Approccio osteo-organoide in vivo per la raccolta di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche

Riepilogo

Qui, abbiamo stabilito osteo-organoidi in vivo innescati da scaffold di gelatina caricati con proteina morfogenetica ossea 2 per raccogliere cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche per la ricostruzione di un sistema ematopoietico e immunitario danneggiato. Nel complesso, questo approccio può fornire una promettente fonte cellulare per le terapie cellulari.

Abstract

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) richiede un numero sufficiente di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche (HSPC). Per identificare una fonte adeguata di HSPC, abbiamo sviluppato un osteo-organoide in vivo impiantando scaffold caricati con proteina morfogenetica-2 ossea umana ricombinante (rhBMP-2) in una sacca muscolare interna vicino al femore nei topi. Dopo 12 settimane dall'impianto, abbiamo recuperato gli osteo-organoidi in vivo e condotto analisi di citometria a flusso su HPSC, rivelando una presenza significativa di sottogruppi di HSPC all'interno degli osteo-organoidi in vivo .

Abbiamo quindi stabilito un modello subletale di danno del sistema ematopoietico/immunitario nei topi attraverso le radiazioni e abbiamo eseguito il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) iniettando le cellule derivate da osteo-organoidi estratte nel sangue periferico di topi irradiati. L'effetto del recupero ematopoietico è stato valutato attraverso analisi ematologiche, chimerismo del sangue periferico e chimerismo degli organi solidi. I risultati hanno confermato che le cellule derivate da osteo-organoidi in vivo possono ricostruire in modo rapido ed efficiente organi immunitari periferici e solidi danneggiati nei topi irradiati. Questo approccio ha il potenziale come fonte alternativa di HSPC per HSCT, offrendo benefici a un numero maggiore di pazienti.

Introduzione

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche rappresenta la terapia convenzionale per una varietà di neoplasie ematologiche, nonché per numerose malattie ereditarie e autoimmuni 1,2,3,4. Tuttavia, la quantità limitata e l'origine delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPC) sono emerse come un ostacolo sostanziale all'implementazione clinica del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)^5,6.

L'espansione cellulare in vitro su larga scala è un metodo comunemente impiegato per la raccolta di cellule terapeutiche ^5,7. Vari studi hanno sviluppato condizioni che stimolano le HSPC ad autorinnovarsi in vitro, tipicamente attraverso l'uso di una combinazione di agonisti dell'autorinnovamento (come citochine e fattori di crescita) e albumina sierica, con conseguente espansione ex vivo delle HSPC⁸. Tuttavia, è importante notare che i metodi attuali richiedono ancora molto tempo e sono difficili da mantenere la capacità di auto-rinnovo degli HSPC espansi⁹.

A differenza del metodo sopra menzionato, la raccolta di cellule in vivo presenta una strategia nuova e innovativa. Questo approccio prevede la creazione di un osteo-organoide in vivo che imita la struttura nativa del midollo osseo^10,11. Per raggiungere questo obiettivo, formiamo osteo-organoidi in vivo utilizzando scaffold di gelatina caricati con proteina morfogenetica ossea-2 (BMP-2) per ottenere cocktail di cellule autologhe abbondanti e di alta qualità, comprese le HSPC. Applicando terapeuticamente questi osteo-organoidi, abbiamo trattato con successo il danno da irradiazione e dimostrato che le HSPC derivate dagli osteo-organoidi possono ricostituire rapidamente e stabilmente il sistema immunitario sperimentalmente compromesso.

Protocollo

Nello studio sono stati inclusi topi C57BL/6 maschi e femmine, di età compresa tra 8 e 10 settimane. Tutti i topi sono stati ospitati nella struttura per animali dell'Università di Scienza e Tecnologia della Cina orientale. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Scienza e Tecnologia della Cina Orientale (ECUST-21010).

