치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

요약

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

초록

조혈모세포이식(HSCT)에는 충분한 수의 치료용 조혈모세포/전구세포(HSPC)가 필요합니다. HSPC의 적절한 공급원을 확인하기 위해 생쥐의 대퇴골 근처 내부 근육 주머니에 재조합 인간 뼈 형태 유전 단백질-2(rhBMP-2)가 로드된 골격을 이식하여 생체 내 골 오가노이드를 개발했습니다. 이식 12주 후, in vivo osteo-organoids를 회수하고 HPSC에 대한 유세포 분석 분석을 수행하여 in vivo osteo-organoids 내에 HSPC subset이 유의하게 존재함을 밝혔습니다.

그런 다음 방사선을 통한 마우스의 조혈/면역체계 손상에 대한 치사하지 않는 모델을 확립하고 추출된 골오가노이드 유래 세포를 방사선 처리된 마우스의 말초 혈액에 주입하여 조혈모세포 이식(HSCT)을 수행했습니다. 조혈 회복의 효과는 혈액학적, 말초 혈액 키메라 및 고형 장기 키메라 분석을 통해 평가되었습니다. 그 결과, in vivo osteo-organoid 유래 세포가 방사선 조사된 마우스에서 손상된 말초 및 고체 면역 기관을 빠르고 효율적으로 재건할 수 있음을 확인했습니다. 이 접근법은 HSCT에 대한 HSPC의 대체 공급원으로서 잠재력을 가지고 있으며, 더 많은 환자에게 이점을 제공합니다.

서문

조혈모세포 이식은 다양한 혈액 악성 종양과 수많은 유전 및 자가면역 질환에 대한 전통적인 치료법입니다 1,2,3,4. 그럼에도 불구하고, 조혈모세포/전구세포(HSPC)의 제한된 수량과 기원은 조혈모세포이식(HSCT)의 임상적 시행에 실질적인 장애물로 부상하고 있습니다^5,6.

대규모 체외 세포 증식은 치료용 세포를 채취하기 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다 ^5,7. 다양한 연구에서 일반적으로 자가 재생 작용제(예: 사이토카인 및 성장 인자)와 혈청 알부민의 조합을 사용하여 HSPC의 체외 팽창을 통해 HSPC가 체외에서 자가 재생하도록 자극하는 조건을 개발했습니다⁸. 그러나 현재의 방법은 여전히 시간이 많이 걸리고 확장된 HSPC의 자가 갱신 능력을 유지하는 데 어려움이 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다⁹.

앞서 언급한 방법과는 대조적으로, in vivo 세포 수확은 새롭고 혁신적인 전략을 제시합니다. 이 접근법은 천연 골수 구조를 모방한 생체 내 골오가노이드(in vivo osteo-organoid)를 확립하는 것을 포함합니다^10,11. 이를 달성하기 위해 BMP-2(bone morphogenetic protein-2)가 로드된 젤라틴 스캐폴드를 사용하여 in vivo osteo-organoid를 형성하여 HSPC를 포함한 풍부하고 고품질의 자가 세포 칵테일을 얻습니다. 이러한 골오가노이드를 치료적으로 적용함으로써 방사선 손상 치료를 성공적으로 마쳤으며, 골오가노이드에서 유래한 HSPC가 실험적으로 손상된 면역 체계를 빠르고 안정적으로 재구성할 수 있음을 입증했습니다.

프로토콜

8-10주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스가 연구에 포함되었습니다. 모든 쥐는 화동과학기술대학교(East China University of Science and Technology)의 동물 시설에 수용되었습니다. 모든 실험 절차는 화동과학기술대학교(East China University of Science and Technology)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(ECUST-21010)의 승인을 받았습니다.

