用于收获治疗性造血干细胞/祖细胞的体内骨类器官方法

摘要

在这里，我们建立了由骨形态发生蛋白 2 负载的明胶支架触发的 体内 骨类器官，以收获治疗性造血干细胞/祖细胞，用于重建受损的造血和免疫系统。总体而言，这种方法可以为细胞疗法提供有前途的细胞来源。

摘要

造血干细胞移植 （HSCT） 需要足够数量的治疗性造血干细胞/祖细胞 （HSPC）。为了确定 HSPCs 的足够来源，我们通过将装有重组人骨形态发生蛋白-2 （rhBMP-2） 的支架植入小鼠股骨附近的内部肌肉袋中，开发了一种 体内骨 类器官。植入 12 周后，我们检索 体内骨类 器官并对 HPSC 进行流式细胞术分析，发现 体内 骨类器官中存在显着的 HSPC 亚群。

然后，我们建立了通过放射治疗小鼠造血/免疫系统损伤的亚致死模型，并通过将提取的骨类器官衍生细胞注射到放疗小鼠的外周血中进行造血干细胞移植 （HSCT）。通过血液学、外周血嵌合体和实体器官嵌合体分析评估造血恢复的效果。 结果证实， 体内 骨类器官衍生的细胞可以快速有效地重建受照射小鼠受损的外周和实体免疫器官。这种方法有可能作为 HSCT 的 HSPC 替代来源，为更多患者带来益处。

引言

造血干细胞移植是各种血液系统恶性肿瘤以及许多遗传性和自身免疫性疾病的常规疗法 1,2,3,4。然而，造血干细胞/祖细胞 （HSPC） 的数量和来源受限已成为造血干细胞移植 （HSCT） 临床实施的重大障碍^5,6。

大规模体外细胞扩增是收获治疗性细胞的常用方法 ^5,7。各种研究已经开发出刺激 HSPC 在体外自我更新的条件，通常是通过使用自我更新激动剂（如细胞因子和生长因子）和血清白蛋白的组合，导致 HSPC 的离体扩增⁸。然而，重要的是要注意，目前的方法仍然非常耗时且难以维持扩展的 HSPCs 的自我更新能力⁹。

与上述方法相比，体内收获细胞提出了一种新的创新策略。这种方法涉及建立模拟天然骨髓结构的体内骨类器官^10,11。为了实现这一目标，我们使用载有骨形态发生蛋白 2 （BMP-2） 的明胶支架形成体内骨类器官，以获得丰富和高质量的自体细胞混合物，包括 HSPCs。通过治疗性应用这些骨类器官，我们已经成功地治疗了照射损伤，并证明源自骨类器官的 HSPC 可以快速稳定地重建实验受损的免疫系统。

研究方案

该研究包括 8-10 周龄的雄性和雌性 C57BL/6 小鼠。所有小鼠均饲养在华东理工大学动物设施中。所有实验程序均由华东理工大学机构动物护理和使用委员会 （ECUST-21010） 批准。

1. 生物活性支架的制造

1. 制备
   1. 将清洗干净并干燥的手术剪刀和镊子放入 1,000 mL 烧杯中。用吸水纸包住烧杯口，然后用棉线系紧。
   2. 将烧杯放入高压灭菌器中，盖紧盖子，将灭菌程序设置为 121 °C 30 分钟，然后启动灭菌程序。
   3. 灭菌过程完成后，取出灭菌的烧杯并将其转移到设置为 60 °C 的干燥箱中进行干燥。完全干燥后，用 75% （v/v） 酒精喷洒烧杯，然后将其放在洁净的工作台上。
   4. 手术前 2 小时解冻 rhBMP-2 储备溶液 （1.0 mg/mL）。
   5. 解冻至室温后，将 rhBMP-2 储备液和未开封的明胶海绵转移到无菌洁净工作台上，以制造生物活性支架。
      1. 用消毒剪刀将明胶海绵（60 mm x 20 mm x 5 mm）剪成48个大小均匀的块（5 mm x 5 mm x 5 mm）（图1B），并将它们转移到48孔板上。
      2. 通过轻轻上下吹打来混合 rhBMP-2 储备液，以确保混合均匀，注意避免气泡。吸出 30 μL 溶液，滴加到明胶海绵中。
      3. 使用一层封口膜密封 48 孔板，以促进后续的冷冻干燥过程。从洁净工作台中取出含有明胶海绵的板。将其置于 -20 °C 冷冻。同时，打开冷冻干燥机并将其预冷至 -50 °C 至 -60 °C 的温度范围。
      4. 冷冻 2 小时后，将带有明胶海绵的孔板放入冷冻干燥机中 12 小时。为了保持样品的干燥和无菌，冷冻干燥后再涂一层封口膜来密封孔板。将其存放在 -20 °C 冰箱中。

