Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، أنشأنا في الجسم الحي عضيات عظم العظام التي يتم تشغيلها بواسطة سقالات الجيلاتين المحملة بالبروتين المورفولوجي للعظام 2 لحصاد الخلايا الجذعية / السلفية العلاجية المكونة للدم لإعادة بناء الجهاز المناعي المكونة للدم التالف. بشكل عام ، يمكن أن يوفر هذا النهج مصدرا واعدا للخلايا للعلاجات الخلوية.

Abstract

تتطلب زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT) عددا كافيا من الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم العلاجية (HSPCs). لتحديد مصدر مناسب ل HSPCs ، قمنا بتطوير عظام عضوية في الجسم الحي عن طريق زرع سقالات محملة ببروتين مورفوجيني للعظام البشرية المؤتلف -2 (rhBMP-2) في كيس عضلي داخلي بالقرب من عظم الفخذ في الفئران. بعد 12 أسبوعا من الزرع ، استرجعنا العظام العضوية في الجسم الحي وأجرينا تحليل قياس التدفق الخلوي على HPSCs ، مما كشف عن وجود كبير لمجموعات فرعية HSPC داخل العظم العضوي في الجسم الحي .

ثم أنشأنا نموذجا شبه مميت لإصابة المكونة للدم / الجهاز المناعي في الفئران من خلال الإشعاع وأجرينا زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT) عن طريق حقن الخلايا المشتقة من العظم العضوي المستخرجة في الدم المحيطي للفئران المشعة. تم تقييم تأثير التعافي المكونة للدم من خلال تحليلات الدم والوهم الدموي المحيطي وخيميرية الأعضاء الصلبة. أكدت النتائج أن الخلايا المشتقة من العظم العضوي في الجسم الحي يمكنها إعادة بناء الأعضاء المناعية الطرفية والصلبة التالفة بسرعة وكفاءة في الفئران المشععة. ينطوي هذا النهج على إمكانات كمصدر بديل ل HSPCs ل HSCT ، مما يوفر فوائد لعدد أكبر من المرضى.

Introduction

يقف زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم كعلاج تقليدي لمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة الدموية ، بالإضافة إلى العديد من اضطرابات المناعة الذاتية الموروثةوالمناعة الذاتية 1،2،3،4. ومع ذلك ، فقد ظهرت الكمية والأصل المحدودان للخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم (HSPCs) كعائق كبير أمام التنفيذ السريري لزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT) 5،6.

يعد توسيع الخلايا المختبرية على نطاق واسع طريقة شائعة الاستخدام لحصاد الخلايا العلاجية5،7. طورت دراسات مختلفة ظروفا تحفز HSPCs على التجديد الذاتي في المختبر ، عادة من خلال استخدام مزيج من ناهضات التجديد الذاتي (مثل السيتوكينات وعوامل النمو) وألبومين المصل ، مما يؤدي إلى التوسع خارج الجسم الحي ل HSPCs8. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن الأساليب الحالية لا تزال تستغرق وقتا طويلا وتصعب للحفاظ على قدرة التجديد الذاتي ل HSPCsالموسعة 9.

على عكس الطريقة المذكورة أعلاه ، فإن حصاد الخلايا في الجسم الحي يقدم استراتيجية جديدة ومبتكرة. يتضمن هذا النهج إنشاء عظام عضوية في الجسم الحي تحاكي بنية نخاع العظم الأصلي10،11. لتحقيق ذلك ، نقوم بتشكيل عضيات عظمية في الجسم الحي باستخدام سقالات الجيلاتين المحملة بالبروتين المورفولوجي الوراثي للعظام -2 (BMP-2) للحصول على كوكتيلات خلوية ذاتية وفيرة وعالية الجودة ، بما في ذلك HSPCs. من خلال التطبيق العلاجي لهذه العظام العضوية ، نجحنا في معالجة أضرار التشعيع وأظهرنا أن HSPCs المشتقة من العظم العضوي يمكنها إعادة تكوين جهاز المناعة الضعيف تجريبيا بسرعة وثبات.

Protocol

تم تضمين ذكور وإناث الفئران C57BL / 6 ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع ، في الدراسة. تم إيواء جميع الفئران في منشأة التابعة لجامعة شرق الصين للعلوم والتكنولوجيا. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة شرق الصين للعلوم والتكنولوجيا (ECUST-21010).