1. Fabbricazione di scaffold bioattivi

1. Preparazione
   1. Metti le forbici e le pinzette chirurgiche pulite e asciugate in un becher da 1.000 ml. Avvolgere l'imboccatura del bicchiere con carta assorbente e legarla strettamente con filo di cotone.
   2. Posizionare il becher nello sterilizzatore ad alta pressione, chiudere bene il coperchio, impostare il programma di sterilizzazione a 121 °C per 30 minuti e avviare il programma di sterilizzazione.
   3. Al termine del processo di sterilizzazione, rimuovere e trasferire il becher sterilizzato in una stufa di essiccazione impostata a 60 °C per l'essiccazione. Una volta completamente asciutto, spruzzare il becher con alcol al 75% (v/v) e posizionarlo sul banco pulito.
   4. Scongelare la soluzione madre di rhBMP-2 (1,0 mg/mL) 2 ore prima della procedura.
   5. Una volta scongelata a temperatura ambiente, trasferire la soluzione madre rhBMP-2 e la spugna di gelatina non aperta sul banco sterile pulito per la fabbricazione di scaffold bioattivi.
      1. Tagliare la spugna di gelatina (60 mm x 20 mm x 5 mm) in 48 pezzi di dimensioni uniformi (5 mm x 5 mm x 5 mm) (Figura 1B) con le forbici sterilizzate e trasferirli in una piastra a 48 pozzetti.
      2. Miscelare la soluzione madre rhBMP-2 pipettando delicatamente su e giù per garantire una miscelazione uniforme, facendo attenzione a evitare bolle. Aspirare 30 μl della soluzione e aggiungerla goccia a goccia alla spugna di gelatina.
      3. Sigillare la piastra a 48 pozzetti utilizzando uno strato di parafilm per facilitare il successivo processo di liofilizzazione. Estrarre il piatto contenente la spugna di gelatina dal banco pulito. Metterlo a -20 °C per essere congelato. Contemporaneamente, accendere il liofilizzatore e preraffreddarlo a un intervallo di temperatura compreso tra -50 °C e -60 °C.
      4. Dopo il congelamento per 2 ore, posizionare la piastra a pozzetti con le spugne di gelatina nel liofilizzatore per 12 ore. Per mantenere la secchezza e la sterilità dei campioni, applicare uno strato aggiuntivo di parafilm per sigillare la piastra a pozzetti dopo la liofilizzazione. Conservalo in frigorifero a -20 °C.

2. Impianto chirurgico di scaffold bioattivi

NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati per l'uso.

1. Digiunare i topi per 1 ora prima dell'anestesia. Applicare un unguento veterinario lubrificante intorno agli occhi dei topi per ridurre il disagio postoperatorio causato dalla secchezza nella zona degli occhi. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione all'1% (p/v) di pentobarbital sodico (alla dose di 48 mg/kg).
   NOTA: Questo protocollo utilizza il metodo di anestesia eticamente approvato con iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio. Altri metodi, come l'inalazione di isoflurano o l'iniezione intraperitoneale di ketamina-xilazina, possono essere utilizzati anche dopo l'approvazione.
2. Confermare la profondità dell'anestesia nei topi cercando i seguenti segni in un topo supino: battito cardiaco e respirazione costanti, muscoli rilassati, arti immobili, baffi che non rispondono al tatto e assenza di un riflesso del pedale. Inoltre, pizzica la pelle dei topi con una pinza dentata o stimola le dita dei piedi o le zampe dei topi. Se i topi mostrano reazioni sensibili, l'anestesia è troppo leggera; somministrare ulteriore anestesia. Dopo aver raggiunto il piano anestetico, trasferire i topi nell'area chirurgica in posizione sdraiata laterale destra per impiantare facilmente l'impalcatura bioattiva nella gamba sinistra.