2. 生物活性支架的手术植入

注意:所有手术器械都经过消毒后使用。

1. 麻醉前将小鼠禁食 1 小时。在小鼠眼睛周围涂抹润滑兽医软膏，以减少因眼部干燥引起的术后不适。通过腹膜内注射 1% （w/v） 戊巴比妥钠溶液（剂量为 48 mg/kg）麻醉小鼠。
   注意:该方案使用道德认可的麻醉方法和戊巴比妥钠腹腔注射。其他方法，如异氟醚吸入或氯胺酮-甲苯噻嗪腹腔注射，经批准后也可使用。
2. 通过在仰卧鼠标中寻找以下迹象来确认小鼠的麻醉深度:稳定的心跳和呼吸、放松的肌肉、不动的四肢、对触摸无反应的胡须以及没有踏板反射。此外，用齿镊子捏住小鼠的皮肤或刺激小鼠的脚趾或爪子。如果小鼠表现出敏感反应，则麻醉太轻;进行额外的麻醉。达到麻醉平面后，将小鼠转移到右侧卧位的手术区域，以轻松将生物活性支架植入左腿。
3. 使用剃须机剃掉左腿的毛发。使用交替轮换的洗必泰和酒精消毒剃须区域 3 次，并在位于股外侧肌外侧的后腿上切开切口。使用眼科剪刀切开约 3.0 毫米长的切口，沿胫骨方向延伸。
   注意:为了在手术过程中保持无菌状态，用过的手术物品应存放在指定位置。无菌用品应放置在清洁区域，以防止与作人员以外的个人接触。可重复使用的手术器械应立即用 75% （v/v） 乙醇消毒。尽量减少手术时间，以减少伤口暴露在空气中并降低感染风险。
4. 要为植入物创建口袋，请打开股外侧肌远端的筋膜，朝向胫骨。
5. 使用眼用镊子将生物活性支架塑造成一个圆柱体，高约 5 毫米，直径约 5 毫米。沿着眼科剪刀产生的肌肉裂缝将支架植入肌肉袋中，并通过筋膜以间断缝合模式闭合植入物袋。使用 4-0 缝合线闭合皮肤切口。
   注意:在外科手术过程中动物发生抽搐或排尿表明麻醉深度过大，需要及时采取紧急措施。
6. 重复步骤 2.3-2.5 并在小鼠的右侧股骨肌袋中植入另一个生物活性支架。手术后使用碘拭子清洁小鼠的手术和注射部位，以防止感染。
   注意:每块股外侧肌只能插入一个植入物。
7. 将小鼠置于 37 °C 的恒温平台上，直到实验后醒来。每 10-15 分钟将小鼠翻过来，以防止血液淤积。手术后，除了保持温暖外，还应监测术后小鼠，不要让动物无人看管，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。密切关注小鼠的重要指标，例如心率和呼吸频率。
   注意:小鼠前肢颤抖意味着恢复阶段的开始。
8. 将小鼠放回已用酒精喷雾和紫外线照射消毒的无菌笼中。在动物完全康复之前，不要将接受过手术的动物与其他动物放在一起。此外，使用美洛昔康管理术后疼痛至少一天，可选择延长至三天以进行更强化的疼痛管理。在手术后 72 小时内定期检查动物和伤口，以确定任何潜在的不良反应。如果稍后检测到感染，则首先通过腹膜内注射 1% （w/v） 戊巴比妥钠溶液（剂量为 48 mg/kg）麻醉小鼠，然后在麻醉后进行颈椎脱位，对动物实施安乐死。

