治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

要約

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo 骨オルガノイドを樹立し、損傷した造血系および免疫系の再建のための治療用造血幹細胞/前駆細胞を採取した。全体として、このアプローチは細胞治療のための有望な細胞源を提供することができます。

要約

造血幹細胞移植(HSCT)には、十分な数の治療用造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)が必要です。HSPCの適切な供給源を特定するために、マウスの大腿骨近くの内部筋肉ポーチに組換えヒト骨形態形成タンパク質-2(rhBMP-2)を充填したスキャフォールドを移植することにより、 in vivo 骨オルガノイドを開発しました。移植から12週間後、 in vivo オステオオルガノイドを回収し、HPSCのフローサイトメトリー解析を行ったところ、 in vivo オステオオルガノイド内にHSPCサブセットが有意に存在することが明らかになりました。

その後、放射線によるマウスの造血・免疫系損傷の亜致死モデルを確立し、抽出した骨オルガノイド由来の細胞を放射線を受けたマウスの末梢血に注入する造血幹細胞移植(HSCT)を行った。造血回復の効果は、血液学的、末梢血キメラ、および固形臓器キメラ解析を通じて評価されました。 その結果、 in vivo のオステオオルガノイド由来細胞は、放射線照射したマウスにおいて、損傷した末梢および固形の免疫器官を迅速かつ効率的に再構築できることが確認されました。このアプローチは、HSCTの代替供給源としての可能性を秘めており、より多くの患者に利益をもたらします。

概要

造血幹細胞移植は、さまざまな血液悪性腫瘍、および多数の遺伝性疾患および自己免疫疾患1,2,3,4に対する従来の治療法として立っています。それにもかかわらず、造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)の量と起源が限られていることが、造血幹細胞移植(HSCT^)の臨床実施に対する大きな障害として浮上しています^5,6。

大規模なin vitro細胞増殖は、治療用細胞を回収するために一般的に採用されている方法です^5,7。さまざまな研究により、HSPCがin vitroで自己再生するように刺激する条件が開発されており、通常は自己再生アゴニスト(サイトカインや成長因子など)と血清アルブミンの組み合わせを使用して、HSPCのex vivo拡大がもたら^{されています8。}しかし、現在の方法では、拡張されたHSPC^の自己更新能力を維持することにはまだ時間がかかり、困難であることに注意することが重要です9。

前述の方法とは対照的に、in vivoで細胞を採取することは、新しく革新的な戦略を提示します。このアプローチには、天然の骨髄構造を模倣したin vivoオステオオルガノイドの確立が含まれます^10,11。これを達成するために、骨形成タンパク質-2(BMP-2)をロードしたゼラチン足場を用いてin vivoオステオオルガノイドを作製し、HSPCを含む豊富で高品質な自家細胞カクテルを作製します。これらの骨オルガノイドを治療的に応用することで、照射損傷の治療に成功し、骨オルガノイドに由来するHSPCが実験的に障害された免疫系を迅速かつ安定的に再構成できることを実証しました。

プロトコル

8〜10週齢の雄と雌のC57BL / 6マウスが研究に含まれました。すべてのマウスは、華東科技大学の動物施設に収容されました。すべての実験手順は、華東科技大学の動物管理および使用委員会(ECUST-21010)によって承認されました。

