCRサーモサイクリング条件。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-1148
図3:PCRとサンプル調製。 特異的PCRプロトコルを適用して、PCR産物をマイクロタイタープレートに移し、40μLのTEを各ウェルに添加した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

2. ドットブロット装置の組み立て

注:ドットブロット装置の組み立てを 図4に示します。処置中は、アルカリ溶液を取り扱うために手袋を着用し、ナイロン膜を汚染から保護します。

figure-protocol-1734
図4:ドットブロット装置の組み立て。 濾紙とナイロン膜(10 X SSPEで湿らせた状態)は、正しい順序で配置する必要があります。掃除機をかける前に、アセンブリをネジでしっかりと固定する必要があります。各ウェルはTEで洗浄する必要があり、PCR産物はそれぞれのウェルにロードされます。PCR産物をメンブレンを通して移した後、各ウェルをTEで再度洗浄し、乾燥させます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

  1. ナイロン膜( 材料の表を参照)と濾紙を12 x 8.5 cmのサイズにカットします。
  2. 膜に油性マーカーで印を付けます。
  3. 正しい方向を示すために、片方の端にハサミで切り込みを入れます。マークを使用して、サンプルの順序を覚えます。
  4. メンブレンと濾紙を10 X生理食塩水-リン酸ナトリウム-EDTA緩衝液(SSPE;3 M NaCl、0.2 M NaH2PO4、および0.02 M EDTA、pH 7.4)で湿らせます(補足ファイル6)。メンブレンは、清潔で先端が鈍いピンセットで取り扱ってください。
  5. ドットブロットチャンバーを組み立てます。まず、濾紙、次にプラスチックシールの上の膜。カバーをネジで横方向に固定します。
  6. チャンバーを真空に接続し、各ウェルに100μLのTEを入れ、真空を1分間保持してから停止します。
  7. 真空を低速でオンにし、各サンプルの50μLをドットブロット装置のメンブレン上の対応するウェルにロードします(事前に決定されたメンブレン分布に従います)。
    注:各サンプルを赤血球凝集96ウェルプレートでホモジナイズしてから、ドットブロットチャンバーに入れます。
  8. 真空で膜を乾燥させます。必要に応じて、チャンバーを軽く叩いてサンプル内の気泡を放出します。
  9. 100 μLのTEを連続真空で入れて乾かして、各ウェルを洗浄します。
    注意: 転送が完了したら、最初にポンプのスイッチを切り、取り外すことが重要です。そうしないと、逆流が装置に入る可能性があります。DNAは、正に帯電したナイロン膜が用いられるならば、変性工程を必要としないが、他の不活性支持体を用いるならば、予変性工程およびアルカリベースの変性が必要とされ得る41。

3. DNAの変性・固定

注: 図5 は、DNA膜固定手順を示しています。

figure-protocol-3283
図5:DNA膜固定手順。 DNAはアルカリ溶液中で変性します。次に、10 X SSPEで中和し、メンブレンを乾燥させます。次に、膜を透過照射します。メンブレンは2 X SSPEで再水和され、一晩プレハイブリダイズされます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

  1. メンブレンを0.4 M NaOHで室温で10分間インキュベートします。
  2. メンブレンを10 X SSPEで室温で10分間平衡化します。
  3. メンブレンを80°Cで2時間乾燥させます。
  4. 120 mJのUVライトで3分間トランスイルミネーションします。サンプルがUV光源に向いていることを確認してください。UV架橋剤を使用する場合は、サンプルが上を向いていることを確認し、この手順を2回繰り返します。
    注:UV架橋の前に、メンブレンを完全に乾燥させる必要があります。DNAは、ナイロン膜への共有結合によって固定化されます。各架橋には約18インチから1フィートかかり、ほとんどのハイブリダイゼーション実験では、最適なUV照射量は約0.6〜0.8kJ / m2です。
    紫外線を浴びると、目や皮膚に有害です。適切な保護具を着用し、素肌に触れないようにしてください。
  5. メンブレンを2 X SSPEで10分間洗浄します。
  6. メンブレンを注意深く折り畳み、ハイブリダイゼーションチューブに挿入します(15mLの微量遠心チューブを使用します)。
  7. プレハイブリダイゼーション溶液(Supplementary File 6)10 mLをチューブに加え、42°Cで一晩インキュベートします。漏れを防ぐために、チューブが適切に密閉されていることを確認してください。