3. 植入后 12 周 体内骨类 器官的表征

注意:生物活性支架将在植入后 在体内 发育以形成骨类器官。

1. 体内骨类器官的集合
   1. 当 体内 骨类器官植入 12 周后，通过腹膜内注射 1% （w/v） 戊巴比妥钠溶液（剂量为 48 mg/kg）麻醉小鼠，然后在麻醉后进行颈椎脱位。
      注意:为了尽量减少对动物的伤害，应在安乐死前通过宫颈脱位对小鼠进行麻醉。
   2. 将 75% （v/v） 酒精喷洒在解剖部位的皮肤上。
   3. 断开后肢与躯干的连接，并使用微型剪刀小心地从骨类器官中取出肌肉。
   4. 用纱布去除附着的软组织。
   5. 在室温下将一些骨类器官在 4% （v/v） 多聚甲醛 （PFA） 溶液中固定 24 小时以进行组织学分析。利用剩余的样品进行 HPSC 的宏观摄影和流式细胞术分析。
2. 宏观图像
   1. 将骨类器官放在蓝色背景板上，并用数码相机拍摄它们。
3. 组织学分析
   1. 组织学染色的准备
      1. 将骨类器官从 PFA 溶液转移到超纯水中并浸泡 1 小时。
      2. 用 0.5 M 乙二胺四乙酸 （EDTA） 溶液代替超纯水进行脱钙 1 周。
      3. 将脱钙的组织放入包埋盒中，并将盒浸入超纯水中 1 小时。
      4. 对于梯度脱水，将包埋盒浸入不同浓度 （v/v） 的乙醇中:75%、80%、90% 和 95%，每次持续 1 小时，然后浸入 100% （v/v） 乙醇 I 和 II 中各 1 小时。
         注:"100% （v/v） 乙醇 I 和 II"表示包埋盒应浸入装有 100% （v/v） 乙醇的"容器 I"中一次，然后第二次浸入装有 100% （v/v） 乙醇的"容器 II"中。
      5. 脱水后，将包埋的组织依次置于 100% （v/v） 二甲苯和无水乙醇（二甲苯:乙醇体积比为 1:1）的混合物中 1 小时和 100% （v/v） 二甲苯 I 和 II 的混合物中各放置 30 分钟。
      6. 将组织浸入石蜡 I 和 II 中，在 60 °C 的恒定温度下各浸泡 2 小时。
      7. 要使用包埋机包埋浸泡在蜡中的组织，请将熔化的蜡放入包埋模具中。在蜡凝固之前，从脱水容器中取出组织，并将其放入包埋模具中;相应地标记它们。在 -20 °C 的冰冻条件下冷却模具，蜡凝固后，从包埋模具中取出蜡块并修剪。
      8. 使用石蜡切片机将包埋的蜡块切成 4.5 μm 厚的切片，然后将切片贴在载玻片上。
      9. 在 40 °C 下短暂烘烤切片，然后收集并储存在样品盒中。
   2. H&E 染色
      1. 将切片放在样品架上，并在 60 °C 的干燥箱中烘烤 30 分钟。
      2. 在二甲苯和乙醇中对切片进行脱蜡。依次将石蜡切片放入二甲苯 I 中 10 分钟，二甲苯 II 中 10 分钟，二甲苯 III 中 10 分钟，无水乙醇 I 中 5 分钟，无水乙醇 II 中 5 分钟，90% （v/v） 乙醇中 5 分钟，80% （v/v） 乙醇中 5 分钟，70% （v/v） 乙醇中 5 分钟，50% （v/v） 乙醇中 5 分钟，然后转移到纯水中进行梯度脱蜡过程。
      3. 将切片浸入苏木精染色溶液中 2 分钟，然后用流水冲洗 10 分钟。
      4. 将切片浸入伊红染色溶液中 2 分钟。
      5. 依次将切片放入 75% （v/v） 乙醇中 2 分钟，85% （v/v） 乙醇中 2 分钟，无水乙醇 5 分钟，无水乙醇 5 分钟，二甲苯 5 分钟脱水。
      6. 从二甲苯中取出切片，用中性香脂密封。
      7. 在显微镜下观察切片，并在中性香脂干燥后以 10 倍的放大倍率捕获代表性图像。
4. HPSCs 的流式细胞术分析
   1. 将从步骤 3.1 获得的 体内 骨类器官放入研钵中，并加入适量的染色缓冲液。使用眼科剪刀将骨类器官切成直径为 1-3 毫米的碎片，并使用研钵和研杵在染色缓冲液中粉碎它们。使用杵垂直压制而不是研磨 体内骨类 器官的片段，以防止细胞存活率下降。
   2. 将细胞悬液收集到离心管中，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   3. 去除上清液，加入 1 mL 红细胞裂解缓冲液，裂解细胞 3-5 分钟。
   4. 用 1 mL 染色缓冲液洗涤细胞，并通过 300 目尼龙过滤器过滤到 5 mL 流式细胞仪管中。