1. 生理活性足場の作製

1. 準備
   1. 洗浄して乾燥させた手術用ハサミとピンセットを1,000mLのビーカーに入れます。ビーカーの口を吸収紙で包み、綿糸でしっかりと結びます。
   2. ビーカーを高圧滅菌器に入れ、蓋をしっかりと閉め、滅菌プログラムを121°Cに30分間設定し、滅菌プログラムを開始します。
   3. 滅菌プロセスが完了したら、滅菌したビーカーを取り出し、60°Cに設定された乾燥オーブンに移して乾燥させます。完全に乾いたら、ビーカーに75%(v / v)アルコールをスプレーし、クリーンベンチに置きます。
   4. rhBMP-2ストック溶液(1.0 mg / mL)を手順の2時間前に解凍します。.
   5. 室温まで解凍したら、rhBMP-2ストック溶液と未開封のゼラチンスポンジを滅菌クリーンベンチに移し、生理活性足場を作製します。
      1. ゼラチンスポンジ(60 mm x 20 mm x 5 mm)を滅菌ハサミで48個(5 mm x 5 mm x 5 mm)に切断し(図1B)、48ウェルプレートに移します。
      2. rhBMP-2原液は、気泡が出ないように注意しながら、ピペッティングで上下に緩やかに動かして均一に混合します。溶液30μLを吸引し、ゼラチンスポンジに滴下します。
      3. 48ウェルプレートを1層のパラフィルムでシールし、その後の凍結乾燥プロセスを容易にします。ゼラチンスポンジの入ったプレートをクリーンベンチから取り出します。-20°Cに置いて冷凍します。同時に、凍結乾燥機の電源を入れ、-50°Cから-60°Cの温度範囲に予冷します。
      4. 2時間凍結した後、ゼラチンスポンジを入れたウェルプレートを凍結乾燥機に12時間置きます。サンプルの乾燥性と無菌性を維持するために、凍結乾燥後にパラフィルムの層を追加してウェルプレートをシールします。-20°Cの冷蔵庫で保管してください。

2. 生理活性足場の外科的移植

注:すべての手術器具は滅菌されて使用されています。

1. 麻酔の1時間前にマウスを絶食します。マウスの目の周りに潤滑性の獣医軟膏を塗布して、目の領域の乾燥によって引き起こされる術後の不快感を軽減します。ペントバルビタールナトリウムの1%(w / v)溶液(48 mg / kgの用量)の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。.
   注: このプロトコルは、倫理的に承認された麻酔法とペントバルビタールナトリウム腹腔内注射を使用しています。イソフルラン吸入やケタミン-キシラジンの腹腔内注射などの他の方法も、承認後に使用できます。
2. 仰臥位マウスで次の兆候を探して、マウスの麻酔の深さを確認します:安定した心拍と呼吸、リラックスした筋肉、動かない手足、触覚に反応しないひげ、ペダル反射の欠如。また、マウスの皮膚を歯付き鉗子でつまんだり、マウスのつま先や足を刺激したりします。マウスが敏感な反応を示す場合、麻酔は軽すぎます。追加の麻酔を投与します。麻酔面が達成された後、マウスを右横臥位の手術領域に移して、生理活性足場を左脚に簡単に移植します。