1. 생체 활성 비계의 제작

1. 준비
   1. 세척 및 건조된 수술용 가위와 핀셋을 1,000mL 비커에 넣습니다. 비커의 입을 흡수지로 감싸고 면사로 단단히 묶습니다.
   2. 비커를 고압 살균기에 넣고 뚜껑을 단단히 닫고 살균 프로그램을 121분 동안 30°C로 설정하고 살균 프로그램을 시작합니다.
   3. 멸균 과정이 완료되면 멸균된 비커를 제거하고 60°C로 설정된 건조 오븐에 옮겨 건조시킵니다. 완전히 건조되면 비커에 75%(v/v) 알코올을 뿌리고 깨끗한 벤치에 놓습니다.
   4. 시술 2시간 전에 rhBMP-2 원액(1.0mg/mL)을 해동합니다.
   5. 실온으로 해동한 후 rhBMP-2 스톡 용액과 미개봉 젤라틴 스폰지를 생체 활성 골격 제조를 위해 멸균 클린 벤치로 옮깁니다.
      1. 젤라틴 스펀지(60mm x 20mm x 5mm)를 멸균된 가위로 균일한 크기의 조각(5mm x 5mm x 5mm) 48개(그림 1B)로 자르고 48웰 플레이트에 옮깁니다.
      2. rhBMP-2 스톡 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하여 균일한 혼합을 보장하고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 용액 30μL를 흡입하고 젤라틴 스펀지에 적가합니다.
      3. 후속 동결 건조 과정을 용이하게 하기 위해 한 층의 파라필름을 사용하여 48웰 플레이트를 밀봉합니다. 클린 벤치에서 젤라틴 스펀지가 들어있는 접시를 꺼냅니다. 얼려면 -20 °C에 두십시오. 동시에 동결 건조기를 켜고 -50 °C에서 -60 °C의 온도 범위로 예냉각합니다.
      4. 2 시간 동안 얼린 후 젤라틴 스폰지가 든 웰 플레이트를 동결 건조기에 12 시간 동안 놓습니다. 샘플의 건조와 멸균 상태를 유지하려면 동결 건조 후 웰 플레이트를 밀봉하기 위해 파라필름을 추가로 바르십시오. -20°C 냉장고에 보관하십시오.

2. 생체 활성 골격의 외과적 이식

알림: 모든 수술 기구는 사용을 위해 멸균 처리됩니다.

1. 마취 전에 1시간 동안 마우스를 단식시킵니다. 눈가의 건조로 인한 수술 후 불편함을 줄이기 위해 생쥐의 눈 주위에 윤활 수의사 연고를 바르십시오. 펜토바르비탈 나트륨 1%(w/v) 용액(48mg/kg의 용량)을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다.
   참고: 이 프로토콜은 나트륨 펜토바르비탈 복강내 주사와 함께 윤리적으로 승인된 마취 방법을 사용합니다. 이소플루란 흡입 또는 케타민-자일라진의 복강내 주사와 같은 다른 방법도 승인 후 사용할 수 있습니다.
2. 누운 자세 마우스에서 일정한 심장 박동과 호흡, 이완된 근육, 움직이지 않는 팔다리, 접촉에 반응하지 않는 수염, 페달 반사 부재 등의 징후를 찾아 마우스의 마취 깊이를 확인합니다. 또한 이빨이 있는 집게로 쥐의 피부를 꼬집거나 쥐의 발가락이나 발을 자극합니다. 쥐가 민감한 반응을 보이면 마취가 너무 가볍습니다. 추가 마취를 실시합니다. 마취면이 달성된 후 마우스를 오른쪽 측면 누운 자세로 수술 부위로 옮겨 왼쪽 다리에 생체 활성 골격을 쉽게 이식합니다.