   5. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。使用抗体在4°C下对流式细胞术管底部剩余的约100 μL（细胞）染色30分钟，包括活/死染色试剂盒、Peridinin 叶绿素蛋白-花青素 5.5 （PerCp-Cy5.5） - 抗谱系混合物 （1:10）、藻红蛋白-花青素 5 （PE-Cy5） - 抗 c 试剂盒 （1:200）、Alexa Fluor 700（AF700）-抗干细胞抗原-1（Sca-1） （1:200）、亮紫 711（BV711）-抗 CD16/32 （1:200）、 生物抗 CD34 （1:200）、BV421 抗 CD127 （1:200）、PE-CF594 抗 CD135 （1:200）、BV510 抗 CD48 （1:200） 和 PE-Cy7 抗 CD150 （1:200）。
   6. 用 1 mL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 重悬细胞，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   7. 吸出上清液，并在 4 °C 下用 PE-链霉亲和素二抗 （1:200） 再染色 60 分钟。
   8. 用 1 mL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）重悬细胞，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   9. 吸出上清液并用 300 μL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）重悬细胞。
   10. 涡旋溶液以进行进一步的流式细胞术分析。使用流式细胞术软件进一步分析获得的数据，以获得 HSPC 的定量数据。
       注:流式细胞术的数据收集和分析参考我们之前的文章和支持材料（补充图 S1），了解用于识别 HSPCs¹⁰ 的典型门控策略。
   11. 在流式细胞仪上采集数据期间，建立侧向散射区 （SSC-A） 与前向散射区 （FSC-A） 点图，并在 SSC-A 与 FSC-A 点图中对感兴趣细胞群 （P1） 的周围区域进行门控。双击 P1 门;为 X 轴选择前向散射高度 （FSC-H），为 Y 轴选择前向散射宽度 （FSC-W），以执行第一次细胞粘附处理。双击单细胞门;选择 X 轴的侧向散射高度 （SSC-H），选择 Y 轴的侧向散射宽度 （SSC-W） 以进行第二次细胞粘附处理。使用矩形选通工具选择单个单元格。
   12. 排除死细胞。通过检测活力标志物来区分活细胞和死细胞。建立 SSC-A 与活/死的点图，并对对应于活细胞的区域进行门控，将其命名为"活细胞"。
   13. 筛选"活细胞"中用特异性抗体标记的细胞。通过使用谱系阴性 （lin^-） 门控，排除可能受髓系造血干细胞/祖细胞谱系中谱系特异性抗体阳性表达影响的细胞群。门 lin^- 细胞。
   14. 筛选 lin^- cells 内的不同细胞亚群。双击 lin^- cells 门;为 X 轴选择 Sca-1-AF700，为 Y 轴选择 c-kit-PE-Cy5。将 c-kit ⁺ Sca-1^- 细胞设门为 LKS ^- 细胞，将 c-kit ⁺ Sca-1 ⁺ 细胞设门为 LKS ⁺ 细胞，将 c-kit 和 Sca-1 表达低的细胞设门为 LK^loS^lo 细胞。双击 LKS^- 门，选择 CD34-PE 作为 X 轴，选择 FCγR-BV711 作为 Y 轴。双击 LKS⁺ 门;X 轴选择 FIt3-PE-CF594，Y 轴选择 IL7Rα-BV421，X 轴选择 CD150-PE-Cy7，Y 轴选择 CD48-BV510。
   15. 根据抗体的特异性，识别阳性或阴性门以区分细胞亚群:造血干细胞（Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺）和分化的造血祖细胞:多能祖细胞（Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻）、常见淋巴祖细胞（Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺）、常见髓系祖细胞 （^Lin-c-kit+Sca-1-CD34⁺FCγR^-）、粒细胞-单核细胞祖细胞 （^Lin-c-kit+Sca-1-CD34⁺FCγR⁺） 和巨核细胞红细胞祖细胞 （^Lin-c-kit+Sca-1-CD34-FCγR^-）。