3. シェービングマシンを使用して左足の毛を剃ります。クロルヘキシジンとアルコールを交互に3回ずつ繰り返して剃った部分を消毒し、外側広筋の外側にある後肢に切開を行います。眼科用ハサミを使用して、脛骨の方向に沿って伸びる長さ約3.0mmの切開を行います。
   注:手術中に無菌状態を維持するために、使用済みの手術用アイテムは指定された場所に保管する必要があります。滅菌用品は、オペレーター以外の人との接触を防ぐために、清潔な場所に置く必要があります。再利用可能な手術器具は、75%(v / v)エタノールで迅速に消毒する必要があります。.手術の期間を最小限に抑えて、傷口の空気への曝露を減らし、感染のリスクを減らします。
4. インプラント用のポケットを作成するには、外側広筋の遠位面、脛骨に向かって筋膜を開きます。
5. 眼科用鉗子を使用して、生体活性足場を高さ約5mm、直径5mmの円柱に成形します。眼科用ハサミでできた筋肉のスリットに沿って筋肉のポケットに足場を埋め込み、筋膜を通した縫合パターンを中断してインプラントポケットを閉じます。4-0縫合糸を使用して皮膚切開部を閉じます。
   注:外科的処置中に動物に痙攣や排尿が発生すると、麻酔が過度に深くなっていることが示され、緊急措置を迅速に実施する必要があります。
6. 手順2.3〜2.5を繰り返し、マウスの右大腿筋ポーチに別の生理活性足場を埋め込みます。手術後にマウスの手術部位と注射部位をヨウ素スワブで洗浄し、感染を防ぎます。
   注:各外側広筋に挿入できるインプラントは1つだけです。
7. 実験後にマウスが目覚めるまで、マウスを37°Cの恒温プラットフォームに置きます。血液が溜まるのを防ぐために、マウスを10〜15分ごとにひっくり返します。手術後は、保温性を保つだけでなく、術後のマウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置せずにモニタリングします。心拍数や呼吸数など、マウスの重要な指標に細心の注意を払ってください。
   注:マウスの前肢の震えは、回復期の開始を意味します。
8. マウスをアルコール噴霧と紫外線照射で消毒した滅菌ケージに戻します。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に置かないでください。さらに、メロキシカムを投与して術後の痛みを少なくとも 1 日間管理し、より集中的な痛みの管理のために最大 3 日間延長するオプションもあります。手術後72時間の間、動物と傷口を定期的にチェックして、潜在的な副作用を特定します。.感染が後で検出された場合は、最初にペントバルビタールナトリウムの1%(w / v)溶液(48 mg / kgの用量)の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけ、続いて麻酔後に子宮頸部脱臼を行うことにより、動物を安楽死させます。