1. تصنيع السقالة النشطة بيولوجيا

  1. اعداد
    1. ضع المقص والملاقط الجراحية النظيفة والمجففة في دورق سعة 1,000 مل. لف فم الدورق بورق ماص واربطه بإحكام بخيط قطني.
    2. ضع الدورق في جهاز التعقيم عالي الضغط ، وأغلق الغطاء بإحكام ، واضبط برنامج التعقيم على 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وابدأ برنامج التعقيم.
    3. بعد الانتهاء من عملية التعقيم ، قم بإزالة الدورق المعقم ونقله إلى فرن تجفيف على درجة حرارة 60 درجة مئوية للتجفيف. بمجرد أن يجف تماما ، رش الدورق بالكحول بنسبة 75٪ (v / v) وضعه على المقعد النظيف.
    4. قم بإذابة محلول مخزون rhBMP-2 (1.0 مجم / مل) قبل ساعتين من الإجراء.
    5. بمجرد إذابته إلى درجة حرارة الغرفة ، انقل محلول مخزون rhBMP-2 وإسفنجة الجيلاتين غير المفتوحة إلى المقعد النظيف المعقم لتصنيع السقالات النشطة بيولوجيا.
      1. قم بتقطيع إسفنجة الجيلاتين (60 مم × 20 مم × 5 مم) إلى 48 قطعة بحجم موحد (5 مم × 5 مم × 5 مم) (الشكل 1 ب) بالمقص المعقم وانقلها إلى لوحة 48 بئرا.
      2. امزج محلول مرق rhBMP-2 عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل برفق لضمان الخلط المتساوي ، مع الحرص على تجنب الفقاعات. استنشق 30 ميكرولتر من المحلول وأضفه بالتنقيط إلى إسفنجة الجيلاتين.
      3. أغلق اللوحة المكونة من 48 بئرا باستخدام طبقة واحدة من البارافيلم لتسهيل عملية التجفيف بالتجميد اللاحقة. أخرج الطبق الذي يحتوي على إسفنجة الجيلاتين من المقعد النظيف. ضعه في درجة حرارة -20 درجة مئوية ليتم تجميده. في نفس الوقت ، قم بتشغيل مجفف التجميد وقم بتبريده مسبقا إلى درجة حرارة تتراوح من -50 درجة مئوية إلى -60 درجة مئوية.
      4. بعد التجميد لمدة ساعتين ، ضع طبق البئر مع إسفنج الجيلاتين في مجفف التجميد لمدة 12 ساعة. للحفاظ على جفاف وعقم العينات ، ضع طبقة إضافية من البارافيلم لإغلاق صفيحة البئر بعد التجفيف بالتجميد. قم بتخزينه في ثلاجة -20 درجة مئوية.

2. الزرع الجراحي للسقالات النشطة بيولوجيا

ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية للاستخدام.

  1. صيام الفئران لمدة 1 ساعة قبل التخدير. ضع مرهما بيطريا مزحما حول عيون الفئران لتقليل الانزعاج بعد الجراحة الناجم عن الجفاف في منطقة العين. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول 1٪ (وزن / حجم) من الصوديوم البنتوباربيتال (بجرعة 48 مجم / كجم).
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول طريقة التخدير المعتمدة أخلاقيا مع حقن البنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى ، مثل استنشاق الأيزوفلوران أو الحقن داخل الصفاق للكيتامين - زيلازين ، بعد الموافقة.
  2. تأكد من عمق التخدير في الفئران من خلال البحث عن العلامات التالية في الفأر المستلق: ثبات ضربات القلب والتنفس ، واسترخاء العضلات ، والأطراف غير المتحركة ، والشعيرات التي لا تستجيب للمس ، وعدم وجود منعكس الدواسة. بالإضافة إلى ذلك ، اضغط على جلد الفئران بالملقط المسنن أو حفز أصابع أو أقدام الفئران. إذا أظهرت الفئران ردود فعل حساسة ، يكون التخدير خفيفا جدا ؛ قم بإجراء تخدير إضافي. بعد تحقيق مستوى التخدير ، انقل الفئران إلى المنطقة الجراحية في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن لزرع السقالة النشطة بيولوجيا في الساق اليسرى بسهولة.
  3. احلق شعر الساق اليسرى باستخدام آلة الحلاقة. تطهير المنطقة المحلوقة باستخدام جولات متناوبة من الكلورهيكسيدين والكحول 3 مرات لكل منهما ، وقم بعمل شقوق في الساق الخلفية ، الموجودة على الجانب الجانبي من العضلة الجانبية الواسعة. استخدم مقص العيون لعمل شقوق بطول 3.0 مم تقريبا ، تمتد على طول اتجاه الظنبوب.
    ملاحظة: للحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة ، يجب تخزين العناصر الجراحية المستخدمة في أماكن محددة. يجب وضع المستلزمات المعقمة في مكان نظيف لمنع ملامسة الأفراد بخلاف المشغل. يجب تطهير الأدوات الجراحية القابلة لإعادة الاستخدام على الفور باستخدام 75٪ (حجم / حجم) من الإيثانول. تقليل مدة الجراحة لتقليل تعرض الجروح للهواء وتقليل خطر الإصابة بالعدوى.
  4. لإنشاء جيب للزرع، افتح اللفافة في الجانب البعيد من العضلة الجانبية الواسعة، باتجاه الظنبوب.
  5. استخدم ملقط العين لتشكيل السقالة النشطة بيولوجيا في أسطوانة يبلغ ارتفاعها حوالي 5 مم وقطرها 5 مم. ازرع السقالة في جيب العضلات على طول الشق العضلي الناتج عن مقص العيون وأغلق جيب الغرسة بنمط خياطة متقطعة عبر اللفافة. أغلق شق الجلد باستخدام خياطة 4-0.
    ملاحظة: يشير حدوث التشنجات أو التبول في أثناء العملية الجراحية إلى تخدير عميق للغاية ، مما يستلزم التنفيذ الفوري لتدابير الطوارئ.
  6. كرر الخطوات 2.3-2.5 وزرع سقالة أخرى نشطة بيولوجيا في كيس عضلة الفخذ اليمنى للفئران. استخدم مسحات اليود لتنظيف مواقع الجراحة والحقن للفئران بعد الجراحة لمنع العدوى.
    ملاحظة: يمكن إدخال غرسة واحدة فقط في كل عضلة جانبية واسعة.
  7. ضع الفئران على منصة درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية حتى تستيقظ بعد التجربة. اقلب الفئران كل 10-15 دقيقة لمنع تجمع الدم. بعد الجراحة ، بالإضافة إلى الحفاظ على الدفء ، راقب الفئران بعد الجراحة دون ترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. انتبه جيدا للمؤشرات المهمة للفئران ، مثل معدل ضربات القلب ومعدل التنفس.
    ملاحظة: ارتعاش الأطراف الأمامية في الفئران يدل على بدء مرحلة الشفاء.
  8. ضع الفئران مرة أخرى في قفص معقم تم تطهيره برش الكحول والأشعة فوق البنفسجية. لا تضع الذي خضع لعملية جراحية مع أخرى حتى يتعافى تماما. بالإضافة إلى ذلك، يتم تطبيق ميلوكسيكام للتحكم في ألم ما بعد الجراحة لمدة يوم واحد على الأقل، مع خيار التمديد حتى ثلاثة أيام للتحكم في الألم بشكل أكثر كثافة. افحص والجرح بانتظام خلال فترة ما بعد الجراحة التي تبلغ 72 ساعة لتحديد أي آثار ضارة محتملة. إذا تم الكشف عن العدوى في وقت لاحق ، فقم بالقتل الرحيم للحيوانات عن طريق تخدير الفئران أولا عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول 1٪ (وزن / حجم) من البنتوباربيتال الصوديوم (بجرعة 48 مجم / كجم) ، متبوعا بخلع عنق الرحم بعد التخدير.