4. 小鼠照射模型

注意:使用 X 射线辐照器用 X 射线照射 C57BL/6 小鼠。

1. 为了实现造血/免疫系统的亚致死性损伤，将 5 格雷 （Gy） 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 处理组、5 Gy 天然骨髓 （BM） 处理组和 5 Gy 骨类器官处理组中的野生型 （WT） 小鼠暴露于 5 Gy 照射 （1.25 Gy/min） 移植前 24 小时。
   注意:确保 0 Gy PBS 处理组中的 WT 小鼠用 PBS 处理并且不进行照射。

5. 细胞治疗过程

注意:所有程序都应在无菌条件下进行。

1. 获取 体内 骨类器官来源的和天然骨髓来源的细胞
   1. 将两个生物活性支架植入 C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ （CD45.1） 小鼠的肌肉袋中，并孵育 12 周以形成 体内骨 类器官。从上述一只 CD45.1 小鼠中收获两个 体内 骨类器官和两个股骨。随后，使用镊子和纱布清除骨类器官和股骨表面的软组织。
   2. 将骨类器官和股骨分别放入研钵中，加入 1 mL HBSS（无 Ca²⁺，Mg²⁺）。
      注意:不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 可以减少细胞聚集。用于移植的溶液不得含有血清成分，以避免任何潜在的排斥反应。
   3. 用手术剪刀将样品切开，然后在研钵和研杵中轻轻压碎。
   4. 通过 40 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   5. 去除上清液，用 300 μL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）重悬细胞沉淀。充分混合以获得骨类器官衍生细胞或全骨髓细胞的悬浮液。
      注意:为了充分利用来自体内骨类器官的细胞混合物，我们选择使用全骨髓细胞进行治疗。30 μg BMP-2 诱导的体内骨类器官中的典型总细胞数为 30,000,000-40,000,000。
2. 眼眶静脉窦注射
   注意:从体内骨类器官或股骨收集的 CD45.1 ⁺ 全骨髓细胞分别通过眶静脉窦注射到死下照射的 C57BL/6 （CD45.2） 受体中。眼眶静脉窦注射和尾静脉注射是动物实验中常用的方法。选择眼眶静脉窦注射是因为它简单且初学者失败率低。在眼眶注射过程中，需要采取一定的保护措施，例如对小鼠进行预麻醉，使用加热板降低体温过低的风险，以及机械约束小鼠以防止移动。
   1. 将 CD45.2 小鼠置于预麻醉室中，并使用异氟醚诱导麻醉。在小鼠眼睛周围涂抹润滑兽医软膏，以防止干燥并抵消异氟醚引起的眼部刺激。
      注意:为了尽量减少对动物的伤害，在眼眶静脉窦注射之前对小鼠进行异氟醚麻醉。
   2. 将小鼠转移到麻醉台上进行进一步麻醉。
   3. 为了降低小鼠体温过低的可能性，将受照射的麻醉小鼠放在设置为 37 °C 的恒温加热垫上。
   4. 完全麻醉后，将鼠标置于左侧卧位，头部朝右。
   5. 要突出眼睛，请将手指放在头顶并沿着下巴线。轻轻地向后和向下拉动皮肤。
   6. 使用装有 25 G 针头的 1 mL 注射器吸出 200 μL 在步骤 5.1.5 中获得的 CD45.1 ⁺ 小鼠的体内骨类器官衍生细胞悬液或天然骨髓衍生细胞悬液。
   7. 小心地将针头以大约 30° 的角度向下斜入内眦。
      注意:注射通常在针头斜面朝上的情况下进行，但对于眼眶后注射，最好将针头斜面向下放置，以降低眼睛损伤的风险。
   8. 用针头沿着眼球的边缘向下，直到针尖位于眼睛的底部。
   9. 缓慢而平稳地注射注射液。
   10. 注射完成后，将鼠标放回笼子中进行恢复。