3. 移植後12週間の in vivo オステオオルガノイドの特性評価

注:生理活性足場は、移植後に in vivo で発達し、骨オルガノイドを形成します。

1. in vivoオステオオルガノイドのコレクション
   1. in vivo オステオオルガノイドを 12 週間移植したら、ペントバルビタールナトリウムの 1% (w/v) 溶液 (48 mg/kg の用量) を腹腔内注射してマウスに麻酔をかけ、麻酔後に子宮頸部脱臼を行います。
      注:動物への害を最小限に抑えるために、マウスは頸部脱臼による安楽死の前に麻酔をかける必要があります。
   2. 解剖部位の皮膚に75%(v / v)アルコールをスプレーします。.
   3. 後肢を体幹から切り離し、ミニチュアハサミを使用して骨オルガノイドから筋肉を慎重に取り除きます。
   4. 付着した軟部組織をガーゼで取り除きます。
   5. 一部のオステオオルガノイドを4%(v/v)パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に室温で24時間固定し、組織学的分析を行います。残りのサンプルは、HPSCの巨視的写真撮影およびフローサイトメトリー分析に利用します。
2. 巨視的な画像
   1. オステオオルガノイドを青い背景プレートに置き、デジタルカメラで撮影します。
3. 組織学的解析
   1. 組織学的染色のための調製
      1. オステオオルガノイドをPFA溶液から超純水に移し、1時間浸します。
      2. 超純水を0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液に交換して、1週間脱灰します。
      3. 脱灰した組織を包埋カセットに入れ、カセットを超純水に1時間浸します。
      4. グラジエント脱水の場合は、包埋カセットをさまざまな濃度(v / v)のエタノールに75%、80%、90%、95%でそれぞれ1時間浸漬し、続いて100%(v / v)エタノールIおよびIIにそれぞれ1時間浸漬します。
         注:「100%(v / v)エタノールIおよびII」は、埋め込みカセットを100%(v / v)エタノールで満たされた「容器I」に一度浸し、次に100%(v / v)エタノールで満たされた「容器II」に再度浸す必要があることを示しています。
      5. 脱水後、100%(v/v)キシレンと無水エタノール(キシレン:エタノール体積比1:1)の混合物に1時間、100%(v/v)キシレンI.およびII.にそれぞれ30分間、包埋組織を順次置く。
      6. 組織をパラフィンIおよびIIに60°Cの一定温度でそれぞれ2時間浸します。
      7. ワックスに浸したティッシュペーパーを埋め込み機で埋め込むには、溶かしたワックスを埋め込み型に入れます。ワックスが固まる前に、脱水容器から組織を取り出し、埋め込み型に入れます。それに応じてラベルを付けます。金型を-20°Cの凍結状態で冷却し、ワックスが固まったら、ワックスブロックを埋め込み金型から取り外してトリミングします。
      8. 埋め込まれたワックスブロックをパラフィンスライサーで厚さ4.5μmにスライスし、スライドガラスに貼り付けます。
      9. 切片を40°Cで短時間焼き、サンプルボックスに集めて保管します。
   2. H&E染色
      1. 切片をサンプルラックに置き、乾燥オーブンで60°Cで30分間焼きます。
      2. キシレンとエタノールで切片を脱パラフィンします。パラフィン切片をキシレンIに10分間、キシレンIIを10分間、キシレンIIIを10分間、無水エタノールIを5分間、無水エタノールIIを5分間、90%(v / v)エタノールを5分間、80%(v / v)エタノールを5分間、70%(v / v)エタノールを5分間、50%(v / v)エタノールに5分間順次配置し、純水に移してグラジエント脱ロウプロセスを行います。
      3. 切片をヘマトキシリン染色溶液に2分間浸し、流水で10分間すすぎます。
      4. 切片をエオシン染色溶液に2分間浸漬します。
      5. 切片を75%(v / v)エタノールに2分間、85%(v / v)エタノールに2分間、無水エタノールに5分間、無水エタノールに5分間、キシレンに5分間ずつ順次配置します。
      6. キシレンから切片を取り出し、中性バルサムで密封します。
      7. 顕微鏡で切片を観察し、中性バルサムが乾燥した後、10倍の倍率で代表的な画像を撮影します。
4. HPSCのフローサイトメトリー解析
   1. ステップ3.1で得られた in vivo オステオオルガノイドを乳鉢に入れ、適量の染色緩衝液を添加します。オステオオルガノイドを眼科用ハサミで直径1〜3mmの断片に切断し、乳鉢と乳棒を使用して染色緩衝液で粉砕します。細胞生存率の低下を防ぐために、乳棒を使用して in vivo 骨オルガノイドの断片を粉砕するのではなく、垂直に押します。