3. توصيف العظام العضوية في الجسم الحي بعد 12 أسبوعا من الزرع

ملاحظة: سوف تتطور السقالات النشطة بيولوجيا في الجسم الحي لتشكيل عضيات عظمية بعد الزرع.

  1. مجموعة من العظام العضوية في الجسم الحي
    1. عندما يتم زرع العظام العضوية في الجسم الحي لمدة 12 أسبوعا ، قم بتخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1٪ (وزن / حجم) محلول من الصوديوم البنتوباربيتال (بجرعة 48 مجم / كجم) ، متبوعا بخلع عنق الرحم بعد التخدير.
      ملاحظة: لتقليل الضرر الذي يلحق بالحيوانات ، يجب تخدير الفئران قبل القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. رش 75٪ كحول (حجم / حجم) على الجلد في موقع التشريح.
    3. افصل الطرف الخلفي عن الجذع وقم بإزالة العضلات من عضيات العظام باستخدام مقص مصغر بعناية.
    4. قم بإزالة الأنسجة الرخوة المرفقة بالشاش.
    5. قم بإصلاح بعض العظم العضوي في محلول بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪ (v / v) لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للتحليل النسيجي. استخدم العينات المتبقية للتصوير العياني وتحليل قياس التدفق الخلوي ل HPSCs.
  2. الصور العيانية
    1. ضع العظم العضوي على لوحة خلفية زرقاء وقم بتصويرها بكاميرا رقمية.
  3. التحليل النسيجي
    1. التحضير للتلوين النسيجي
      1. انقل العظم العضوي من محلول PFA إلى ماء عالي النقاء وانقعه لمدة 1 ساعة.
      2. استبدل الماء عالي النقاء بمحلول حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين 0.5 M لإزالة الكلس لمدة أسبوع واحد.
      3. ضع المناديل المنزوعة الكلس في كاسيت مدمج واغمر الكاسيت في ماء فائق النقاء لمدة 1 ساعة.
      4. للجفاف المتدرج ، اغمر كاسيت التضمين في الإيثانول بتركيزات متفاوتة (حجم / حجم): 75٪ و 80٪ و 90٪ و 95٪ لمدة ساعة واحدة لكل منهما ، متبوعا بالغمر في 100٪ (v / v) الإيثانول الأول والثاني لمدة ساعة واحدة لكل منهما.
        ملاحظة: يشير "100٪ (v/v) الإيثانول الأول والثاني" إلى أنه يجب غمر كاسيت التضمين مرة واحدة في "الحاوية I" المملوءة بالإيثانول بنسبة 100٪ (v/v) ثم غمرها مرة ثانية في "الحاوية II" المملوءة بالإيثانول بنسبة 100٪ (v/v).
      5. بعد الجفاف ، ضع الأنسجة المضمنة بالتتابع في خليط من 100٪ (v / v) الزيلين والإيثانول المطلق (الزيلين: نسبة حجم الإيثانول 1: 1) لمدة ساعة واحدة و 100٪ (v / v) الزيلين الأول والثاني لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
      6. اغمر الأنسجة في البارافين الأول والثاني عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 60 درجة مئوية لمدة ساعتين لكل منهما.
      7. لتضمين المناديل المنقوعة في الشمع باستخدام آلة التضمين ، ضع الشمع المذاب في قالب التضمين. قبل أن يتجمد الشمع ، قم بإزالة الأنسجة من حاوية الجفاف وضعها في قالب التضمين ؛ قم بتسميتهم وفقا لذلك. قم بتبريد القالب عند حالة التجميد -20 درجة مئوية وبعد أن يصلب الشمع ، قم بإزالة كتلة الشمع من قالب التضمين وقم بقصها.
      8. قم بتقطيع كتل الشمع المدمجة إلى أقسام بسمك 4.5 ميكرومتر باستخدام قطاعة البارافين ثم قم بلصق الأقسام على شرائح زجاجية.
      9. اخبز الأقسام لفترة وجيزة على حرارة 40 درجة مئوية ثم اجمعها واحفظها في صندوق عينة.
    2. تلطيخ H& E
      1. ضعي الأقسام في رف عينات واخبزيها في فرن تجفيف على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      2. إزالة البارافينات الأقسام في الزيلين والإيثانول. ضع أقسام البارافين بالتتابع في الزيلين الأول لمدة 10 دقائق ، والزيلين الثاني لمدة 10 دقائق ، والزيلين الثالث لمدة 10 دقائق ، والإيثانول الأول المطلق لمدة 5 دقائق ، والإيثانول المطلق الثاني لمدة 5 دقائق ، و 90٪ (حجم / حجم) الإيثانول لمدة 5 دقائق ، و 80٪ (حجم / حجم) الإيثانول لمدة 5 دقائق ، و 70٪ (حجم / حجم) الإيثانول لمدة 5 دقائق ، و 50٪ (v / v) الإيثانول لمدة 5 دقائق ، ونقل إلى ماء نقي لعملية إزالة الشمع المتدرج.
      3. اغمر الأقسام في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين ، ثم اشطفها بالماء الجاري لمدة 10 دقائق.
      4. اغمر الأقسام في محلول تلطيخ اليوزين لمدة 2 دقيقة.
      5. ضع الأقسام بالتتابع في 75٪ (v / v) من الإيثانول لمدة دقيقتين ، و 85٪ (v / v) من الإيثانول لمدة دقيقتين ، والإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق ، والإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق ، والزيلين لمدة 5 دقائق للجفاف.
      6. أخرج الأقسام من الزيلين وأغلقها بالبلسم المحايد.
      7. راقب الأقسام الموجودة أسفل المجهر والتقط صورا تمثيلية بتكبير 10 أضعاف بعد جفاف البلسم المحايد.
  4. تحليل قياس التدفق الخلوي ل HPSCs
    1. ضع العضيات العظمية في الجسم الحي التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.1 في ملاط وأضف كمية مناسبة من المخزن المؤقت للتلطيخ. قم بتقطيع عضيات العظام إلى شظايا بقطر 1-3 مم باستخدام مقص العيون وسحقها في مخزن التلوين باستخدام الهاون والمدقة. اضغط عموديا بدلا من طحن شظايا العظام العضوية في الجسم الحي باستخدام مدقة لمنع انخفاض معدل بقاء الخلايا.