4.ハイブリダイゼーション

  1. ハイブリダイゼーションチューブからプレハイブリダイゼーション溶液5mLを取り出します。5mLを2回目に使用する場合は、別のチューブに入れて-4°Cで保存してください。
  2. 標識プローブ(表1)15 μLをハイブリダイゼーションチューブに加えます。チップを溶液にすすぎ、標識プローブが希釈液に完全に注入されたことを確認します。
    注:DNAプローブの結合は、抗原抗体結合ほど強くありません。したがって、サンプル中のプローブまたはDNAの濃度の変化は、放出される蛍光の強度に影響を与える可能性があります。DNAプローブは化学量論的であり、DNAに結合するプローブ分子の数は、溶液中に存在するDNA分子の数と同等です。 図6 は、プローブのハイブリダイゼーションを示しています。
  3. 42°Cで一晩インキュベートします。
  4. DNAプローブDIG標識を行います。 表3 の指示に従って試薬を混合し、混合物を37°Cで1時間インキュベートします。次に、80 μLの蒸留水を加え、テールプローブを4°Cで保存します。

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図6:プローブハイブリダイゼーション。 ハイブリダイゼーションバッファーの容量を調整し、ジゴキシゲニン標識プローブを組み込んで、プローブのハイブリダイゼーションを一晩で行えます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

表3:ジゴキシゲニン(DIG)で標識したプローブ用試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

5. 化学発光(抗DIGタギング)

  1. メンブレンを2 X SSPE/0.1% SDSで室温で10分間2回洗浄します。
  2. 5 X SSPE/0.1% SDSを使用して、プローブのアニーリング温度で15分間メンブレンをインキュベートします。
    注意: このステップでは、蓋付きの容器を使用して、温度をできるだけ長く維持します。膜全体の均一で一定の温度を確保します。各洗浄のおおよその容量は、示された溶液の100mLです。
  3. メンブレンをバッファー1(補足ファイル6)で室温で5分間1回洗浄します。
  4. メンブレンをバッファー2(補足ファイル6)で室温で30分間1回洗浄します。
  5. メンブレンを緩衝液2で洗浄し、抗ジゴキシゲニン抗体(15 μL)を添加し( 材料表を参照)、45分間インキュベートします(インキュベーション時間は30〜60分と変化します)。この二次抗体は、検出のためにプローブにタグを付けます。
    注:メンブレンは、抗ジゴキシゲニン抗体とともに緩衝液2に4〜8°Cで一晩保存できます。 化学発光プロセスの抗DIGタグ付けを 図7に示します。

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図7:化学発光プロセスの抗DIGタグ付け。 結合していない核酸は緩衝液で除去されます。プローブをターゲットDNAにアライメントし、余分なものを取り除きます。メンブレンをブロッキング1Xバッファーでブロックし、抗DIG抗体を添加します(1:10000)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

6. 化学発光(基板応用)

  1. メンブレンを緩衝液1で室温で15分間2回洗浄します。
  2. 緩衝液3( 補足ファイル6を参照)で室温で5分間1回洗浄し、メンブレンは緩衝液の大部分を排出し、ほとんど乾燥させます。
  3. すぐに使用できるCSPD(3-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}-4-イル)フェニルリン酸二ナトリウム、 材料の表を参照)を加え、5分間放置します(湿らせた指でCSPDを片側から反対側に均質化します)。
  4. メンブレンの寸法に合う透明なビニール袋(12.5 x 9 cm)にメンブレンを入れます。気泡を慎重に取り除き、CSPDを均等に分散させ、バッグをヒートシールします。
  5. メンブレンを37°Cの水浴中で15分間インキュベートし(最大30分間)、サンプルを含むメンブレンが下向きに配置され、十分に沈められるようにします。温度が一定に保たれ、膜全体に十分に分布していることを確認してください。
  6. ビニール袋を乾かし、すでに使用済みのX線フィルムにスコッチテープで固定します。これにより、露光手順中の取り扱いが容易になります。
    注: 図8 は、化学発光プロセスの基板アプリケーションを示しています。

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図8:化学発光プロセスの基板応用。 遊離抗体を除去し、基質CSPD(1:250)をメンブレンに添加します。反応は37°Cでのインキュベーションによって活性化され、膜はX線フィルムに化学発光を記録するように配置されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

7. 化学発光(検出)