3. Radere i peli della gamba sinistra utilizzando una macchina da barba. Disinfettare l'area rasata alternando cicli alternati di clorexidina e alcol 3 volte ciascuno e creare incisioni sulla zampa posteriore, situata sul lato laterale del muscolo vasto laterale. Utilizzare le forbici oftalmiche per praticare incisioni lunghe circa 3,0 mm, che si estendono lungo la direzione della tibia.
   NOTA: Per mantenere le condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico, gli articoli chirurgici usati devono essere conservati in luoghi designati. Le forniture sterili devono essere collocate in un'area pulita per evitare il contatto con persone diverse dall'operatore. Gli strumenti chirurgici riutilizzabili devono essere prontamente disinfettati con etanolo al 75% (v/v). Ridurre al minimo la durata dell'intervento chirurgico per ridurre l'esposizione delle ferite all'aria e diminuire il rischio di infezione.
4. Per creare la tasca per l'impianto, aprire la fascia sulla faccia distale del muscolo vasto laterale, verso la tibia.
5. Utilizzare una pinza oftalmica per modellare l'impalcatura bioattiva in un cilindro, di circa 5 mm di altezza e 5 mm di diametro. Impiantare l'impalcatura nella tasca muscolare lungo la fessura muscolare creata dalle forbici oftalmiche e chiudere la tasca dell'impianto con un modello di sutura interrotto attraverso la fascia. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando una sutura 4-0.
   NOTA: Il verificarsi di convulsioni o minzione negli animali durante la procedura chirurgica indica un'anestesia eccessivamente profonda, che richiede una pronta attuazione di misure di emergenza.
6. Ripetere i passaggi 2.3-2.5 e impiantare un'altra impalcatura bioattiva nella tasca del muscolo femorale destro dei topi. Utilizzare tamponi di iodio per pulire i siti chirurgici e di iniezione dei topi dopo l'intervento chirurgico per prevenire l'infezione.
   NOTA: È possibile inserire un solo impianto in ciascun muscolo vasto laterale.
7. Posizionare i topi su una piattaforma a temperatura costante a 37 °C fino a quando non si svegliano dopo l'esperimento. Capovolgi i topi ogni 10-15 minuti per evitare ristagni di sangue. Dopo l'intervento chirurgico, oltre a mantenere il calore, monitorare i topi postoperatori senza lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Presta molta attenzione agli indicatori importanti dei topi, come la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria.
   NOTA: Il tremore degli arti anteriori nei topi indica l'inizio della fase di recupero.
8. Rimetti i topi in una gabbia sterile che è stata disinfettata con spray alcolico e irradiazione ultravioletta. Non collocare l'animale che ha subito un intervento chirurgico con altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. Inoltre, somministrare meloxicam per gestire il dolore postoperatorio per almeno un giorno, con la possibilità di estendere fino a tre giorni per una gestione più intensiva del dolore. Controllare regolarmente l'animale e la ferita durante il periodo post-operatorio di 72 ore per identificare eventuali effetti avversi. Se l'infezione viene rilevata in un secondo momento, sopprimere gli animali anestetizzando prima i topi tramite iniezione intraperitoneale di una soluzione all'1% (p/v) di pentobarbital sodico (alla dose di 48 mg/kg), seguita da lussazione cervicale dopo l'anestesia.