3. 면도기를 사용하여 왼쪽 다리의 수염을 면도합니다. 클로르헥시딘과 알코올을 각각 3회씩 번갈아 가며 면도한 부위를 소독하고, 광대 외측 근육의 측면에 위치한 뒷다리를 절개합니다. 안과 가위를 사용하여 경골 방향을 따라 약 3.0mm 길이의 절개를 만듭니다.
   참고: 수술 중 멸균 상태를 유지하기 위해 사용한 수술 용품은 지정된 장소에 보관해야 합니다. 멸균 용품은 작업자가 아닌 다른 사람과의 접촉을 방지하기 위해 깨끗한 장소에 보관해야 합니다. 재사용 가능한 수술 기구는 75%(v/v) 에탄올로 즉시 소독해야 합니다. 상처가 공기에 노출되는 것을 줄이고 감염 위험을 줄이기 위해 수술 기간을 최소화합니다.
4. 임플란트를 위한 포켓을 만들려면 광대 외측 근육의 원위 측면에서 경골 쪽으로 근막을 엽니다.
5. 안과 겸자를 사용하여 생체 활성 골격을 높이 약 5mm, 지름 5mm의 원통으로 만듭니다. 안과 가위로 만든 근육 슬릿을 따라 근육 포켓에 골격을 이식하고 근막을 통해 중단된 봉합 패턴으로 임플란트 포켓을 닫습니다. 절개 부위를 4-0 봉합사로 봉합합니다.
   참고: 수술 중 동물에서 경련이나 배뇨가 발생하는 것은 과도하게 깊은 마취를 나타내므로 신속한 응급 조치가 필요합니다.
6. 2.3-2.5단계를 반복하고 마우스의 오른쪽 대퇴골 근육 주머니에 다른 생체 활성 골격을 이식합니다. 수술 후 요오드 면봉을 사용하여 생쥐의 수술 부위와 주사 부위를 청소하여 감염을 예방합니다.
   참고: 각 광대 외측 근육에는 하나의 임플란트만 삽입할 수 있습니다.
7. 실험 후 깨어날 때까지 37°C의 항온 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 혈액이 고이는 것을 방지하기 위해 10-15분마다 쥐를 뒤집습니다. 수술 후에는 체온을 유지하는 것 외에도 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 않고 수술 후 쥐를 모니터링합니다. 심박수 및 호흡수와 같은 생쥐의 중요한 지표에 세심한 주의를 기울이십시오.
   참고: 생쥐의 앞다리가 떨리는 것은 회복 단계가 시작되었음을 의미합니다.
8. 알코올 스프레이와 자외선 조사로 소독된 멸균 케이지에 쥐를 다시 넣습니다. 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 두지 마십시오. 또한 수술 후 통증을 최소 하루 동안 관리하기 위해 멜록시캄을 투여할 수 있으며, 보다 집중적인 통증 관리를 위해 최대 3일까지 연장할 수 있습니다. 수술 후 72시간 동안 정기적으로 동물과 상처를 검사하여 잠재적인 부작용을 확인하십시오. 나중에 감염이 감지되면 먼저 펜토바르비탈 나트륨 1%(w/v) 용액(48mg/kg 용량)을 복강내 주사하여 생쥐를 마취한 다음 마취 후 자궁경부 탈구를 통해 동물을 안락사시킵니다.