    2. اجمع معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي وقم بتشغيله عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لتحلل الخلايا لمدة 3-5 دقائق.
    4. اغسل الخلايا ب 1 مل من محلول التلوين وقم بتصفيتها من خلال مرشح نايلون شبكي 300 في أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 مل.
    5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. قم بتلطيخ ما يقرب من 100 ميكرولتر (خلايا) المتبقية في الجزء السفلي من أنبوب قياس التدفق الخلوي عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام الأجسام المضادة ، بما في ذلك مجموعة تلطيخ حية / ميتة ، بروتين بيريدينين كلوروفيل - سيانين 5.5 (PerCp-Cy5.5) - كوكتيل مضاد للنسب (1:10) ، Phycoerythrin-Cyanine5 (PE-Cy5) - مضاد ل c-kit (1:200) ، Alexa Fluor 700 (AF700) - مضاد للخلايا الجذعية -1 (Sca-1) (1: 200) ، Brilliant Violet 711 (BV711) - مضاد ل CD16 / 32 (1:200) ، مضاد حيوي ل CD34 (1:200) ، BV421-anti-CD127 (1: 200) ، PE-CF594-anti-CD135 (1: 200) ، BV510-anti-CD48 (1: 200) ، و PE-Cy7-anti-CD150 (1: 200).
    6. أعد تعليق الخلايا ب 1 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) بدون Ca2+ و Mg2+ وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. استنشق المادة الطافية والبقعة بالجسم المضاد الثانوي PE-streptavidin (1: 200) لمدة 60 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية.
    8. أعد تعليق الخلايا ب 1 مل من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+) وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 300 ميكرولتر من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+).
    10. دوامة الحل لإجراء مزيد من تحليل قياس التدفق الخلوي. قم بتحليل البيانات التي تم الحصول عليها بشكل أكبر باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي للحصول على بيانات كمية عن HSPCs.
      ملاحظة: يشير جمع البيانات وتحليلها لقياس التدفق الخلوي إلى مقالاتنا السابقة والمواد الداعمة (الشكل التكميلي S1) لاستراتيجيات البوابات النموذجية المستخدمة لتحديد HSPCs10.
    11. قم بإنشاء مخطط نقطي لمنطقة التشتت الجانبي (SSC-A) مقابل منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) وبوابة المنطقة المحيطة بمجموعة الخلايا ذات الأهمية (P1) في مخطط SSC-A مقابل FSC-A أثناء الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة P1 ؛ حدد ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) للمحور X وعرض التشتت الأمامي (FSC-W) للمحور Y لإجراء معالجة التصاق الخلية الأولى. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة الخلايا المفردة ؛ حدد ارتفاع التشتت الجانبي (SSC-H) للمحور X وعرض التشتت الجانبي (SSC-W) للمحور Y لإجراء معالجة التصاق الخلية الثانية. استخدم أداة البوابة المستطيلة لتحديد الخلايا المفردة.
    12. استبعاد الخلايا الميتة. التمييز بين الخلايا الحية والخلايا الميتة عن طريق الكشف عن علامات الجدوى. قم بإنشاء مخطط نقطي ل SSC-A مقابل Live / Dead وبوابة المنطقة المقابلة للخلايا الحية ، وأطلق عليها اسم "الخلايا الحية".
    13. فحص الخلايا المصنفة بأجسام مضادة محددة في "الخلايا الحية". استبعاد مجموعة الخلايا التي قد تتأثر بالتعبير الإيجابي عن الأجسام المضادة الخاصة بالنسب في سلالة الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم النخاعي باستخدام بوابات السلبية للنسب (لين). بوابة الخلايا الخطية .
    14. فحص مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا داخل الخلايا الخطية. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة خلايا الخط. حدد Sca-1-AF700 للمحور X و c-kit-PE-Cy5 للمحور Y. قم ببوابة خلايا c-kit + Sca-1- كخلايا LKS- ، وخلايا c-kit + Sca-1 + كخلايا LKS + ، والخلايا ذات التعبير المنخفض عن c-kit و Sca-1 مثل خلايا LKloSlo. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة LKS- وحدد CD34-PE للمحور X و FCγR-BV711 للمحور Y. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة LKS + ؛ حدد FIt3-PE-CF594 للمحور X و IL7Rα-BV421 للمحور Y وحدد CD150-PE-Cy7 للمحور X و CD48-BV510 للمحور Y.
    15. بناء على خصوصية الأجسام المضادة ، حدد البوابات الموجبة أو السالبة للتمييز بين المجموعات السكانية الفرعية للخلايا: الخلايا الجذعية المكونة للدم (Lin−c-kit + Sca-1 + CD48−CD150 +) والأسلاف المكونة للدم المتمايزة: أسلاف متعددة القدرات (Lin−c-kit + Sca-1 + CD48−CD150−) ، الأسلاف اللمفاوية الشائعة (Lin−c-kit-Sca-1-Flt3 + IL7Rα +) ، أسلاف النخاع النخاعي الشائعة (Lin −c-kit + Sca-1 − CD34 + FCγR −) ، أسلاف الخلايا الحبيبية وحيدة الخلايا (Lin −c-kit + Sca-1 − CD34 + FCγR +) ، وأسلاف كريات النواة الحمر (Lin −c-kit + Sca-1 − CD34 −FCγR −).