   2. 細胞懸濁液を遠心チューブに集め、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   3. 上清を取り除き、赤血球溶解バッファー1mLを加えて細胞を3〜5分間溶解します。
   4. 細胞を1 mLの染色バッファーで洗浄し、300メッシュのナイロンフィルターで5 mLのフローサイトメトリーチューブにろ過します。
   5. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。フローサイトメトリーチューブの底部に残る約100 μL(細胞)を、生/死染色キット、ペリディニンクロロフィルタンパク質-シアニン5.5(PerCp-Cy5.5)-抗系統カクテル(1:10)、フィコエリトリン-シアニン5(PE-Cy5)-抗Cキット(1:200)、Alexa Fluor 700(AF700)-抗幹細胞抗原-1(Sca-1)(1:200)、ブリリアントバイオレット711(BV711)-抗CD16/32(1:200)、 バイオ抗CD34(1:200)、BV421-抗CD127(1:200)、PE-CF594-抗CD135(1:200)、BV510-抗CD48(1:200)、およびPE-Cy7-抗CD150(1:200)。
   6. Ca²⁺ およびMg²⁺ を含まない1 mLのHanks'Balanced Salt Solution(HBSS)で細胞を再懸濁し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   7. 上清を吸引し、PE-ストレプトアビジン二次抗体(1:200)で4°Cでさらに60分間染色します。
   8. 1 mLのHBSS(Ca2⁺なし、Mg²⁺)で細胞を再懸濁し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   9. 上清を吸引し、300 μLのHBSS(Ca²⁺、Mg²⁺なし)で細胞を再懸濁します。
   10. 溶液をボルテックスして、さらにフローサイトメトリー分析を行います。得られたデータをフローサイトメトリーソフトウェアを用いてさらに解析し、HSPCの定量データを取得します。
       注:フローサイトメトリーのデータ収集と分析は、^HSPC10を同定するために使用される典型的なゲーティング戦略について、以前の記事とサポート資料(補足図S1)を参照してください。
   11. フローサイトメーターでのデータ収集中に、側方散乱領域(SSC-A)と前方散乱領域(FSC-A)のドットプロットを確立し、SSC-AとFSC-Aのドットプロットで目的の細胞集団(P1)の周辺領域をゲートします。P1ゲートをダブルクリックします。X軸に前方散布図高さ(FSC-H)、Y軸に前方散布幅(FSC-W)を選択して、最初の細胞接着処理を行います。単一セルのゲートをダブルクリックします。X軸の側面散乱高さ(SSC-H)、Y軸の側面散乱幅(SSC-W)を選択して、2回目の細胞接着処理を行います。長方形のゲート ツールを使用して、1 つのセルを選択します。
   12. 死んだ細胞を除外します。生存率マーカーを検出することにより、生細胞と死細胞を区別します。SSC-A vs Live/Dead のドット プロットを作成し、生細胞に対応する領域をゲートし、それを "live cells" と名付けます。
   13. 特異的抗体で標識された細胞を「生細胞」でスクリーニングします。骨髄性造血幹/前駆細胞系統における系統特異的抗体の陽性発現によって影響を受ける可能性のある細胞集団を、系統陰性(lin^-)ゲーティングを使用して除外します。^リンセル をゲートします。
   14. lin^-細胞内の細胞の異なる亜集団をスクリーニングします。lin^-セルゲートをダブルクリックします。X軸はSca-1-AF700を、Y軸はc-kit-PE-Cy5を選択します。c-kit⁺Sca-1^-細胞をLKS^-細胞、c-kit⁺Sca-1⁺細胞をLKS⁺細胞、c-kitとSca-1の発現が低い細胞をLK^loS^lo細胞としてゲートします。LKS^-ゲートをダブルクリックし、X軸にCD34-PE、Y軸にFCγR-BV711を選択します。LKS⁺ゲートをダブルクリックします。X軸はFIt3-PE-CF594、Y軸はIL7Rα-BV421、X軸はCD150-PE-Cy7、Y軸はCD48-BV510を選択します。
   15. 造血幹細胞(^Lin-c-kit+Sca-1⁺CD48-CD150⁺)と分化した造血前駆細胞(Lin-c-kit⁺Sca-1+CD48-CD150^-)、一般的なリンパ系前駆細胞(^{Lin-c-kit-Sca-1-Flt3+}IL7Rα⁺)など、細胞亜集団を区別するためのポジティブゲートまたはネガティブゲートを同定します。)、一般的な骨髄系前駆細胞(^Lin-c-kit+Sca-1-CD34⁺FCγR^-)、顆粒球-単球前駆細胞(^Lin-c-kit+Sca-1-CD34⁺FCγR⁺)、および巨核球赤血球前駆細胞(^Lin-c-kit+Sca-1-CD34-FCγR^-)である。