3. Caratterizzazione di osteo-organoidi in vivo 12 settimane dopo l'impianto

NOTA: Gli scaffold bioattivi si svilupperanno in vivo per formare osteo-organoidi dopo l'impianto.

1. Raccolta di osteo-organoidi in vivo
   1. Quando gli osteo-organoidi in vivo sono stati impiantati per 12 settimane, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione all'1% (p/v) di pentobarbital sodico (alla dose di 48 mg/kg), seguita da lussazione cervicale dopo l'anestesia.
      NOTA: Per ridurre al minimo i danni agli animali, i topi devono essere anestetizzati prima dell'eutanasia mediante lussazione cervicale.
   2. Spruzzare alcol al 75% (v/v) sulla pelle nel sito di dissezione.
   3. Scollegare l'arto posteriore dal tronco e rimuovere il muscolo dagli osteoorganoidi utilizzando con cura delle forbici in miniatura.
   4. Rimuovere i fazzoletti molli attaccati con una garza.
   5. Fissare alcuni osteo-organoidi in una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% (v/v) per 24 ore a temperatura ambiente per l'analisi istologica. Utilizzare i campioni rimanenti per la fotografia macroscopica e l'analisi con citometria a flusso di HPSC.
2. Immagini macroscopiche
   1. Posiziona gli osteo-organoidi su una piastra di sfondo blu e fotografali con una fotocamera digitale.
3. Analisi istologica
   1. Preparazione per la colorazione istologica
      1. Trasferire gli osteoorganoidi dalla soluzione di PFA in acqua ultrapura e immergere per 1 ora.
      2. Sostituire l'acqua ultrapura con una soluzione di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) 0,5 M per la decalcificazione per 1 settimana.
      3. Mettere i tessuti decalcificati in una cassetta di inclusione e immergere la cassetta in acqua ultrapura per 1 ora.
      4. Per la disidratazione del gradiente, immergere la cassetta di inclusione in etanolo a concentrazioni variabili (v/v): 75%, 80%, 90% e 95% per una durata di 1 ora ciascuna, seguita dall'immersione in etanolo al 100% (v/v) I e II per 1 ora ciascuno.
         NOTA: "Etanolo 100% (v/v) I e II" indica che la cassetta di inclusione deve essere immersa una volta nel "contenitore I" riempito con etanolo al 100% (v/v) e poi immersa una seconda volta nel "contenitore II" riempito con etanolo al 100% (v/v).
      5. Dopo la disidratazione, posizionare i tessuti incorporati in sequenza in una miscela di xilene al 100% (v/v) ed etanolo assoluto (xilene: rapporto volume di etanolo di 1:1) per 1 ora e xilene I e II al 100% (v/v) per 30 minuti ciascuno.
      6. Immergere i tessuti in paraffina I e II a temperatura costante di 60 °C per 2 ore ciascuno.
      7. Per incorporare i fazzoletti imbevuti di cera utilizzando una macchina per l'inclusione, posizionare la cera fusa nello stampo per l'inclusione. Prima che la cera si solidifichi, rimuovere i fazzoletti dal contenitore di disidratazione e metterli nello stampo di inclusione; etichettarli di conseguenza. Raffreddare lo stampo a -20 °C in condizioni di congelamento e, dopo che la cera si è solidificata, rimuovere il blocco di cera dallo stampo da incasso e tagliarlo.
      8. Tagliare i blocchi di cera incorporati in sezioni spesse 4,5 μm utilizzando un'affettatrice a paraffina e quindi fissare le sezioni ai vetrini.
      9. Cuocere brevemente le sezioni a 40 °C, quindi raccoglierle e conservarle in una scatola per campioni.
   2. Colorazione H&E
      1. Mettere le sezioni in una griglia per campioni e cuocere in forno di essiccazione a 60 °C per 30 minuti.
      2. Deparaffinare le sezioni in xilene ed etanolo. Posizionare in sequenza le sezioni di paraffina nello xilene I per 10 minuti, nello xilene II per 10 minuti, nello xilene III per 10 minuti, nell'etanolo assoluto I per 5 minuti, nell'etanolo assoluto II per 5 minuti, nell'etanolo al 90% (v/v) per 5 minuti, nell'etanolo all'80% (v/v) per 5 minuti, nell'etanolo al 70% (v/v) per 5 minuti, nell'etanolo al 50% (v/v) per 5 minuti e trasferirle in acqua pura per un processo di deceratura a gradiente.
      3. Immergere le sezioni nella soluzione colorante di ematossilina per 2 minuti, quindi sciacquarle in acqua corrente per 10 minuti.
      4. Immergere le sezioni in una soluzione colorante di eosina per 2 minuti.
      5. Posizionare in sequenza le sezioni in etanolo al 75% (v/v) per 2 minuti, etanolo all'85% (v/v) per 2 minuti, etanolo assoluto per 5 minuti, etanolo assoluto per 5 minuti e xilene per 5 minuti per la disidratazione.
      6. Togliete le sezioni dallo xilene e sigillatele con balsamo neutro.
      7. Osservare le sezioni al microscopio e catturare immagini rappresentative con un ingrandimento di 10x dopo che il balsamo neutro si è asciugato.
4. Analisi di citometria a flusso per HPSC
   1. Porre gli osteoorganoidi in vivo ottenuti dalla fase 3.1 in un mortaio e aggiungere una quantità appropriata di tampone colorante. Tagliare gli osteoorganoidi in frammenti del diametro di 1-3 mm con le forbici oftalmiche e schiacciarli nel tampone di colorazione con il mortaio e il pestello. Premere verticalmente piuttosto che macinare i frammenti degli osteo-organoidi in vivo usando un pestello per prevenire un declino del tasso di sopravvivenza cellulare.