4. نموذج تشعيع الفأر

ملاحظة: تم تشعيع الفئران C57BL / 6 بالأشعة السينية باستخدام مشع بالأشعة السينية.

  1. لتحقيق ضعف شبه مميت في الجهاز المكونة للدم / المناعة ، قم بتعريض الفئران من النوع البري (WT) في المجموعة المعالجة بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات 5 رمادي (Gy) (PBS) ، والمجموعة المعالجة بنخاع العظم الأصلي 5 Gy (BM) ، والمجموعة المعالجة بالعظام العضوية 5 Gy إلى تشعيع 5 Gy (1.25 Gy / دقيقة) قبل 24 ساعة من الزرع.
    ملاحظة: تأكد من أن الفئران WT في المجموعة المعالجة ب 0 Gy PBS تعالج ب PBS ولا تخضع للإشعاع.

5. عملية العلاج بالخلايا

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات في ظروف معقمة.

  1. اكتساب الخلايا المشتقة من نخاع العظام المشتقة من العظم العضوي في الجسم الحي
    1. زرع سقالتين نشطتين بيولوجيا في كيس العضلات للفئران C57BL / 6.SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ (CD45.1) واحتضانها لمدة 12 أسبوعا لتشكيل العضيات العظمية في الجسم الحي . احصد اثنين من العظام العضوية في الجسم الحي واثنين من عظم الفخذ من فئران CD45.1 المذكورة أعلاه. بعد ذلك ، قم بتنظيف الأنسجة الرخوة على سطح العظام العضوية وعظم الفخذ باستخدام الملقط والشاش.
    2. ضع عضيات العظام وعظم الفخذ بشكل منفصل في الهاون وأضف 1 مل من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+).
      ملاحظة: يمكن أن يقلل HBSS بدون Ca2+ و Mg2+ من تراكم الخلايا. يجب ألا يحتوي المحلول المستخدم للزراعة على مكونات مصل لتجنب أي تفاعلات رفض محتملة.
    3. قم بقص العينات بمقص جراحي وسحقها برفق في هاون ومدقة.
    4. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق كريات الخلية ب 300 ميكرولتر من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+). امزج جيدا للحصول على تعليق الخلايا المشتقة من العظم العضوي أو خلايا نخاع العظم الكاملة.
      ملاحظة: للاستفادة الكاملة من كوكتيلات الخلايا المشتقة من العظم العضوي في الجسم الحي ، اخترنا استخدام خلايا نخاع العظم الكامل للعلاج. العدد النموذجي للخلايا الإجمالية في 30 ميكروغرام BMP-2 المستحثة في الجسم الحي العظم العضوي هو 30،000،000-40،000،000.
  2. حقن الجيوب الأنفية الوريدية المدارية
    ملاحظة: تم حقن خلايا نخاع العظم الكاملة CD45.1 + التي تم جمعها من عضيات العظام أو عظم الفخذ في الجسم الحي من خلال الجيوب الأنفية الوريدية المدارية في متلقي C57BL / 6 (CD45.2) القابل للإشعاع تحت الفهة ، على التوالي. يعد حقن الجيوب الأنفية الوريدية المدارية وحقن وريد الذيل من الطرق الشائعة الاستخدام في التجارب على. تم اختيار حقن الجيوب الأنفية الوريدية المدارية بسبب بساطتها وانخفاض معدل فشلها للمبتدئين. أثناء عملية الحقن المداري ، يجب اتخاذ بعض التدابير الوقائية ، مثل التخدير المسبق للفئران ، واستخدام صفيحة ساخنة لتقليل خطر انخفاض حرارة الجسم ، وتقييد الفئران ميكانيكيا لمنع الحركة.
    1. ضع الفئران CD45.2 في غرفة ما قبل التخدير وقم بالتخدير باستخدام الأيزوفلوران. ضع مرهما بيطريا مزحما حول عيون الفئران لمنع الجفاف ومواجهة تهيج العين الناجم عن الأيزوفلوران.
      ملاحظة: لتقليل الضرر الذي يلحق بالحيوانات ، يتم إعطاء تخدير الأيزوفلوران للفئران قبل حقن الجيوب الأنفية الوريدية المدارية.
    2. انقل الفئران إلى طاولة التخدير لمزيد من التخدير.
    3. لتقليل احتمالية انخفاض حرارة الجسم في الفئران ، ضع الفأر المشع والمخدر على وسادة تسخين ثرموستاتي مضبوطة على 37 درجة مئوية.
    4. ضع الفأر في الاستلقاء الجانبي الأيسر بحيث يكون رأسه متجها إلى اليمين بعد التخدير الكامل.
    5. لإبرازات العين ، ضع إصبعا على الجزء العلوي من الرأس وعلى طول خط الفك. اسحب الجلد برفق للخلف ولأسفل.
    6. استخدم حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 25 جم لشفط 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المشتق من العظم العضوي في الجسم الحي أو تعليق الخلية الأصلي المشتق من نخاع العظام للفئران CD45.1+ التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.5.
    7. أدخل الإبرة بعناية ، شطبة لأسفل ، بزاوية حوالي 30 درجة ، في القنطرة الإنسية.
      ملاحظة: عادة ما يتم إعطاء الحقن مع شطبة الإبرة ، ولكن بالنسبة للحقن المداري الرجعي ، من الأفضل وضع شطبة الإبرة لأسفل لتقليل خطر تلف العين.
    8. استخدم الإبرة لمتابعة حافة مقلة العين لأسفل حتى يصبح طرف الإبرة في قاعدة العين.
    9. حقن الحقن ببطء وسلاسة.
    10. بعد اكتمال الحقن ، ضع الفأر مرة أخرى في قفصه للشفاء.