4. マウス照射モデル

(注)C57BL/6マウスにX線照射器を用いてX線を照射しました。

1. 造血系/免疫系の亜致死的障害を達成するために、5 Gray (Gy) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 治療群、5 Gy 天然骨髄 (BM) 治療群、および 5 Gy 骨オルガノイド治療群の野生型 (WT) マウスを移植の 24 時間前に 5 Gy 照射 (1.25 Gy/分) に曝露します。
   注:0 GyのPBS処理群のWTマウスがPBSで治療され、照射を受けていないことを確認してください。

5. 細胞治療プロセス

注:すべての手順は無菌状態で行う必要があります。

1. in vivoオステオオルガノイド由来および天然骨髄由来細胞の獲得
   1. C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(CD45.1)マウスのマッスルポーチに2つの生理活性足場を移植し、12週間インキュベートして in vivo オステオオルガノイドを作製します。上記の1匹のCD45.1マウスから2つの in vivo オステオオルガノイドと2つの大腿骨を採取します。その後、鉗子とガーゼを使用して、骨オルガノイドと大腿骨の表面の軟組織を透明にします。
   2. 骨オルガノイドと大腿骨を別々に乳鉢に入れ、HBSS(Ca²⁺なし、Mg²⁺)1mLを加えます。
      注:Ca²⁺ およびMg²⁺ を含まないHBSSは、細胞凝集を減少させる可能性があります。移植に使用する溶液は、潜在的な拒絶反応を避けるために、血清成分を含んではなりません。
   3. サンプルを外科用ハサミで切り取り、乳鉢と乳棒で優しく粉砕します。
   4. 細胞懸濁液を40 μmの細胞ストレーナでろ過し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   5. 上清を取り除き、細胞ペレットを300 μLのHBSS(Ca²⁺なし、Mg²⁺)で再懸濁します。十分に混合して、骨オルガノイド由来細胞または全骨髄細胞の懸濁液を得ます。
      注:in vivo骨オルガノイドに由来する細胞カクテルを十分に活用するために、全骨髄細胞を治療に使用することを選択しました。30 μgのBMP-2誘導in vivoオステオオルガノイドにおける総細胞の典型的な数は、30,000,000-40,000,000です。
2. 眼窩静脈洞注射
   注:in vivoの骨オルガノイドまたは大腿骨から採取したCD45.1⁺全骨髄細胞を眼窩静脈洞を通じて、それぞれ亜致死的に照射したC57BL/6(CD45.2)レシピエントに注入しました。眼窩静脈洞注射と尾静脈注射は、動物実験で一般的に使用される方法です。眼窩静脈洞注射は、そのシンプルさと初心者の失敗率の低さから選ばれました。眼窩注射の過程では、マウスに麻酔をかける、低体温症のリスクを減らすために加熱プレートを使用する、マウスを機械的に拘束して動きを防ぐなど、特定の保護対策を講じる必要があります。
   1. CD45.2マウスを麻酔前チャンバーに入れ、イソフルランを使用して麻酔を誘発します。マウスの目の周りに潤滑性の獣医軟膏を塗布して、乾燥を防ぎ、イソフルランによって引き起こされる眼の刺激を打ち消します。.
      注:動物への害を最小限に抑えるために、眼窩静脈洞注射の前にイソフルラン麻酔をマウスに投与します。
   2. マウスを麻酔台に移し、さらに麻酔をかけます。
   3. マウスの低体温症の可能性を減らすには、照射して麻酔をかけたマウスを37°Cに設定されたサーモスタット加熱パッドの上に置きます。
   4. 完全に麻酔をかけた後、マウスを頭を右に向けてマウスを左側横臥位に置きます。
   5. 目を突き出すには、頭のてっぺんと顎のラインに沿って指を置きます。皮膚をやさしく引っ張って下に下げます。
   6. 25 G針を取り付けた1 mLシリンジを使用して、ステップ5.1.5で得られたCD45.1⁺マウスのin vivo骨オルガノイド由来細胞懸濁液または天然骨髄由来細胞懸濁液200 μLを吸引します。
   7. 針を慎重に導入し、約30°の角度で内側眼鏡に面取りします。
      注:注射は通常、針の斜角を上にして行われますが、眼窩後注射の場合は、目の損傷のリスクを減らすために針の斜角を下に配置することをお勧めします。
   8. 針の先端が目の付け根に来るまで、針を使用して眼球の端をたどります。
   9. 注入液をゆっくりと滑らかに注入します。
   10. 注入が完了したら、マウスをケージに戻して回復させます。