3. 이식 후 12주 후 in vivo osteo-organoids의 특성화

참고: 생체 활성 골격은 이식 후 골오가노이드를 형성하기 위해 생체 내에서 발달합니다.

1. in vivo osteo-organoids 수집
   1. 생체 내 오스테오 오가노이드를 12주 동안 이식한 경우, 펜토바르비탈 나트륨 1%(w/v) 용액(48mg/kg 용량)을 복강내 주사하여 마우스를 마취한 다음 마취 후 경추 탈구를 수행합니다.
      참고: 동물에 대한 피해를 최소화하기 위해, 생쥐는 자궁경부 탈구로 인한 안락사 전에 마취해야 합니다.
   2. 박리 부위의 피부에 알코올 75%(v/v)를 분사합니다.
   3. 몸통에서 뒷다리를 분리하고 소형 가위를 사용하여 조심스럽게 골 오가노이드에서 근육을 제거합니다.
   4. 부착된 연조직을 거즈로 제거합니다.
   5. 조직학적 분석을 위해 실온에서 24시간 동안 4%(v/v) 파라포름알데히드(PFA) 용액에 일부 골오가노이드를 고정합니다. 나머지 시료를 HPSC의 거시적 사진 및 유세포 분석 분석에 활용합니다.
2. 거시적 이미지
   1. 파란 배경판에 골오가노이드를 놓고 디지털 카메라로 사진을 찍습니다.
3. 조직학적 분석
   1. 조직학적 염색을 위한 준비
      1. PFA 용액의 오스테오 오가노이드를 초순수로 옮기고 1시간 동안 담가둡니다.
      2. 1주일 동안 석회질 제거를 위해 초순수를 0.5M 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 용액으로 교체합니다.
      3. 석회질 제거 된 조직을 임베딩 카세트에 넣고 카세트를 초순수에 1 시간 동안 담그십시오.
      4. 그래디언트 탈수의 경우 임베딩 카세트를 다양한 농도(v/v)인 75%, 80%, 90%, 95%의 에탄올에 각각 1시간 동안 담근 다음 100%(v/v) 에탄올 I 및 II에 각각 1시간 동안 담근다.
         참고: "100%(v/v) 에탄올 I 및 II"는 임베딩 카세트를 100%(v/v) 에탄올로 채워진 "용기 I"에 한 번 담근 다음 100%(v/v) 에탄올로 채워진 "용기 II"에 두 번째로 담가야 함을 나타냅니다.
      5. 탈수 후 100%(v/v) 자일렌과 절대 에탄올(자일렌: 에탄올 부피 비율 1:1)의 혼합물에 1시간 동안 매립된 조직을 순차적으로 놓고 각각 30분 동안 100%(v/v) 자일렌 I 및 II를 놓습니다.
      6. 조직을 파라핀 I 및 II에 60°C의 일정한 온도에서 각각 2시간 동안 담그십시오.
      7. 임베딩 기계를 사용하여 왁스에 적신 조직을 삽입하려면 녹은 왁스를 임베딩 몰드에 넣습니다. 왁스가 응고되기 전에 탈수 용기에서 조직을 제거하고 임베딩 몰드에 넣으십시오. 그에 따라 레이블을 지정하십시오. -20°C 동결 상태에서 금형을 냉각하고 왁스가 응고된 후 매립 금형에서 왁스 블록을 제거하고 다듬습니다.
      8. 파라핀 슬라이서를 사용하여 포함된 왁스 블록을 4.5μm 두께의 절편으로 자른 다음 절편을 유리 슬라이드에 부착합니다.
      9. 섹션을 40°C에서 잠시 구운 다음 수집하여 샘플 상자에 보관합니다.
   2. H&E 염색
      1. 섹션을 샘플 랙에 놓고 60°C의 건조 오븐에서 30분 동안 굽습니다.
      2. 크실렌과 에탄올의 단면을 파라핀화합니다. 파라핀 절편을 10분 동안 크실렌 I, 10분 동안 크실렌 II, 10분 동안 크실렌 III, 5분 동안 절대 에탄올 I, 5분 동안 절대 에탄올 II, 5분 동안 90%(v/v) 에탄올, 5분 동안 80%(v/v) 에탄올, 5분 동안 70%(v/v) 에탄올, 5분 동안 50%(v/v) 에탄올에 놓고 그래디언트 왁싱 공정을 위해 순수한 물로 옮깁니다.
      3. 헤마톡실린 염색 용액에 절편을 2분 동안 담근 다음 흐르는 물에 10분 동안 헹굽니다.
      4. 섹션을 eosin 염색 용액에 2분 동안 담그십시오.
      5. 섹션을 75%(v/v) 에탄올에 2분 동안 배치하고, 85%(v/v) 에탄올을 2분 동안, 절대 에탄올을 5분 동안 배치하고, 절대 에탄올을 5분 동안 배치하고, 자일렌을 5분 동안 탈수시킵니다.
      6. 자일렌에서 부분을 제거하고 중성 발삼으로 밀봉합니다.
      7. 현미경으로 단면을 관찰하고 중성 발삼이 건조된 후 10배 배율로 대표 이미지를 캡처합니다.
4. HPSC에 대한 유세포 분석
   1. 3.1단계에서 얻은 in vivo osteo-organoids를 모르타르에 넣고 적절한 양의 염색 완충액을 첨가합니다. 골오가노이드를 안과 가위를 사용하여 직경 1-3mm의 조각으로 자르고 절구와 절굿공이를 사용하여 염색 완충액에서 분쇄합니다. 유봉을 사용하여 in vivo osteo-organoids의 단편을 분쇄하지 않고 수직으로 눌러 세포 생존율 감소를 방지합니다.
   2. 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 모으고 300 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   3. 상층액을 제거하고 적혈구 용해 완충액 1mL를 첨가하여 3-5분 동안 세포를 용해합니다.