   2. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugarla a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   3. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi per lisare le cellule per 3-5 minuti.
   4. Lavare le cellule con 1 mL di tampone colorante e filtrarle attraverso un filtro di nylon da 300 mesh in una provetta per citometria a flusso da 5 mL.
   5. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Colorare i restanti circa 100 μL (cellule) sul fondo della provetta per citometria a flusso a 4 °C per 30 minuti utilizzando anticorpi, tra cui un kit di colorazione vivo/morto, Peridina clorofilla protein-Cianina5.5 (PerCp-Cy5.5)-anti-lignaggio cocktail (1:10), Ficoeritrin-Cianine5 (PE-Cy5)-anti-c-kit (1:200), Alexa Fluor 700 (AF700) - anti-cellule staminali antigene-1 (Sca-1) (1:200), Brilliant Violet 711 (BV711) -anti-CD16/32 (1:200), bio-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200) e PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. Risospendere le cellule con 1 mL di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) senza Ca²⁺ e Mg²⁺ e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   7. Aspirare il surnatante e colorare con l'anticorpo secondario PE-streptavidina (1:200) per altri 60 minuti a 4 °C.
   8. Risospendere le cellule con 1 mL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺) e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   9. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 300 μL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. Agitare la soluzione per eseguire ulteriori analisi di citometria a flusso. Analizza ulteriormente i dati ottenuti utilizzando il software di citometria a flusso per ottenere dati quantitativi sulle HSPC.
       NOTA: La raccolta e l'analisi dei dati della citometria a flusso fanno riferimento ai nostri precedenti articoli e materiali di supporto (Figura supplementare S1) per le tipiche strategie di gating utilizzate per identificare le HSPC¹⁰.
   11. Stabilire un dot plot tra area di dispersione laterale (SSC-A) e area di dispersione diretta (FSC-A) e trasferire la regione circostante della popolazione cellulare di interesse (P1) nel dot plot SSC-A vs FSC-A durante l'acquisizione dei dati su un citometro a flusso. Fare doppio clic sul cancello P1; selezionare l'altezza di dispersione in avanti (FSC-H) per l'asse X e l'ampiezza di dispersione in avanti (FSC-W) per l'asse Y per eseguire il primo trattamento di adesione delle celle. Fare doppio clic sulla porta a cella singola; selezionare l'altezza di dispersione laterale (SSC-H) per l'asse X e la larghezza di dispersione laterale (SSC-W) per l'asse Y per eseguire il trattamento di adesione della seconda cella. Utilizzare lo strumento di iniezione rettangolare per selezionare le singole celle.
   12. Escludi le celle morte. Distinguere le cellule vive da quelle morte rilevando i marcatori di vitalità. Stabilisci un dot plot di SSC-A vs Live/Dead e gate la regione corrispondente alle cellule vive, chiamandola "cellule vive".
   13. Screening delle cellule marcate con anticorpi specifici in "cellule vive". Escludere la popolazione cellulare che può essere influenzata dall'espressione positiva di anticorpi specifici per il lignaggio mieloide ematopoietico staminale/progenitore utilizzando il gating del lignaggio negativo (lin^-). Cancello delle cellule lin^- .
   14. Screening per diverse sottopopolazioni di cellule all'interno delle ^lin-cells. Fare doppio clic sulla porta delle celle lineari; selezionare Sca-1-AF700 per l'asse X e c-kit-PE-Cy5 per l'asse Y. Gate le cellule c-kit⁺Sca-1^- come cellule LKS-, le cellule c-kit⁺Sca-1⁺ come cellule LKS⁺ e le cellule con bassa espressione di c-kit e Sca-1 come cellule LK^loS^lo. Fare doppio clic sulla porta LKS e selezionare CD34-PE per l'asse X e FCγR-BV711 per l'asse Y. Fare doppio clic sul cancello LKS⁺; selezionare FIt3-PE-CF594 per l'asse X e IL7Rα-BV421 per l'asse Y e selezionare CD150-PE-Cy7 per l'asse X e CD48-BV510 per l'asse Y.
   15. Sulla base della specificità degli anticorpi, identificare le porte positive o negative per distinguere le sottopopolazioni cellulari: cellule staminali ematopoietiche (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺) e progenitori ematopoietici differenziati: progenitori multipotenti (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻), progenitori linfoidi comuni (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺), progenitori mieloidi comuni (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), progenitori granulociti-monociti (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) e progenitori eritroidi megacariociti (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. Modello di irradiazione murina