6. 治療効果の評価

1. 血液学的分析
   注:免疫系再構成アッセイにおけるレシピエントの血液学を分析するために、0 Gy PBS治療、5 GyPBS治療、5 GyネイティブBM治療、および5 Gyオステオオルガノイド治療のさまざまな治療を受けたレシピエントから末梢血サンプルを収集しました。血液サンプルは、移植の 2 日前と移植の 2、4、8、12、および 16 週間後に眼窩後穿刺によって取得されました。同じグループの血液サンプルの一部を血液学的分析に使用し、他の部分をキメラ分析に使用しました。顎下静脈や尾静脈など、さまざまな採血方法があります。眼窩後穿刺は、マウスの採血の一般的な方法の1つであり、倫理的条件下で許可されています。
   1. 手順5.2.1〜5.2.5を繰り返してマウスに麻酔をかけ、マウスの目を突き出します。
      注:動物への害を軽減するために、眼窩後穿刺採血の前にイソフルラン麻酔をマウスに投与します。
   2. 直径0.5mmの毛細血管を眼の内側眼角に配置し、鼻の平面に対して30°〜45°の角度で尾側に向けます。
   3. 圧力をかけながら毛細管を静かに回転させ、結膜を貫通させます。毛細血管の作用により、血液が毛細血管に流れ込むようにします。
   4. 血液が流れ始めた後、流れを維持するために継続的な圧力をかけます。
   5. 100μLの血液を採取した後、すぐに首の圧力を解放します。同時に、毛細血管チューブを取り外して目を正常な位置に戻すと、穿刺部位からの術後出血を防ぎます。
   6. 1.5%(w / v)エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩二水和物(EDTA-K2)溶液で洗浄し、1.5%(w / v)EDTA-K2溶液を10μL添加した遠心分離チューブに血液を速やかに排出します。.遠心分離管を静かに振って、EDTA-K2溶液と血液が完全に混合されるようにし、凝固を防ぎます。
   7. 傷口を滅菌綿で拭き、わずかな圧力で止血した後、止血後1〜2分間マウスを観察して異常がないことを確認した後、マウスをケージに戻します。
   8. 血液分析装置を使用して、白血球(WBC)、赤血球(RBC)、血小板(PLT)の数など、各グループの血液サンプルの一部で血液学的分析を行います。
      注:収集から2時間以内にすべての血液サンプルを分析します。
2. 末梢血キメラ現象の解析
   注:血液学的分析と同様に、移植後2、4、8、12、および16週間で、5GyのネイティブBM治療グループおよび5Gyオステオオルガノイド治療グループからの末梢血サンプルを眼窩後穿刺によって収集しました。
   1. ステップ6.1で得られた末梢血サンプルの他の部分を使用して、末梢血キメラ現象の分析を行います。
   2. 1 mLの赤血球溶解バッファーをサンプルに加え、3〜5分間溶解します。サンプルを静かに逆さまにして、赤血球の溶解を促進します。
   3. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   4. 上清を捨て、1 mLのHBSS(^Ca2+なし、Mg²⁺)を加えてペレットを再懸濁します。
   5. 300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。生/死染色キット、PE-抗CD45.1(1:200)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-抗CD45.2(1:200)、PE-Cy7-anti-B220(1:200)、AF700-anti-CD11b(1:200)、PerCp-Cy5.5-anti-CD8a(1:200)、PE-Dazzle594-anti-CD4(1:200)、およびアロフィコシアニン(APC)-anti-CD3e(1:200)などの抗体を使用して、遠心分離管の底にある残りの約100μLの細胞を4°Cで30分間染色します。
   6. 1 mLのHBSS(Ca2⁺なし、Mg²⁺)で細胞を再懸濁し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   7. 上清を吸引し、300 μLのHBSS(Ca²⁺、Mg²⁺なし)で細胞を再懸濁します。
   8. 懸濁液をボルテックスして、さらにフローサイトメトリー解析を行います。
   9. 得られたデータをフローサイトメトリーソフトウェアを用いてさらに解析し、5 GyネイティブBM治療群と5Gyオステオオルガノイド治療群の両方において、レシピエントマウスの末梢血中のHSPCのキメラ率に関する情報を得る。