6. 治疗效果评价

1. 血液学分析
   注意:为了分析免疫系统重建测定中受体的血液学，我们从接受不同治疗的受体中收集了外周血样本:0 Gy PBS 处理、5 Gy PBS 处理、5 Gy 天然 BM 处理和 5 Gy 骨类器官治疗。在移植前 2 天和移植后 2 、 4 、 8 、 12 和 16 周通过眼眶后穿刺获得血样。同一组血样的一部分用于血液学分析，另一部分用于嵌合体分析。有不同的采血方法，例如通过下颌下静脉或尾静脉。眶后穿刺是小鼠血液采样的常用方法之一，在道德条件下是允许的。
   1. 重复步骤 5.2.1-5.2.5 以麻醉小鼠并突出小鼠的眼睛。
      注意:为了减轻对动物的伤害，在眶后穿刺血液采样之前对小鼠进行异氟醚麻醉。
   2. 将直径为 0.5 毫米的毛细管放置在眼睛的内眦中，并将其相对于鼻子平面以 30°-45° 角向尾部引导。
   3. 在施加压力的同时轻轻旋转毛细管，使其穿透结膜。让血液通过毛细管作用流入毛细管。
   4. 在血液开始流动后施加持续压力以维持血液流动。
   5. 抽取 100 μL 血液后，立即释放颈部压力。同时，取出毛细管，让眼睛恢复到正常位置，以防止术后穿刺部位出血。
   6. 立即将血液排入离心管中，离心管已用 1.5% （w/v） 乙二胺四乙酸二钾盐二水合物 （EDTA-K2） 溶液洗涤，然后加入 10 μL 1.5% （w/v） EDTA-K2 溶液。轻轻摇动离心管，确保 EDTA-K2 溶液和血液充分混合，防止凝血。
   7. 用无菌棉擦拭伤口并轻轻按压止血后，在止血后观察小鼠 1-2 分钟，确保无异常，然后放回笼中。
   8. 使用血液学分析仪对每组血液样本的一部分进行血液学分析，包括白细胞 （WBC）、红细胞 （RBC） 和血小板 （PLT） 的计数。
      注意:在收集后 2 小时内分析所有血液样本。
2. 外周血嵌合体分析
   注:与血液学分析类似，在移植后 2、4、8、12 和 16 周通过眼眶后穿刺收集来自 5 Gy 天然 BM 处理组和 5 Gy 骨类器官处理组的外周血样本。
   1. 使用从步骤 6.1 获得的外周血样品的另一部分来分析外周血嵌合体。
   2. 向样品中加入 1 mL 红细胞裂解缓冲液并裂解 3-5 分钟。轻轻地将样品倒置，以促进更好地裂解红细胞。
   3. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   4. 弃去上清液并加入 1 mL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）以重悬沉淀。
   5. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。使用抗体，包括活/死染色试剂盒、PE-抗 CD45.1 （1:200）、异硫氰酸荧光素 （FITC） -抗 CD45.2 （1:200）、PE-Cy7-抗 B220 （1:200）、AF700 抗 CD11b （1:200）、PerCp-Cy5.5-抗 CD8a （1:200）、PE-Dazzle594-抗 CD4 （1:200） 和别藻蓝蛋白 （APC） 抗 CD3e （1:200）。
   6. 用 1 mL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）重悬细胞，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   7. 吸出上清液并用 300 μL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）重悬细胞。
   8. 涡旋悬浮液以进行进一步的流式细胞术分析。
   9. 使用流式细胞术软件进一步分析获得的数据，以获得 5 Gy 天然 BM 处理组和 5 Gy 骨类器官处理组受体小鼠外周血中 HSPCs 嵌合率的信息。
      注:有关流式细胞术数据的分析，请参阅 补充图 S2 ，了解用于识别 CD45.2 受体外周血中供体来源的 CD45.1 ⁺ 细胞的典型设门策略。