   4. 1mL의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 300 메쉬 나일론 필터를 통해 5mL 유세포 분석 튜브로 여과합니다.
   5. 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용하고 상층액을 버립니다. 유세포분석 튜브 바닥에 남아 있는 약 100 μL(세포)를 4°C에서 30분 동안 생염색키트, 페리디닌 엽록소 단백질-시아닌5.5(PerCp-Cy5.5)-항계통 칵테일(1:10), 피코에리트린-시아닌5(PE-Cy5)-항-c-키트(1:200), 알렉사 플루오르 700(AF700)-항줄기세포 항원-1(Sca-1)(1:200), 브릴리언트 바이올렛 711(BV711)-항-CD16/32(1:200), bio-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200), PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 가 없는 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) 1mL로 세포를 재현탁시키고 4°C에서 5분 동안 300× g 의 원심분리를 합니다.
   7. 상층액을 흡인하고 4°C에서 추가로 60분 동안 PE-streptavidin 2차 항체(1:200)로 염색합니다.
   8. HBSS 1mL(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)와 300 × g 의 원심분리로 4°C에서 5분 동안 세포를 재현탁합니다.
   9. 상층액을 흡인하고 300μL의 HBSS(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)로 세포를 재현탁합니다.
   10. Vortex는 추가 유세포 분석을 수행하기 위한 솔루션입니다. HSPC에 대한 정량적 데이터를 얻기 위해 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 얻은 데이터를 추가로 분석합니다.
       참고: 유세포 분석의 데이터 수집 및 분석은 HSPC를 식별하는 데 사용되는 일반적인 게이팅 전략에 대한 이전 기사 및 지원 자료(보충 그림 S1)를 참조하십시오¹⁰.
   11. 유세포분석기에서 데이터를 수집하는 동안 측면 산란 영역(SSC-A) 대 전방 산란 영역(FSC-A) 점도표를 설정하고 관심 세포 집단(P1)의 주변 영역을 SSC-A 대 FSC-A 점도표로 게이트합니다. P1 게이트를 두 번 클릭합니다. X축은 전방 산란 높이(FSC-H)를 선택하고 Y축은 전방 산란 폭(FSC-W)을 선택하여 첫 번째 세포 접착 처리를 수행합니다. 단일 셀 게이트를 두 번 클릭합니다. X축은 측면 산란 높이(SSC-H)를 선택하고 Y축은 측면 산란 폭(SSC-W)을 선택하여 두 번째 셀 접착 처리를 수행합니다. 사각형 게이트 도구를 사용하여 단일 셀을 선택합니다.
   12. 죽은 세포를 제외합니다. 생존력 마커를 검출하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별합니다. SSC-A 대 Live/Dead의 점도표를 설정하고 살아있는 세포에 해당하는 영역을 게이트하여 "살아있는 세포"라는 이름을 지정합니다.
   13. "살아있는 세포"에서 특정 항체로 표지된 세포를 스크리닝합니다. 계통 음성(lin^-) 게이팅을 사용하여 골수성 조혈 줄기/전구 세포 계통에서 계통 특이적 항체의 양성 발현에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 집단을 제외합니다. 린^셀을 게이트합니다.
   14. ^lin-cells 내 세포의 다양한 하위 집단을 스크리닝합니다. ^lin-cells 게이트를 두 번 클릭합니다. X축으로 Sca-1-AF700을 선택하고 Y축으로 c-kit-PE-Cy5를 선택합니다. c-kit⁺Sca-1^- 세포는 LKS^- 세포로, c-kit⁺Sca-1⁺ 세포는 LKS⁺ 세포로, c-kit 및 Sca-1 발현이 낮은 세포는 LK^loS^lo 세포로 게이트합니다. LKS^-게이트를 두 번 클릭하고 X축으로 CD34-PE를 선택하고 Y축으로 FCγR-BV711을 선택합니다. LKS⁺ 게이트를 두 번 클릭합니다. X축은 FIt3-PE-CF594, Y축은 IL7Rα-BV421, X축은 CD150-PE-Cy7, Y축은 CD48-BV510을 선택합니다.
   15. 항체의 특이성에 따라 양성 또는 음성 게이트를 식별하여 세포 하위 집단을 구별할 수 있습니다: 조혈모세포(Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺) 및 분화된 조혈전구세포: 다분화능전구세포(Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻), 일반 림프전구세포(Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺), 일반 골수성 전구세포(Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), 과립구-단핵구 전구세포(Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) 및 거핵세포 적혈구 전구세포(Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. 마우스 조사 모델