      注:フローサイトメトリーデータの解析については、CD45.2レシピエントの末梢血中のドナー由来CD45.1⁺細胞を同定するために使用される典型的なゲーティング戦略について、補足図S2を参照してください。
   10. 手順3.4.11〜3.4.12を繰り返して、生細胞に対応する領域をゲートします。
   11. 最初に細胞集団を同定し、その後ドナー細胞とレシピエント細胞を識別することにより、末梢血キメラ現象を分析します。
       1. 生細胞内の特異的な抗体標識細胞をスクリーニングします。X軸はC D11b-AF700を、Y軸はB220-PE-Cy7を選択します。B220⁺CD11b^-細胞をB細胞として、B220-CD11b⁺細胞を骨髄細胞として、B220-CD11b^-細胞をダブルネガティブ(DN)細胞としてゲートします。
       2. X軸にCD3-APC、Y軸にSSC-Aを使用して、DN細胞ゲートをダブルクリックします。CD3⁺細胞をT細胞としてゲートします。
       3. CD3⁺細胞ゲートをダブルクリックし、X軸にCD4-PE-Dazzle594を、Y軸にCD8-PerCp-Cy5.5を選択します。CD8⁺CD4^-細胞を細胞傷害性T細胞(CTL)として、^CD8-CD4+細胞を制御性T細胞(Treg)としてゲートします。
   12. 最後に、末梢血キメラ解析がドナー細胞とレシピエント細胞に対して行われます。指定した細胞集団内で、ダブルクリックしてX軸にCD45.1-PEを、Y軸にCD45.2-FITCを選択します。CD45.1⁺細胞をゲートし、細胞計数を行い、細胞集団内のCD45.1⁺細胞の割合を決定し、キメラ率を反映します。
3. 固体臓器キメラ現象の解析
   注:移植後16週間で、BM、脾臓、および胸腺キメラを5 GyのBM治療群と5 Gyの骨オルガノイド治療群で分析しました。
   1. 手順5.1.1〜5.1.4を繰り返して、BMに由来する細胞ペレットを取得します。
   2. 1 mLのHBSS(Ca²⁺、Mg²⁺なし)を入れた細胞培養皿(6 cm)の上に300メッシュのナイロンフィルターを置きます。
   3. 解剖した脾臓または胸腺をナイロンフィルターの上に置きます。
   4. 5 mLシリンジのフロントラバーストッパーを使用して、明らかな組織構造が残らなくなり、繊維組織のみが残るまで、前述の臓器を粉砕します。.細胞の生存率を確保するために、細胞を優しく取り扱ってください。
   5. 濾液を回収し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
   6. 上清を取り除き、脾臓または胸腺に由来する細胞沈殿物を取得します。
   7. ステップ6.3.1および6.3.6で得られた細胞ペレットに1 mLの赤血球溶解バッファーを加え、3〜5分間溶解します。
   8. 手順6.2.3〜6.2.8を繰り返して、染色およびフローサイトメトリー解析を行います。
   9. 得られたデータをフローサイトメトリーソフトウェアを用いてさらに解析し、5 GyネイティブBM治療群および5Gyオステオオルガノイド治療群の両方において、レシピエントマウスの固形器官(BM、脾臓、胸腺)におけるHSPCのキメリズム速度に関する情報を得る。
      注:フローサイトメトリーデータの解析については、CD45.2レシピエントのBM、脾臓、および胸腺におけるドナー由来CD45.1⁺細胞を同定するために使用される典型的なゲーティング戦略については、補足図S2を参照のこと。
   10. ステップ 6.2.10-6.2.12 の末梢血を BM、脾臓、胸腺と交換して、固形臓器のキメラ率を求めます。

結果

プロトコルに従って、無菌条件下でBMP-2を分解性ゼラチンスポンジに滴下することにより、生物活性足場を作成しました。次に、足場をマウスの下肢の筋肉に移植して、 in vivo の骨オルガノイドを確立しました。12週間のインキュベーション期間の後、オステオオルガノイドの肉眼写真撮影、組織学的解析、およびフローサイトメトリー解析を実施しました(

ディスカッション

このプロトコールでは、BMP-2をロードしたゼラチンスポンジ足場を埋め込むことにより、骨髄様構造を持つ in vivo 骨オルガノイドを確立するアプローチを提示します。これらの in vivo オステオオルガノイドは、長期間(12週間以上)にわたって治療用HSPCを安定して産生できることを実証しています。既存の in vitro 拡張または細胞をロードする in vi...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.