6. تقييم آثار العلاج

  1. تحليل الدم
    ملاحظة: لتحليل أمراض الدم للمتلقين في فحوصات إعادة تكوين الجهاز المناعي ، قمنا بجمع عينات الدم المحيطية من المتلقين الذين خضعوا لعلاجات مختلفة: 0 علاج Gy PBS ، وعلاج 5 Gy PBS ، وعلاج 5 Gy الأصلي BM ، و 5 Gy علاج العظم العضوي. تم الحصول على عينات الدم من خلال البزل الرجعي الحجاجي قبل يومين و 2 و 4 و 8 و 12 و 16 بعد الزرع. تم استخدام جزء من عينة الدم من نفس المجموعة لتحليل الدم ، بينما تم استخدام الجزء الآخر لتحليل الوهم. هناك طرق مختلفة لأخذ عينات الدم ، مثل الوريد تحت الفك السفلي أو الوريد الذيلي. البزل الرجعي الحجاجي هو أحد الطرق الشائعة لأخذ عينات الدم في الفئران ويسمح به بموجب الشروط الأخلاقية.
    1. كرر الخطوات 5.2.1-5.2.5 لتخدير الفئران وإبرازها في عيون الفئران.
      ملاحظة: للتخفيف من الضرر الذي يلحق بالحيوانات ، يتم إعطاء تخدير الأيزوفلوران للفئران قبل أخذ عينات الدم بالثقب المداري الرجعي.
    2. ضع الأنبوب الشعري بقطر 0.5 مم في القناة الإنسية للعين وقم بتوجيهه بشكل ذيلي بزاوية 30 درجة -45 درجة بالنسبة لمستوى الأنف.
    3. قم بتدوير الأنبوب الشعري برفق أثناء الضغط ، مما يسمح له بالاختراق عبر أغشية الملتحمة. اسمح للدم بالتدفق إلى الأنبوب الشعري عن طريق العمل الشعري.
    4. ضع ضغطا مستمرا بعد أن يبدأ الدم في التدفق للحفاظ على التدفق.
    5. بعد سحب 100 ميكرولتر من الدم ، حرر الضغط على الرقبة على الفور. في نفس الوقت ، قم بإزالة الأنبوب الشعري للسماح للعين بالعودة إلى الوضع الطبيعي لمنع النزيف بعد الجراحة من موقع البزل.
    6. طرد الدم على الفور إلى أنبوب الطرد المركزي الذي تم غسله بمحلول 1.5٪ (وزن / حجم) حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك ثنائي البوتاسيوم ثنائي هيدرات الملح (EDTA-K2) ثم تمت إضافته 10 ميكرولتر من محلول EDTA-K2 بنسبة 1.5٪. رج أنبوب الطرد المركزي برفق لضمان الخلط الشامل لمحلول EDTA-K2 والدم ، مما يمنع التخثر.
    7. بعد مسح الجرح بقطن معقم والضغط قليلا لوقف النزيف ، راقب الفئران لمدة 1-2 دقيقة بعد الإرقاء للتأكد من عدم وجود تشوهات ثم إعادتها إلى أقفاصها.
    8. قم بإجراء تحليل الدم على جزء من عينات الدم لكل مجموعة باستخدام محلل أمراض الدم ، بما في ذلك تعداد خلايا الدم البيضاء (WBC) وخلايا الدم الحمراء (RBC) والصفائح الدموية (PLT).
      ملاحظة: قم بتحليل جميع عينات الدم في غضون ساعتين من الجمع.
  2. تحليل خيميرية الدم المحيطي
    ملاحظة: على غرار التحليل الدموي ، تم جمع عينات الدم المحيطية من 5 مجموعات معالجة ب BM الأصلية و 5 مجموعات Gy المعالجة بالعظم العضوي عن طريق البزل الرجعي في 2 و 4 و 8 و 12 و 16 أسبوعا بعد الزرع.
    1. استخدم الجزء الآخر من عينة الدم المحيطية التي تم الحصول عليها من الخطوة 6.1 لتحليل خيميرية الدم المحيطية.
    2. أضف 1 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء إلى العينة وقم بتحللها لمدة 3-5 دقائق. اقلب العينة رأسا على عقب برفق لتسهيل تحلل خلايا الدم الحمراء بشكل أفضل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+) لإعادة تعليق الحبيبات.
    5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. قم بتلطيخ ما يقرب من 100 ميكرولتر المتبقية من الخلايا في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام الأجسام المضادة ، بما في ذلك مجموعة تلطيخ حية / ميتة ، PE-anti-CD45.1 (1: 200) ، Fluorescein Isothiocyanate (FITC) - anti-CD45.2 (1: 200) ، PE-Cy7-anti-B220 (1: 200) ، AF700-anti-CD11b (1: 200) ، PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1: 200) ، PE-Dazzle594-anti-CD4 (1: 200) ، و Allophycocyanin (APC) - anti-CD3e (1: 200).
    6. أعد تعليق الخلايا ب 1 مل من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+) وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 300 ميكرولتر من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+).