  1. ばく露手順を実行します。暗室で、それぞれのトレイに現像液と定着液( 材料の表を参照)を準備します。
  2. 暗闇の中で、固定膜を新しいX線撮影フィルムに面して慎重に置き、X線撮影カセットに挿入します( 材料の表を参照)。
  3. 露光時刻を登録します。曝露時間は1分から30分以上までさまざまです。5分から始めて、それに応じて時間を調整します。
  4. 現像液でX線フィルムを1〜3分間湿らせ、水道水(15〜45秒)でやさしくすすいでください。
  5. X線フィルムを定着液で1〜3分間湿らせ、水道水(45秒)でやさしくすすいでください。
  6. X線フィルムを風乾させ、アッセイを目に見える白色のライトボックスに記録します。
    注:X線露光時間中はメンブレンを振らないでください。検出プロセスを 図9に示します。
  7. 結果の解釈に進みます。露光されたX線フィルムでは、発光するドットを視覚的に配置し、プローブのハイブリダイゼーションを伴うDNA断片に対応することができます。放出される信号の強度は、発光と露光時間によって異なります。
    注:メンブレンは、室温で数ヶ月間濾紙の間に乾燥させて保存することができます。

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図9:化学発光プロセスの検出。 暗い条件下では、メンブレンはX線カセット内のX線フィルムに曝露されます。次に、博覧会の時間に放置し、X線フィルムを現像して固定しました。最後に、風乾して解釈しました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

8. 膜脱ハイブリダイゼーション手順

  1. メンブレンを蒸留水で10分間2回洗浄します。
  2. メンブレンを0.4 M NaOHで53°Cで20分間洗浄します(2回)。
  3. メンブレンを2倍に2回、SSPE2本で10分間洗浄します。
  4. メンブレンを室温で乾燥させます。
  5. メンブレンを保持し、プロトコルのステップ3.5に戻ります。
    注:メンブレンは、プレハイブリダイゼーションバッファーに4〜8°Cで一晩保存することができます。 翌日、42°Cで1時間インキュベーションして再開し、プレハイブリダイゼーションバッファーを温度に到達させます。次に、プロトコルのステップ3.5に進みます。

結果

この技術の有効性を評価するために、各レプトスピラ血清型の純粋培養物からのゲノムDNAを、クレード特異的プローブとともに使用しました。膜は、各血清型のPCR反応ごとに100ngのゲノムDNAで調製され、続いて非関連細菌の8つのゲノムDNAとアドホックなレプトスピラ血清のゲノムDNAの可変濃度が続きました。各アッセイには、ポジティブ、ネガティブ、および非テンプレートコ?...

ディスカッション

ドットブロット技術の重要なステップには、(1)DNA固定化、(2)非相同DNAによる膜上の自由結合部位のブロッキング、(3)アニーリング条件下でのプローブと標的フラグメントとの間の相補性、(4)非ハイブリダイズプローブの除去、および(5)レポーター分子の検出が含まれます41。

PCR−ドット−ブロットは、ある種の限界を有し、例えば、この技術は、ハイブ...

開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言する。

謝辞

メキシコ国立自治大学獣医学部微生物学・免疫学科のレプトスピラコレクションに恩義を感じています。参照レプトスピラ株の寛大な寄付に感謝します。Leptospira fainei serovar Hurstbridge株BUT6およびLeptospira biflexa serovar Patoc株Patoc IからAlejandro de la Peña Moctezuma博士へ。CIBACコーディネーターのホセ・アントニオ・オカンポ・セルバンテス博士と、後方支援をしてくれた職員に感謝します。EDTは、メトロポリタン自治大学キャンパスクアジマルパの学部生向けのターミナルプロジェクトプログラムの下にありました。図1、図3から図9の作成にソフトウェア Biorender.com を認めます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kitInvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit)PromegaM3001
Whatman filter paper, grade 1,MerkWHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 mRoche11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibodyRoche11093274910
Medium Base EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Enrichment EMJHDifcoBD 279510
Blocking ReagentRoche11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphateMerk11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigma AldrichD3159
Developer CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate)PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixer CarestreamCarestream Health IncGBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma Aldrich151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Terminal transferase, recombinantRoche3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1LIt can be Home-made following Supplementary File 6
PrimersSigma-AldrichOn demandFollow table 1
ProbesSigma-AldrichOn demandFollow table 1
Equipment
Nanodrop™ One SpectrophotometerThermo-ScientificND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpmSigma-Aldrich1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µlGilsonSKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved)AxygenMCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved)Axygen3208
Disposable Pipette tips 1-10 µlAxygenT-300
Disposable Pipette tips 1-200 µlAxygenTR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-DotBIORAD1706545
Portable Hergom SuctionHergom7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V)HoeferPH90-115V
UV CrosslinkerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express ThermocyclerHybaidHBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17Fuji

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