참고: C57BL/6 마우스는 X선 조사기를 사용하여 X선에 조사되었습니다.

1. 조혈/면역 체계의 치명적 손상을 달성하려면 5 Gray(Gy) 인산염 완충 식염수(PBS) 처리 그룹, 5 Gy 천연 골수(BM) 처리 그룹 및 5 Gy osteo-organoids 처리 그룹의 야생형(WT) 마우스를 이식 24시간 전에 5 Gy 방사선 조사(1.25 Gy/min)에 노출시킵니다.
   참고: 0 Gy PBS 투여군의 WT 마우스가 PBS로 처리되고 방사선 조사를 받지 않는지 확인하십시오.

5. 세포 치료 과정

참고: 모든 절차는 멸균 상태에서 수행해야 합니다.

1. in vivo osteo-organoid 유래 및 천연 골수 유래 세포의 획득
   1. C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) 마우스의 근육 주머니에 두 개의 생체 활성 골격을 이식하고 12주 동안 배양하여 in vivo osteo-organoids를 형성합니다. 위에서 언급한 CD45.1 마우스 1마리에서 2개의 in vivo osteo-organoid와 2개의 대퇴골을 채취합니다. 그런 다음 집게와 거즈를 사용하여 골오가노이드와 대퇴골 표면의 연조직을 청소합니다.
   2. 골오가노이드와 대퇴골을 별도로 모르타르에 넣고 HBSS 1mL(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)를 추가합니다.
      참고: Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 가 없는 HBSS는 세포 응집을 감소시킬 수 있습니다. 이식에 사용되는 용액에는 잠재적인 거부 반응 반응을 피하기 위해 혈청 성분이 포함되어서는 안 됩니다.
   3. 수술용 가위로 샘플을 자르고 절구와 절굿공이로 부드럽게 으깨줍니다.
   4. 40μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하고 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   5. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 300μL의 HBSS(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)로 재현탁합니다. 골오가노이드 유래 세포 또는 전체 골수 세포의 현탁액을 얻기 위해 철저히 혼합합니다.
      참고: 생체 내 오스테오 오가노이드에서 유래한 세포 칵테일을 최대한 활용하기 위해 우리는 치료에 전체 골수 세포를 사용하기로 결정했습니다. in vivo osteo-organoid 유도된 30μg BMP-2의 일반적인 총 세포 수는 30,000,000-40,000,000입니다.
2. 안와정맥동 주사
   참고: in vivo osteo-organoids 또는 대퇴골에서 채취한 CD45.1⁺ 전체 골수 세포를 안와 정맥동을 통해 치사적으로 조사된 C57BL/6(CD45.2) 수용자에게 각각 주입했습니다. 안와정맥동주사와 꼬리정맥주사는 동물실험에서 일반적으로 사용되는 방법입니다. 안와정맥동 주사는 초보자를 위한 단순성과 낮은 실패율 때문에 선택되었습니다. 안와 주입 과정에서 생쥐를 사전 마취하거나, 저체온증의 위험을 줄이기 위해 가열판을 사용하고, 생쥐의 움직임을 방지하기 위해 생쥐를 기계적으로 제지하는 것과 같은 특정 보호 조치를 취해야 합니다.
   1. CD45.2 마우스를 마취실에 놓고 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다. 생쥐의 눈 주위에 윤활 수의사 연고를 바르면 건조함을 방지하고 이소플루란으로 인한 안구 자극을 중화할 수 있습니다.
      참고: 동물에 대한 피해를 최소화하기 위해 안와 정맥동 주사 전에 이소플루란 마취제를 마우스에 투여합니다.
   2. 추가 마취를 위해 마우스를 마취 테이블로 옮깁니다.
   3. 마우스의 저체온증 가능성을 줄이려면 방사선 조사를 받고 마취된 마우스를 37°C로 설정된 온도 조절 가열 패드에 놓습니다.
   4. 완전히 마취된 후 마우스가 머리를 오른쪽을 향하도록 마우스를 왼쪽 측면 누운 자세로 놓습니다.
   5. 눈을 돌출시키려면 머리 꼭대기와 턱선을 따라 손가락을 놓습니다. 피부를 부드럽게 앞뒤로 당깁니다.
   6. 25G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 5.1.5단계에서 얻은 CD45.1⁺ 마우스의 in vivo osteo-organoid 유래 세포 현탁액 또는 천연 골수 유래 세포 현탁액 200μL를 흡인합니다.
   7. 바늘을 약 30° 각도로 비스듬하게 내측 안각에 조심스럽게 삽입합니다.
      참고: 주사는 일반적으로 바늘이 위로 향하게 하여 주사를 주사하지만 후안와 주사의 경우 눈 손상 위험을 줄이기 위해 바늘 경사를 아래로 배치하는 것이 좋습니다.
   8. 바늘 끝이 눈 바닥에 올 때까지 바늘을 사용하여 안구 가장자리를 따라 아래로 내려갑니다.
   9. 천천히 부드럽게 주입액을 주입합니다.
   10. 주입이 완료된 후 회복을 위해 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.