NOTA: I topi C57BL/6 sono stati irradiati con raggi X utilizzando un irradiatore di raggi X.

1. Per ottenere una compromissione subletale del sistema ematopoietico/immunitario, esporre i topi wild-type (WT) nel gruppo trattato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 5 Gray (Gy), nel gruppo trattato con midollo osseo nativo (BM) 5 Gy e nel gruppo trattato con osteoorganoidi 5 Gy a irradiazione 5 Gy (1,25 Gy/min) 24 ore prima del trapianto.
   NOTA: Assicurarsi che i topi WT nel gruppo trattato con PBS 0 Gy siano trattati con PBS e non siano sottoposti a irradiazione.

5. Processo di terapia cellulare

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili.

1. Acquisizione in vivo di cellule derivate da osteo-organoidi e native del midollo osseo
   1. Impiantare due scaffold bioattivi nella sacca muscolare di topi C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) e incubarli per 12 settimane per formare gli osteo-organoidi in vivo . Raccogliere due osteo-organoidi in vivo e due femori da un topo CD45.1 sopra menzionato. Successivamente, eliminare i tessuti molli sulla superficie degli osteoorganoidi e dei femori utilizzando una pinza e una garza.
   2. Posizionare separatamente gli osteoorganoidi e i femori in un mortaio e aggiungere 1 mL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺).
      NOTA: HBSS senza Ca²⁺ e Mg²⁺ può ridurre l'aggregazione cellulare. La soluzione utilizzata per il trapianto non deve contenere componenti di siero per evitare potenziali reazioni di rigetto.
   3. Tagliare i campioni con le forbici chirurgiche e schiacciarli delicatamente in un mortaio e pestello.
   4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari con 300 μL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺). Mescolare accuratamente per ottenere una sospensione di cellule derivate da osteo-organoidi o cellule intere del midollo osseo.
      NOTA: Per utilizzare appieno i cocktail cellulari derivati dall'osteo-organoide in vivo, abbiamo scelto di utilizzare cellule intere del midollo osseo per la terapia. Il numero tipico di cellule totali in un osteo-organoide in vivo indotto da BMP-2 da 30 μg è 30.000.000-40.000.000.
2. Iniezione del seno venoso orbitale
   NOTA: Le cellule del midollo osseo intero CD45.1⁺ raccolte da osteo-organoidi o femori in vivo sono state iniettate attraverso il seno venoso orbitale nel ricevente C57BL/6 (CD45.2) irradiato in modo subletale, rispettivamente. L'iniezione del seno venoso orbitale e l'iniezione della vena caudale sono metodi comunemente usati negli esperimenti sugli animali. L'iniezione orbitale del seno venoso è stata scelta per la sua semplicità e il basso tasso di fallimento per i principianti. Durante il processo di iniezione orbitale, è necessario adottare alcune misure protettive, come la pre-anestetizzazione dei topi, l'utilizzo di una piastra riscaldata per ridurre il rischio di ipotermia e il trattenimento meccanico dei topi per impedirne il movimento.
   1. Posizionare i topi CD45.2 in una camera preanestesia e indurre l'anestesia utilizzando l'isoflurano. Applicare un unguento veterinario lubrificante intorno agli occhi dei topi per prevenire la secchezza e contrastare le irritazioni oculari causate dall'isoflurano.
      NOTA: Per ridurre al minimo i danni agli animali, l'anestesia con isoflurano viene somministrata ai topi prima dell'iniezione del seno venoso orbitale.
   2. Trasferisci i topi sul tavolo per anestesia per un'ulteriore anestesia.
   3. Per ridurre la probabilità di ipotermia nei topi, posizionare il topo irradiato e anestetizzato su un termoforo termostatico impostato a 37 °C.
   4. Posizionare il mouse in decubito laterale sinistro con la testa rivolta a destra dopo essere stato completamente anestetizzato.
   5. Per sporgere l'occhio, posizionare un dito sulla parte superiore della testa e lungo la mascella. Tirare delicatamente la pelle indietro e verso il basso.
   6. Utilizzare una siringa da 1 ml dotata di ago da 25 G per aspirare 200 μl di sospensione cellulare in vivo derivata da osteoorganoidi o di sospensione cellulare nativa derivata dal midollo osseo di topi CD45.1⁺ ottenuti nella fase 5.1.5.
   7. Introdurre con cautela l'ago, smussato verso il basso, con un angolo di circa 30°, nel canto mediale.
      NOTA: Le iniezioni vengono solitamente somministrate con l'ago smussato verso l'alto, ma per le iniezioni retro-orbitali è meglio posizionare l'ago smussato verso il basso per ridurre il rischio di danni agli occhi.
   8. Usa l'ago per seguire il bordo del bulbo oculare verso il basso fino a quando la punta dell'ago non si trova alla base dell'occhio.
   9. Iniettare lentamente e senza intoppi l'iniettato.
   10. Al termine dell'iniezione, rimetti il topo nella sua gabbia per il recupero.