   10. 重复步骤 3.4.11-3.4.12 以限制与活细胞对应的区域。
   11. 通过最初识别细胞群，然后识别供体和受体细胞来分析外周血嵌合体。
       1. 筛选活细胞内的特异性抗体标记细胞。X 轴选择 CD11b-AF700，Y 轴选择 B220-PE-Cy7。将 B220⁺CD11b^- 细胞设门为 B 细胞，将 B220-CD11b^-细胞设门为髓系细胞，将 B220-CD11b^- 细胞设门为双阴性 （DN） 细胞。
       2. 双击 DN 细胞门，使用 CD3-APC 作为 X 轴 ，使用 SSC-A 作为 Y 轴。将 CD3 ⁺ 细胞 设门为 T 细胞。
       3. 双击 CD3 ⁺ 细胞门，选择 CD4-PE-Dazzle594 作为 X 轴，选择 CD8-PerCp-Cy5.5 作为 Y 轴。将 CD8 ⁺ CD4 ^- 细胞设门为细胞毒性 T 细胞 （CTL），将 ^{CD8-CD4 +} 细胞设门为调节性 T 细胞 （Treg）。
   12. 最后，对供体和受体细胞进行外周血嵌合体分析。在指定的细胞群中，双击选择 CD45.1-PE 作为 X 轴 ，选择 CD45.2-FITC 作为 Y 轴。对 CD45.1 ⁺ 细胞进行门控并进行细胞计数，以确定细胞群中 CD45.1 ⁺ 细胞的比例，从而反映嵌合率。
3. 实体器官嵌合体分析
   注意:移植后 16 周，分析 5 Gy BM 处理组和 5 Gy 骨类器官处理组的 BM、脾脏和胸腺嵌合体。
   1. 重复步骤 5.1.1-5.1.4 以获得来自 BM 的细胞沉淀。
   2. 将 300 目尼龙过滤器放在含有 1 mL HBSS（无 Ca²⁺、Mg²⁺）的细胞培养皿 （6 cm） 上方。
   3. 将解剖的脾脏或胸腺放在尼龙过滤器上。
   4. 使用 5 mL 注射器的前橡胶塞研磨上述器官，直到没有明显的组织结构残留，只有残留的纤维组织。轻轻处理细胞以确保细胞活力。
   5. 收集滤液并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
   6. 去除上清液以获得来自脾脏或胸腺的细胞沉淀物。
   7. 将 1 mL 红细胞裂解缓冲液添加到步骤 6.3.1 和 6.3.6 中获得的细胞沉淀中，并裂解 3-5 分钟。
   8. 重复步骤 6.2.3-6.2.8 进行染色和流式细胞术分析。
   9. 使用流式细胞术软件进一步分析获得的数据，以获得 5 Gy 天然 BM 处理组和 5 Gy 骨类器官处理组受体小鼠实体器官（BM、脾脏和胸腺）中 HSPC 的嵌合率信息。
      注:有关流式细胞术数据的分析，请参阅 补充图 S2 ，了解用于识别 CD45.2 受体的 BM、脾脏和胸腺中供体来源的 CD45.1 ⁺ 细胞的典型门控策略。
   10. 在步骤 6.2.10-6.2.12 中用 BM、脾脏和胸腺置换外周血，以获得实体器官的嵌合率。

结果

根据协议，我们通过在无菌条件下将 BMP-2 滴入可降解的明胶海绵中来创建一个生物活性支架。然后将支架植入小鼠的下肢肌肉中，以建立 体内 骨类器官。潜伏期 12 周后，我们对骨类器官进行了宏观摄影、组织学分析和流式细胞术分析（图 1A）。将明胶海绵切成尺寸为 5 mm x 5 mm x 5 mm 的立方体，吸收 30 μL BMP-2 储备液 （1.0 mg/mL） 后，获得生?...

讨论

在该协议中，我们提出了一种通过植入载有 BMP-2 的明胶海绵支架来建立具有骨髓样结构的 体内 骨类器官的方法。我们证明这些 体内 骨类器官可以在很长一段时间（超过 12 周）内稳定地产生治疗性 HSPC。与现有的加载细胞的 体外 扩增或 体内 孵育方法相比，该方案可以在 3 周内获得具有不同细胞类型的细胞混合物，包括 HSPC 和各种免疫细胞

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.