6. 치료 효과 평가

1. 혈액학적 분석
   참고: 면역 체계 재구성 분석에서 수혜자의 혈액학을 분석하기 위해 0 Gy PBS 치료, 5 Gy PBS 치료, 5 Gy 네이티브 BM 치료 및 5 Gy 골 오가노이드 치료와 같은 다양한 치료를 받은 수혜자로부터 말초 혈액 샘플을 수집했습니다. 혈액 샘플은 이식 2일 전과 이식 후 2, 4, 8, 12, 16주에 역안와 천자를 통해 채취했습니다. 같은 그룹의 혈액 샘플 중 일부는 혈액 분석에 사용되었고, 다른 부분은 키메라 분석에 사용되었습니다. 턱밑 정맥 또는 꼬리 정맥과 같은 다양한 혈액 샘플링 방법이 있습니다. 후방안와천자는 생쥐의 혈액 채취를 위한 일반적인 방법 중 하나이며 윤리적 조건 하에서 허용됩니다.
   1. 5.2.1-5.2.5 단계를 반복하여 마우스를 마취하고 마우스의 눈을 돌출시킵니다.
      참고: 동물에 대한 피해를 완화하기 위해 역안와 천자 혈액 샘플링 전에 이소플루란 마취를 마우스에 투여합니다.
   2. 직경 0.5mm의 모세혈관을 눈의 내측각에 배치하고 코의 평면을 기준으로 30°-45° 각도로 꼬리 방향으로 향하게 합니다.
   3. 압력을 가하면서 모세관 튜브를 부드럽게 회전시켜 결막을 통해 침투할 수 있도록 합니다. 모세혈관 작용을 통해 혈액이 모세혈관으로 흐르도록 합니다.
   4. 혈액이 흐르기 시작한 후에도 흐름을 유지하기 위해 지속적인 압력을 가하십시오.
   5. 100μL의 혈액을 채취한 후 즉시 목에 가해지는 압력을 해제합니다. 동시에 모세혈관을 제거하여 눈이 정상 위치로 돌아갈 수 있도록 하여 천자 부위에서 수술 후 출혈을 방지합니다.
   6. 1.5%(w/v) 에틸렌디아민 테트라아세트산 디칼륨 염 이수화물(EDTA-K2) 용액으로 세척한 다음 1.5%(w/v) EDTA-K2 용액 10μL를 첨가한 원심분리 튜브로 혈액을 즉시 배출합니다. EDTA-K2 용액과 혈액이 완전히 혼합되도록 원심분리기 튜브를 부드럽게 흔들어 응고를 방지합니다.
   7. 멸균 솜으로 상처를 닦고 출혈이 멈추도록 약간의 압력을 가한 후 지혈 후 1-2분 동안 쥐를 관찰하여 이상이 없는지 확인한 다음 우리로 되돌립니다.
   8. 혈액학 분석기를 사용하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC) 및 혈소판(PLT)의 수를 포함하여 각 그룹의 혈액 샘플 일부에 대한 혈액학적 분석을 수행합니다.
      참고: 채취 후 2시간 이내에 모든 혈액 샘플을 분석하십시오.
2. 말초 혈액 키메라 분석
   참고: 혈액학적 분석과 유사하게, 이식 후 2주, 4주, 8주, 12주, 16주에 후방천자에 의해 5 Gy native BM 치료 및 5 Gy osteo-organoid 치료 그룹의 말초 혈액 샘플을 수집했습니다.
   1. 6.1단계에서 얻은 말초 혈액 샘플의 다른 부분을 말초 혈액 키메라 분석을 위해 사용합니다.
   2. 1mL의 적혈구 용해 완충액을 샘플에 추가하고 3-5분 동안 용해합니다. 적혈구의 더 나은 용해를 촉진하기 위해 샘플을 거꾸로 부드럽게 뒤집습니다.
   3. 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
   4. 상등액을 버리고 HBSS 1mL(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)를 첨가하여 펠렛을 재현탁합니다.
   5. 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 사용하고 상층액을 버립니다. 원심분리 튜브 바닥에 있는 약 100μL의 세포를 4°C에서 30분 동안 염색하며, 생염색키트, PE-anti-CD45.1 (1:200), Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200), Allophycocyanin (APC)-anti-CD3e (1:200) 등의 항체를 사용하여 염색합니다.
   6. HBSS 1mL(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)와 300 × g 의 원심분리로 4°C에서 5분 동안 세포를 재현탁합니다.
   7. 상층액을 흡인하고 300μL의 HBSS(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)로 세포를 재현탁합니다.
   8. 현탁액을 소용돌이하여 추가 유세포 분석 분석을 수행합니다.
   9. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 얻은 데이터를 추가로 분석하여 5 Gy 네이티브 BM 처리 그룹과 5 Gy 골 오가노이드 처리 그룹 모두에서 수용 마우스의 말초 혈액에서 HSPC의 키메라 속도에 대한 정보를 얻습니다.