6. Valutazione degli effetti del trattamento

1. Analisi ematologiche
   NOTA: Per analizzare l'ematologia dei riceventi nei saggi di ricostituzione del sistema immunitario, abbiamo raccolto campioni di sangue periferico da riceventi sottoposti a diversi trattamenti: trattamento PBS 0 Gy, trattamento PBS 5 Gy, trattamento BM nativo 5 Gy e trattamento osteo-organoide 5 Gy. I campioni di sangue sono stati ottenuti attraverso la puntura retro-orbitale 2 giorni prima e 2, 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto. Una parte del campione di sangue dello stesso gruppo è stata utilizzata per l'analisi ematologica, mentre l'altra parte è stata utilizzata per l'analisi del chimerismo. Esistono diversi metodi di prelievo del sangue, ad esempio attraverso la vena sottomandibolare o la vena caudale. La puntura retro-orbitale è uno dei metodi comuni per il prelievo di sangue nei topi ed è consentita in condizioni etiche.
   1. Ripetere i passaggi 5.2.1-5.2.5 per anestetizzare i topi e sporgere gli occhi dei topi.
      NOTA: Per mitigare i danni agli animali, l'anestesia con isoflurano viene somministrata ai topi prima del prelievo di sangue con puntura retroorbitale.
   2. Posizionare il tubo capillare con un diametro di 0,5 mm nel canto mediale dell'occhio e dirigerlo caudalmente con un angolo di 30°-45° rispetto al piano del naso.
   3. Ruotare delicatamente il tubo capillare mentre si applica pressione, permettendogli di penetrare attraverso le membrane congiuntivali. Consentire al sangue di fluire nel tubo capillare attraverso l'azione capillare.
   4. Applicare una pressione continua dopo che il sangue inizia a fluire per sostenere il flusso.
   5. Dopo aver prelevato 100 μL di sangue, rilasciare immediatamente la pressione sul collo. Contemporaneamente, rimuovere il tubo capillare per consentire all'occhio di tornare alla posizione normale per prevenire il sanguinamento postoperatorio dal sito di puntura.
   6. Espellere prontamente il sangue in una provetta da centrifuga che era stata lavata con una soluzione di acido etilendiammingo tetraacetico all'1,5% (p/v) di sale dipotassico diidrato (EDTA-K2) e quindi erano stati aggiunti 10 μL di soluzione di EDTA-K2 all'1,5% (p/v). Agitare delicatamente la provetta da centrifuga per garantire una miscelazione accurata della soluzione EDTA-K2 e del sangue, prevenendo la coagulazione.
   7. Dopo aver pulito la ferita con cotone sterile e aver applicato una leggera pressione per fermare l'emorragia, osservare i topi per 1-2 minuti dopo l'emostasi per assicurarsi che non vi siano anomalie e poi rimetterli nelle loro gabbie.
   8. Eseguire analisi ematologiche su una parte dei campioni di sangue di ciascun gruppo utilizzando un analizzatore ematologico, comprese le contazioni dei globuli bianchi (WBC), dei globuli rossi (RBC) e delle piastrine (PLT).
      NOTA: Analizzare tutti i campioni di sangue entro 2 ore dal prelievo.
2. Analisi del chimerismo del sangue periferico
   NOTA: Analogamente all'analisi ematologica, i campioni di sangue periferico di 5 Gy di gruppi trattati con BM nativi e 5 Gy trattati con osteo-organoidi sono stati raccolti mediante puntura retroorbitale a 2, 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto.
   1. Utilizzare l'altra parte del campione di sangue periferico ottenuto al punto 6.1 per l'analisi del chimerismo del sangue periferico.
   2. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi eritrocitaria al campione e limare per 3-5 minuti. Capovolgere delicatamente il campione per facilitare una migliore lisi dei globuli rossi.
   3. Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C.
   4. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 mL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺) per risospendere il pellet.
   5. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Colorare i restanti circa 100 μL di cellule sul fondo della provetta da centrifuga a 4 °C per 30 minuti utilizzando anticorpi, tra cui un kit di colorazione vivo/morto, PE-anti-CD45.1 (1:200), isotiocianato di fluoresceina (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) e Alloficocianina (APC)-anti-CD3e (1:200).
   6. Risospendere le cellule con 1 mL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺) e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   7. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 300 μL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. Agitare la sospensione per eseguire ulteriori analisi di citometria a flusso.
   9. Analizza ulteriormente i dati ottenuti utilizzando il software di citometria a flusso per ottenere informazioni sul tasso di chimerismo delle HSPC nel sangue periferico dei topi riceventi sia nel gruppo trattato con BM nativo da 5 Gy che nel gruppo trattato con osteo-organoidi da 5 Gy.
      NOTA: Per l'analisi dei dati citofluorimetrici, fare riferimento alla Figura S2 supplementare per le tipiche strategie di gating utilizzate per identificare le cellule CD45.1⁺ derivate da donatore nel sangue periferico dei riceventi CD45.2.
   10. Ripetere i passaggi 3.4.11-3.4.12 per eseguire il gate della regione corrispondente alle cellule vive.
   11. Analizza il chimerismo del sangue periferico identificando inizialmente le popolazioni cellulari e successivamente discernendo le cellule donatrici e riceventi.
       1. Screening di cellule marcate con anticorpi specifici all'interno di cellule vive. Selezionare CD11b-AF700 per l'asse X e B220-PE-Cy7 per l'asse Y. Gate le cellule B220⁺CD11b^- come cellule B, le cellule B220-CD11b⁺ come cellule mieloidi e le cellule B220-CD11b^- come cellule double-negative (DN).
       2. Fare doppio clic sulla porta delle celle DN, utilizzando CD3-APC per l'asse X e SSC-A per l'asse Y. Gate le cellule CD3⁺ come cellule T.
       3. Fare doppio clic sulla porta delle celle CD3⁺, selezionando CD4-PE-Dazzle594 per l'asse X e CD8-PerCp-Cy5.5 per l'asse Y. Gate le cellule CD8⁺CD4^- come cellule T citotossiche (CTL) e le cellule CD8-CD4⁺ come cellule T regolatorie (Treg).
   12. Infine, viene eseguita l'analisi del chimerismo del sangue periferico sulle cellule donatrici e riceventi. All'interno delle popolazioni cellulari designate, fare doppio clic per selezionare CD45.1-PE per l'asse X e CD45.2-FITC per l'asse Y. Gate le cellule CD45.1⁺ ed eseguire il conteggio delle cellule per determinare la proporzione di cellule CD45.1⁺ all'interno della popolazione cellulare, riflettendo così il tasso di chimerismo.
3. Analisi del chimerismo degli organi solidi
   NOTA: A 16 settimane dopo il trapianto, le chimere di midollo osseo, milza e timo sono state analizzate nel gruppo trattato con 5 Gy di midollo osseo e nel gruppo di 5 Gy trattato con osteoorganoidi.
   1. Ripetere i passaggi 5.1.1-5.1.4 per ottenere i pellet di celle derivati dal BM.
   2. Posizionare un filtro in nylon da 300 mesh sopra una piastra per colture cellulari (6 cm) contenente 1 mL di HBSS (no Ca²⁺, Mg²⁺).
   3. Posizionare la milza o il timo sezionati sul filtro di nylon.
   4. Macinare gli organi menzionati utilizzando il tappo di gomma anteriore di una siringa da 5 ml fino a quando non rimane alcuna struttura tissutale evidente, solo tessuto fibroso residuo. Maneggiare le cellule con delicatezza per garantirne la vitalità.
   5. Raccogliere il filtrato e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   6. Rimuovere il surnatante per ottenere i precipitati cellulari derivati dalla milza o dal timo.
   7. Aggiungere 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi ai pellet cellulari ottenuti nei passaggi 6.3.1 e 6.3.6 e limare per 3-5 minuti.
   8. Ripetere i passaggi 6.2.3-6.2.8 per la colorazione e l'analisi della citometria a flusso.
   9. Analizza ulteriormente i dati ottenuti utilizzando il software di citometria a flusso per ottenere informazioni sul tasso di chimerismo delle HSPC negli organi solidi (BM, milza e timo) dei topi riceventi sia nel gruppo trattato con BM nativo da 5 Gy che nel gruppo trattato con osteo-organoidi da 5 Gy.
      NOTA: Per l'analisi dei dati citofluorimetrici, fare riferimento alla Figura S2 supplementare per le tipiche strategie di gating utilizzate per identificare le cellule CD45.1⁺ derivate da donatore nel midollo osseo, nella milza e nel timo dei riceventi CD45.2.
   10. Sostituire il sangue periferico nei passaggi 6.2.10-6.2.12 con midollo osseo, milza e timo per ottenere il tasso di chimerismo degli organi solidi.

Risultati

Come da protocollo, abbiamo creato un'impalcatura bioattiva gocciolando BMP-2 in una spugna di gelatina degradabile in condizioni sterili. L'impalcatura è stata quindi impiantata nei muscoli degli arti inferiori dei topi per stabilire in vivo gli osteo-organoidi. Dopo un periodo di incubazione di 12 settimane, abbiamo condotto la fotografia macroscopica, l'analisi istologica e l'analisi della citometria a flusso sugli osteoorganoidi (Figura 1A). La...

Discussione

In questo protocollo, presentiamo un approccio per stabilire osteo-organoidi in vivo con strutture simili al midollo osseo impiantando scaffold in spugna di gelatina caricati con BMP-2. Dimostriamo che questi osteo-organoidi in vivo possono produrre stabilmente HSPC terapeutici per un lungo periodo di tempo (più di 12 settimane). Rispetto agli attuali metodi di espansione in vitro o di incubazione in vivo che caricano le cellule, questo protocollo pu?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.