    8. دوامة التعليق لإجراء مزيد من تحليل قياس التدفق الخلوي.
    9. قم بتحليل البيانات التي تم الحصول عليها بشكل أكبر باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي للحصول على معلومات حول معدل الخيامية ل HSPCs في الدم المحيطي للفئران المتلقية في كل من المجموعة المعالجة ب 5 Gy الأصلية BM والمجموعة المعالجة بالعظام العضوية 5 Gy.
      ملاحظة: لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي ، راجع الشكل التكميلي S2 للحصول على استراتيجيات البوابات النموذجية المستخدمة لتحديد خلايا CD45.1 + المشتقة من المتبرع في الدم المحيطي لمتلقي CD45.2.
    10. كرر الخطوات 3.4.11-3.4.12 لبوابة المنطقة المقابلة للخلايا الحية.
    11. تحليل خيميرية الدم المحيطية عن طريق تحديد مجموعات الخلايا في البداية ثم تمييز الخلايا المانحة والمتلقية لاحقا.
      1. فحص الخلايا المحددة المسماة بالأجسام المضادة داخل الخلايا الحية. حدد CD11b-AF700 للمحور X و B220-PE-Cy7 للمحور Y. قم ببوابة خلايا B220 + CD11b- كخلايا بائية ، وخلايا B220-CD11b + كخلايا نخاعية ، وخلايا B220-CD11b- كخلايا سلبية مزدوجة (DN).
      2. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة خلايا DN ، باستخدام CD3-APC للمحور X و SSC-A للمحور Y. قم ببوابة خلايا CD3 + كخلايا تائية.
      3. انقر نقرا مزدوجا فوق بوابة خلايا CD3 + ، وحدد CD4-PE-Dazzle594 للمحور X و CD8-PerCp-Cy5.5 للمحور Y. قم ببوابة خلايا CD8 + CD4- كخلايا تائية سامة للخلايا (CTL) وخلايا CD8-CD4 + كخلايا تائية تنظيمية (Treg).
    12. أخيرا ، يتم إجراء تحليل خيميرية الدم المحيطي على الخلايا المانحة والمتلقية. ضمن مجموعات الخلايا المعينة ، انقر نقرا مزدوجا لتحديد CD45.1-PE للمحور X و CD45.2-FITC للمحور Y. قم ببوابة خلايا CD45.1+ وقم بإجراء عد الخلايا لتحديد نسبة خلايا CD45.1 + داخل مجموعة الخلايا ، مما يعكس معدل الوهم.
  3. تحليل خيميرية الأعضاء الصلبة
    ملاحظة: في 16 أسبوعا بعد الزرع ، تم تحليل وهم BM والطحال والغدة الصعترية في المجموعة المعالجة ب 5 Gy BM والمجموعة المعالجة بالعظام العضوية 5 Gy.
    1. كرر الخطوات 5.1.1-5.1.4 للحصول على كريات الخلية المشتقة من BM.
    2. ضع مرشح نايلون شبكي 300 فوق طبق زراعة الخلايا (6 سم) يحتوي على 1 مل من HBSS (بدون Ca2+ ، Mg2+).
    3. ضع الطحال أو الغدة الصعترية المقطعة على مرشح النايلون.
    4. قم بطحن الأعضاء المذكورة باستخدام السدادة المطاطية الأمامية لحقنة سعة 5 مل حتى لا تبقى بنية أنسجة واضحة ، فقط الأنسجة الليفية المتبقية. تعامل مع الخلايا برفق لضمان بقاء الخلية.
    5. اجمع المرشح وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. قم بإزالة المادة الطافية للحصول على رواسب الخلية المشتقة من الطحال أو الغدة الصعترية.
    7. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوتين 6.3.1 و 6.3.6 ، وقم بالتحلل لمدة 3-5 دقائق.
    8. كرر الخطوات 6.2.3-6.2.8 للتلوين وتحليل قياس التدفق الخلوي.
    9. قم بتحليل البيانات التي تم الحصول عليها بشكل أكبر باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي للحصول على معلومات حول معدل الوهم ل HSPCs في الأعضاء الصلبة (BM والطحال والغدة الصعترية) للفئران المتلقية في كل من المجموعة المعالجة ب 5 Gy الأصلية BM والمجموعة المعالجة بالعظام العضوية 5 Gy.
      ملاحظة: لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي ، يشير إلى الشكل التكميلي S2 لاستراتيجيات البوابات النموذجية المستخدمة لتحديد خلايا CD45.1 + المشتقة من المتبرع في BM والطحال والغدة الصعترية لمتلقي CD45.2.
    10. استبدل الدم المحيطي في الخطوات 6.2.10-6.2.12 ب BM والطحال والغدة الصعترية للحصول على معدل الوهم للأعضاء الصلبة.