      참고: 유세포 분석 데이터의 분석은 CD45.2 수용자의 말초 혈액에서 donor 유래 CD45.1⁺ 세포를 식별하는 데 사용되는 일반적인 게이팅 전략에 대한 보충 그림 S2를 참조하십시오.
   10. 3.4.11-3.4.12단계를 반복하여 살아있는 세포에 해당하는 영역을 게이트합니다.
   11. 말초 혈액 키메라를 분석하려면 초기에 세포 집단을 식별하고 이후에 기증자와 수용 세포를 식별합니다.
       1. 살아있는 세포 내에서 항체 표지된 특정 세포를 스크리닝합니다. X축으로 CD11B-AF700을 선택하고 Y축으로 B220-PE-Cy7을 선택합니다. B220⁺CD11b^- 세포는 B 세포, B220-CD11b⁺ 세포는 골수성 세포, B220-CD11b^- 세포는 이중 음성(DN) 세포로 게이트합니다.
       2. X축에는 CD3-APC를, Y축에는 SSC-A를 사용하여 DN 셀 게이트를 두 번 클릭합니다. CD3⁺ 세포를 T 세포로 게이트합니다.
       3. CD3⁺ 셀 게이트를 두 번 클릭하고 X축으로 CD4-PE-Dazzle594를 선택하고 Y축으로 CD8-PerCp-Cy5.5를 선택합니다. CD8⁺CD4^- 세포는 세포독성 T 세포(CTL)로, ^CD8-CD4+ 세포는 조절 T 세포(Treg)로 게이트합니다.
   12. 마지막으로, 말초 혈액 키메라 분석은 기증자와 수혜자 세포에 대해 수행됩니다. 지정된 세포 집단 내에서 X축으로 CD45.1-PE를 두 번 클릭하고 Y축으로 CD45.2-FITC 를 선택합니다. CD45.1⁺ 세포를 게이트하고 세포 계수를 수행하여 세포 집단 내 CD45.1⁺ 세포의 비율을 측정하여 키메라 속도를 반영합니다.
3. 고형 장기 키메라 분석
   참고: 이식 후 16주에 BM, 비장 및 흉선 키메라를 5 Gy BM 치료군과 5 Gy 골오가노이드 치료군에서 분석했습니다.
   1. 5.1.1-5.1.4 단계를 반복하여 BM에서 파생된 세포 펠릿을 얻습니다.
   2. HBSS 1mL(Ca²⁺ 없음, Mg²⁺ 없음)가 들어 있는 세포 배양 접시(6cm) 위에 300메쉬 나일론 필터를 놓습니다.
   3. 절개된 비장이나 흉선을 나일론 필터에 놓습니다.
   4. 5mL 주사기의 전면 고무 마개를 사용하여 명백한 조직 구조가 남지 않고 잔류 섬유 조직만 남을 때까지 언급된 장기를 갈아줍니다. 세포 생존력을 보장하기 위해 세포를 부드럽게 다루십시오.
   5. 여과액과 원심분리를 300 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 수집합니다.
   6. 비장 또는 흉선에서 유래한 세포 침전물을 얻기 위해 상등액을 제거합니다.
   7. 6.3.1 및 6.3.6 단계에서 얻은 세포 펠릿에 적혈구 용해 완충액 1mL를 추가하고 3-5분 동안 용해합니다.
   8. 염색 및 유세포 분석을 위해 6.2.3-6.2.8 단계를 반복합니다.
   9. 5 Gy 네이티브 BM 처리 그룹과 5 Gy 골 오가노이드 처리 그룹 모두에서 수용 마우스의 고형 장기(BM, 비장 및 흉선)에서 HSPC의 키메라 속도에 대한 정보를 얻기 위해 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 얻은 데이터를 추가로 분석합니다.
      참고: 유세포 분석 데이터의 분석은 CD45.2 수용자의 BM, 비장 및 흉선에서 공여체 유래 CD45.1⁺ 세포를 식별하는 데 사용되는 일반적인 게이팅 전략에 대한 보충 그림 S2를 참조하십시오.
   10. 6.2.10-6.2.12 단계의 말초 혈액을 BM, 비장 및 흉선으로 교체하여 고형 장기의 키메라 속도를 얻습니다.

결과

프로토콜에 따라 멸균 상태에서 분해성 젤라틴 스펀지에 BMP-2를 떨어뜨려 생체 활성 골격을 만들었습니다. 그런 다음 골격을 마우스의 하지 근육에 이식하여 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 12주간의 잠복기 후, 골오가노이드에 대한 거시적 사진, 조직학적 분석 및 유세포 분석 분석을 수행했습니다(그림 1A). 젤라틴 스펀지를 5mm x 5mm x...

토론

이 프로토콜에서는 BMP-2가 로드된 젤라틴 스폰지 스캐폴드를 이식하여 골수와 같은 구조를 가진 in vivo osteo-organoids를 확립하는 접근 방식을 제시합니다. 당사는 이러한 in vivo osteo-organoids가 장기간(12주 이상)에 걸쳐 치료용 HSPC를 안정적으로 생산할 수 있음을 입증했습니다. 세포를 로드하는 기존의 체외 확장 또는 생체 내 배양 방법과 비교하여,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.