النتائج

وفقا للبروتوكول ، قمنا بإنشاء سقالة نشطة بيولوجيا عن طريق تقطير BMP-2 في إسفنجة جيلاتين قابلة للتحلل في ظل ظروف معقمة. ثم تم زرع السقالة في عضلات الأطراف السفلية للفئران لإنشاء عضيات عظمية في الجسم الحي . بعد فترة حضانة مدتها 12 أسبوعا ، أجرينا التصوير العياني والتحليل ...

Discussion

في هذا البروتوكول ، نقدم نهجا لإنشاء عضيات عظمية في الجسم الحي ذات هياكل تشبه نخاع العظام عن طريق زرع سقالات إسفنجية جيلاتين محملة ب BMP-2. نثبت أن هذه العضويات العظمية في الجسم الحي يمكن أن تنتج بثبات HSPCs علاجية على مدى فترة طويلة من الزمن (أكثر من 12 أسبوعا). بالمقا...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج مركز العلوم الأساسية (رقم T2288102) ، والبرنامج الرئيسي للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32230059) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32301123) ، ومركز مؤسسة علوم فرونتيرز لعلم الأحياء والكيمياء الديناميكية (رقم 1. JKVD1211002) ، مشروع Wego التابع للأكاديمية الصينية للعلوم (رقم . (2020) 005) ، مشروع المرفق الوطني للطب الانتقالي (شنغهاي) (رقم. TMSK-2021-134) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2022M721147).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AF700-anti-CD11b (M1/70)eBioscience56-0112-82Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)BioLegend108141Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)Tonbo20-0031-U100Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)eBioscience13-0341-82Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)BioLegend135023Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)BioLegend103443Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)BioLegend101337Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube Shanghai Huake Labware Co.DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainerCORNING352340
EthanolGENERAL-REAGENT01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solutionServicebioG1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)SolarbioE8651
FITC-anti-CD45.2 (104)BioLegend109806Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
FlowjoBecton, Dickinson & CompanyA flow cytometry.
Gelatin spongeJiangxi Xiangen Co.Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+Gibco14170112HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzerSysmexpocH-100i Diff
iodine swabsXiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.01011To prevent the infection after operation.
IsofluraneRWDR510-22-10 To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paperabsorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)Thermo Fisher ScientificL34962A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointmentPfizerTo prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsamSolarbioG8590
nylon filterShanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.Used for cell filtration.
Paraffin liquidMacklinP815706
Paraformaldehyde (PFA) solutionServicebioG1101Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)BioLegend110708Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)BD Biosciences562537Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)BD Biosciences105809Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)BioLegend103222Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)BioLegend115914Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)BioLegend100456Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich57-33-0Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)BioLegend100734Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktailBD Biosciences561317Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis bufferBeyotimeC3702Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2Shanghai Rebone Biomaterials Co.The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining bufferBioLegend420201Store at 4 °C.
XyleneGENERAL-REAGENT01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)BioLegend423108A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved. 

References

  1. Copelan, E. A. Hematopoietic stem-cell transplantation. New England Journal of Medicine. 354 (17), 1813-1826 (2006).
  2. Vittayawacharin, P., et al. Autologous hematopoietic stem cell transplantation for a patient with multiple autoimmune diseases. American Journal of Hematology. 98 (10), 1659-1662 (2023).
  3. Xu, L. -. P., et al. Hematopoietic stem cell transplantation activity in China 2019: a report from the Chinese Blood and Marrow Transplantation Registry Group. Bone Marrow Transplantation. 56 (12), 2940-2947 (2021).
  4. Gratwohl, A., et al. Hematopoietic stem cell transplantation: a global perspective. JAMA. 303 (16), 1617-1624 (2010).
  5. Sakurai, M., et al. Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells. Nature. 615 (7950), 127-133 (2023).
  6. Pineault, N., Abu-Khader, A. Advances in umbilical cord blood stem cell expansion and clinical translation. Experimental Hematology. 43 (7), 498-513 (2015).
  7. Liang, G., Liu, F. Long-term expansion of human hematopoietic stem cells. Cell Regeneration. 12 (1), 18 (2023).
  8. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
  9. Kumar, S., Geiger, H. HSC niche biology and HSC expansion ex vivo. Trends in Molecular Medicine. 23 (9), 799-819 (2017).
  10. Dai, K., et al. A BMP-2-triggered in vivo osteo-organoid for cell therapy. Science Advances. 9 (1), 1541 (2023).
  11. Dai, K., Zhang, W., Deng, S., Wang, J., Liu, C. Sulfated polysaccharide regulates the homing of HSPCs in a BMP-2-triggered in vivo osteo-organoid. Advanced Science. 10 (24), e2301592 (2023).
  12. Alexander, T., Greco, R. Hematopoietic stem cell transplantation and cellular therapies for autoimmune diseases: overview and future considerations from the Autoimmune Diseases Working Party (ADWP) of the European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Bone Marrow Transplantation. 57 (7), 1055-1062 (2022).
  13. Ding, L., et al. Infusion of haploidentical HSCs combined with allogenic MSCs for the treatment of ALL patients. Bone Marrow Transplantation. 57 (7), 1086-1094 (2022).
  14. Sharrack, B., et al. Autologous haematopoietic stem cell transplantation and other cellular therapy in multiple sclerosis and immune-mediated neurological diseases: updated guidelines and recommendations from the EBMT Autoimmune Diseases Working Party (ADWP) and the Joint Accreditation Committee of EBMT and ISCT (JACIE). Bone Marrow Transplantation. 55 (2), 283-306 (2020).
  15. Nelson, M. R., Roy, K. Bone-marrow mimicking biomaterial niches for studying hematopoietic stem and progenitor cells. J Mater Chem B. 4 (20), 3490-3503 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HSCT RhBMP 2 HSPC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved