In Vivo גישת אוסטאו-אורגנואיד לקצירת תאי גזע/אב המטופויטיים טיפוליים

Summary

כאן, הקמנו in vivo אוסטאו-אורגנואידים המופעלים על ידי פיגומי ג'לטין טעונים בחלבון מורפוגנטי-2 עצם כדי לקצור תאי גזע / אב המטופויטיים טיפוליים לשחזור של מערכת המטופויטית וחיסונית פגומה. בסך הכל, גישה זו יכולה לספק מקור תאי מבטיח לטיפולים תאיים.

Abstract

השתלת תאי גזע המטופויטיים (HSCT) דורשת מספר מספיק של תאי גזע / אב המטופויטיים טיפוליים (HSPCs). כדי לזהות מקור הולם של HSPCs, פיתחנו אוסטאו-אורגנואיד in vivo על ידי השתלת פיגומים עמוסים בחלבון מורפוגנטי רקומביננטי של עצם אנושית-2 (rhBMP-2) לתוך כיס שריר פנימי ליד עצם הירך בעכברים. לאחר 12 שבועות של השתלה, שלפנו את האורגנואידים הנטאו-אורגנואידים in vivo וערכנו ניתוח ציטומטריית זרימה על HPSCs, תוך גילוי נוכחות משמעותית של תת-קבוצות HSPC בתוך האורגנואידים הנטאואים in vivo .

לאחר מכן הקמנו מודל תת-קטלני של פגיעה המטופויטית/מערכת החיסון בעכברים באמצעות קרינה וביצענו השתלת תאי גזע המטופויטיים (HSCT) על ידי הזרקת התאים שמקורם באוסטאו-אורגנואידים שחולצו לדם ההיקפי של עכברים מוקרנים. ההשפעה של התאוששות hematopoietic הוערכה באמצעות כימריזם דם המטולוגי, היקפי, וניתוח כימריזם איברים מוצקים. התוצאות אישרו כי תאים שמקורם באוסטאו-אורגנואידים יכולים לשחזר במהירות וביעילות איברים חיסוניים היקפיים ומוצקים פגומים בעכברים מוקרנים. גישה זו טומנת בחובה פוטנציאל כמקור חלופי של HSPCs עבור HSCT, ומציעה יתרונות למספר גדול יותר של מטופלים.

Introduction

השתלת תאי גזע המטופויטיים עומדת כטיפול הקונבנציונלי למגוון ממאירויות המטולוגיות, כמו גם הפרעות תורשתיות ואוטואימוניות רבות 1,2,3,4. אף על פי כן, הכמות והמקור המוגבלים של תאי גזע/אב המטופויטיים (HSPCs) התגלו כמכשול משמעותי ליישום הקליני של השתלת תאי גזע המטופויטיים (HSCT)^5,6.

הרחבת תאים במבחנה בקנה מידה גדול היא שיטה נפוצה לקצירת תאים טיפוליים ^5,7. מחקרים שונים פיתחו תנאים המעודדים HSPCs לחדש את עצמם במבחנה, בדרך כלל באמצעות שימוש בשילוב של אגוניסטים להתחדשות עצמית (כגון ציטוקינים וגורמי גדילה) ואלבומין בסרום, וכתוצאה מכך הרחבת ex vivo של HSPCs⁸. עם זאת, חשוב לציין כי השיטות הנוכחיות עדיין גוזלות זמן ומאתגרות לשמור על יכולת ההתחדשות העצמית של HSPCs^{מורחבים 9}.

בניגוד לשיטה הנ"ל, קצירת תאים in vivo מציגה אסטרטגיה חדשה וחדשנית. גישה זו כוללת הקמת אוסטאו-אורגנואיד in vivo המחקה את מבנה מח העצם המקומי^10,11. כדי להשיג זאת, אנו יוצרים invivo אוסטיאו-אורגנואידים באמצעות פיגומי ג'לטין טעונים בחלבון מורפוגנטי-2 (BMP-2) כדי להשיג קוקטיילים אוטולוגיים בשפע ובאיכות גבוהה, כולל HSPCs. על ידי יישום טיפולי של אוסטיאו-אורגנואידים אלה, טיפלנו בהצלחה בנזקי קרינה והראינו כי HSPCs שמקורם באוסטאו-אורגנואידים יכולים לשקם במהירות וביציבות את מערכת החיסון שנפגעה בניסוי.

Protocol

עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות, בגילאי 8-10 שבועות, נכללו במחקר. כל העכברים שוכנו במתקן לבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח סין למדע וטכנולוגיה. כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש המוסדיות בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח סין למדע וטכנולוגיה (ECUST-21010).

1. ייצור פיגום ביו-אקטיבי

1. הכנה
   1. הכניסו את המספריים והפינצטה הכירורגיים הנקיים והמיובשים לתוך של 1,000 מ"ל. עטפו את פי הכד בנייר סופג וקשרו אותו בחוזקה בחוט כותנה.
   2. מניחים את הכד במעקר בלחץ גבוה, סוגרים את המכסה בחוזקה, מכוונים את תוכנית העיקור ל -121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ומתחילים את תוכנית העיקור.
   3. לאחר השלמת תהליך העיקור, מוציאים ומעבירים את הכד המעוקר לתנור ייבוש שנקבע על 60 מעלות צלזיוס לייבוש. לאחר הייבוש המלא, רססו את הכד ב-75% אלכוהול והניחו אותו על הספסל הנקי.
   4. הפשיר את תמיסת מלאי rhBMP-2 (1.0 מ"ג / מ"ל) שעתיים לפני ההליך.
   5. לאחר ההפשרה לטמפרטורת החדר, העבירו את תמיסת הסטוק rhBMP-2 ואת ספוג הג'לטין שלא נפתח לספסל הסטרילי והנקי לייצור פיגומים ביו-אקטיביים.
      1. חתכו את ספוג הג'לטין (60 מ"מ x 20 מ"מ x 5 מ"מ) ל-48 חתיכות בגודל אחיד (5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ) (איור 1B) בעזרת המספריים המעוקרות והעבירו אותן לצלחת בעלת 48 בארות.
      2. ערבבו את תמיסת המלאי rhBMP-2 על ידי פיטום מעלה ומטה בעדינות כדי להבטיח ערבוב אחיד, תוך הקפדה על מניעת בועות. שאפו 30 μL של התמיסה והוסיפו אותה טיפה לספוג הג'לטין.
      3. אטמו את הצלחת בעלת 48 הבארות באמצעות שכבה אחת של פרפילם כדי להקל על תהליך הייבוש הבא בהקפאה. הוציאו את הצלחת המכילה את ספוג הג'לטין מהספסל הנקי. מניחים אותו ב -20 ° C כדי להיות קפוא. במקביל, הפעילו את מייבש ההקפאה וקררו אותו מראש לטווח טמפרטורות של -50°C עד -60°C.
      4. לאחר הקפאה של שעתיים, מניחים את צלחת הבאר עם ספוגי ג'לטין במייבש ההקפאה למשך 12 שעות. כדי לשמור על היובש והסטריליות של הדגימות, יש למרוח שכבה נוספת של פרפילם כדי לאטום את צלחת הבאר לאחר ייבוש בהקפאה. אחסנו אותו במקרר בטמפרטורה של -20°C.

2. השתלה כירורגית של פיגומים ביו-אקטיביים

הערה: כל כלי הניתוח מעוקרים לשימוש.

1. צמו את העכברים במשך שעה לפני ההרדמה. החל משחה וטרינרית סיכה סביב העיניים של עכברים כדי להפחית את אי הנוחות לאחר הניתוח הנגרמת על ידי יובש באזור העיניים. מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 1% (w/v) תמיסה של נתרן pentobarbital (במינון של 48 מ"ג / ק"ג).
   הערה: פרוטוקול זה משתמש בשיטת הרדמה שאושרה מבחינה אתית עם הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל. שיטות אחרות, כגון שאיפת איזופלורן או הזרקה תוך צפקית של קטמין-קסילזין, יכולות לשמש גם לאחר אישור.
2. אשר את עומק ההרדמה בעכברים על ידי חיפוש הסימנים הבאים בעכבר שכיבה: דופק ונשימה יציבים, שרירים רפויים, גפיים לא ניידות, שפם שאינו מגיב למגע והיעדר רפלקס דוושה. בנוסף, לצבוט את העור של העכברים עם מלקחיים שיניים או לעורר את הבהונות או כפות של עכברים. אם העכברים מפגינים תגובות רגישות, ההרדמה קלה מדי; מתן הרדמה נוספת. לאחר השגת מישור ההרדמה, העבירו את העכברים לאזור הניתוח במצב שכיבה צדדית ימנית כדי להשתיל את הפיגום הביו-אקטיבי ברגל שמאל בקלות.
3. יש לגלח את השיער ברגל שמאל באמצעות מכונת גילוח. יש לחטא את האזור המגולח באמצעות סיבובים מתחלפים של כלורהקסידין ואלכוהול 3 פעמים כל אחד, וליצור חתכים ברגל האחורית, הממוקמת בצד הלטרלי של שריר הווסטוס לטרליס. השתמש מספריים אופתלמיים כדי לבצע חתכים באורך של כ -3.0 מ"מ, המשתרעים לאורך כיוון השוקה.
   הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח, יש לאחסן את הפריטים הכירורגיים המשומשים במקומות ייעודיים. אספקה סטרילית צריכה להיות ממוקמת באזור נקי כדי למנוע מגע עם אנשים שאינם המפעיל. כלי ניתוח רב פעמיים יש לחטא מיד עם אתנול 75% (v/v). למזער את משך הניתוח כדי להפחית את החשיפה של פצעים לאוויר ולהקטין את הסיכון לזיהום.
4. כדי ליצור את הכיס לשתל, פתחו את הפאשיה באספקט הדיסטלי של שריר הווסטוס לטרליס, לכיוון השוקה.
5. השתמשו במלקחיים עיניים כדי לעצב את הפיגום הביו-אקטיבי לגליל, בגובה של כ-5 מ"מ ובקוטר של כ-5 מ"מ. השתילו את הפיגום בכיס השריר לאורך חריץ השריר שנוצר על ידי מספריים אופתלמיים וסגרו את כיס השתל עם תבנית תפר קטועה דרך הפאשיה. סגור את החתך בעור באמצעות תפר 4-0.
   הערה: התרחשות של עוויתות או השתנה אצל בעלי חיים במהלך ההליך הכירורגי מצביעה על הרדמה עמוקה מדי, המחייבת יישום מיידי של אמצעי חירום.
6. חזור על שלבים 2.3-2.5 והשתיל פיגום ביו-אקטיבי נוסף בכיס שריר הירך הימני של העכברים. השתמש במקלוני יוד כדי לנקות את אתרי הניתוח וההזרקה של העכברים לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום.
   הערה: ניתן להחדיר שתל אחד בלבד לכל שריר vastus lateralis.
7. הניחו את העכברים על משטח טמפרטורה קבוע של 37 מעלות צלזיוס עד שהם מתעוררים לאחר הניסוי. הפכו את העכברים כל 10-15 דקות כדי למנוע איגום דם. לאחר הניתוח, בנוסף לשמירה על חום, לפקח על העכברים לאחר הניתוח מבלי להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. שימו לב היטב לאינדיקטורים חשובים של עכברים, כגון קצב הלב וקצב הנשימה.
   הערה: רעד של הגפיים הקדמיות בעכברים מסמל את תחילת שלב ההחלמה.
8. החזירו את העכברים לכלוב סטרילי שעבר חיטוי בריסוס אלכוהול וקרינה אולטרה סגולה. אין להניח את בעל החיים שעבר ניתוח עם בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. בנוסף, לנהל meloxicam כדי לנהל את הכאב לאחר הניתוח לפחות יום אחד, עם אפשרות להאריך עד שלושה ימים לניהול כאב אינטנסיבי יותר. בדוק את בעל החיים ואת הפצע באופן קבוע במהלך 72 השעות שלאחר הניתוח כדי לזהות תופעות לוואי אפשריות. אם הזיהום מתגלה מאוחר יותר, יש להרדים את בעלי החיים על ידי הרדמת העכברים תחילה באמצעות הזרקה תוך צפקית של תמיסה של 1% (w/v) של נתרן פנטוברביטל (במינון של 48 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן נקע צוואר הרחם לאחר הרדמה.

3. אפיון אוסטאו-אורגנואידים in vivo 12 שבועות לאחר ההשתלה

הערה: הפיגומים הביו-אקטיביים יתפתחו in vivo ליצירת אוסטאו-אורגנואידים לאחר ההשתלה.

1. אוסף של invivo osteo-organoids
   1. כאשר האורגנואידים הנטאו-אורגנואידים in vivo הושתלו במשך 12 שבועות, יש להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 1% (w/v) תמיסה של נתרן פנטוברביטל (במינון של 48 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן פריקת צוואר הרחם לאחר הרדמה.
      הערה: כדי למזער את הנזק לבעלי חיים, יש להרדים עכברים לפני המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם.
   2. יש לרסס 75% אלכוהול על העור במקום הנתיחה.
   3. נתקו את הגפה האחורית מתא המטען והוציאו את השריר מהאוסטאו-אורגנואידים בעזרת מספריים מיניאטוריים בזהירות.
   4. הסר את הרקמות הרכות המחוברות עם גזה.
   5. תקן כמה אוסטאו-אורגנואידים בתמיסת פרפורמלדהיד (PFA) של 4% (v/v) למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח היסטולוגי. השתמש בדגימות הנותרות לצילום מקרוסקופי ולניתוח ציטומטריית זרימה של HPSCs.
2. תמונות מקרוסקופיות
   1. הניחו את האוסטאו-אורגנואידים על לוח רקע כחול וצלמו אותם במצלמה דיגיטלית.
3. ניתוח היסטולוגי
   1. הכנה לצביעה היסטולוגית
      1. מעבירים את האוסטאו-אורגנואידים מתמיסת PFA למים טהורים במיוחד ומשרים למשך שעה אחת.
      2. החלף מים טהורים במיוחד בתמיסת חומצה טטראצטית (EDTA) 0.5 M ethylenediamine (EDTA) להסתיידות למשך שבוע אחד.
      3. מניחים רקמות מסוידות בקלטת הטבעה וטובלים את הקלטת במים טהורים במיוחד למשך שעה אחת.
      4. להתייבשות הדרגתית, יש לטבול את קלטת ההטבעה באתנול בריכוזים משתנים (v/v): 75%, 80%, 90% ו-95% למשך שעה כל אחד, ולאחר מכן לטבול באתנול I ו-II ב-100% (v/v) למשך שעה כל אחד.
         הערה: "100% (v/v) אתנול I ו-II" מציין שיש לטבול את קלטת ההטבעה פעם אחת ב"מיכל I" המלא באתנול 100% (v/v) ולאחר מכן לטבול פעם שנייה ב"מיכל II" המלא באתנול 100% (v/v).
      5. לאחר התייבשות, הניחו את הרקמות המשובצות ברצף בתערובת של 100% (v/v) קסילן ואתנול מוחלט (קסילן: יחס נפח אתנול של 1:1) למשך שעה אחת ו-100% (v/v) קסילן I ו-II למשך 30 דקות כל אחד.
      6. לטבול את הרקמות פרפין I ו- II בטמפרטורה קבועה של 60 ° C במשך 2 שעות כל אחד.
      7. כדי להטמיע את הרקמות המושרות בשעווה באמצעות מכונת הטבעה, הניחו את השעווה המומסת בתבנית ההטבעה. לפני שהשעווה מתמצקת, הסר את הרקמות ממיכל ההתייבשות ומקם אותן בתבנית הטבעה; תייגו אותם בהתאם. מצננים את התבנית במצב הקפאה של -20°C ולאחר שהשעווה מתמצקת, מסירים את גוש השעווה מתבנית ההטבעה וקוצצים אותו.
      8. פורסים את גושי השעווה המשובצים למקטעים בעובי 4.5 מיקרומטר באמצעות כלי פריסה פרפין ולאחר מכן מדביקים את המקטעים לשקופיות זכוכית.
      9. אופים בקצרה את החלקים ב 40 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לאסוף ולאחסן אותם בקופסה לדוגמה.
   2. צביעת H&E
      1. מניחים את הנתחים במדף לדוגמה ואופים בתנור ייבוש בחום של 60°C במשך 30 דקות.
      2. deparaffinize את החלקים xylene ואתנול. מניחים ברצף את חלקי הפרפין לתוך קסילן I למשך 10 דקות, קסילן II למשך 10 דקות, קסילן III למשך 10 דקות, אתנול מוחלט I למשך 5 דקות, אתנול מוחלט II למשך 5 דקות, אתנול 90% (v/v) אתנול למשך 5 דקות, אתנול 80% (v/v) למשך 5 דקות, אתנול 70% (v/v) למשך 5 דקות, אתנול 50% (v/v) למשך 5 דקות ומעבירים למים טהורים לתהליך הסרת שעווה הדרגתי.
      3. לטבול את החלקים בתמיסת צביעת hematoxylin במשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם במים זורמים במשך 10 דקות.
      4. לטבול את החלקים בתמיסת צביעת אאוסין למשך 2 דקות.
      5. הכניסו את החלקים ברצף לאתנול 75% (v/v) למשך 2 דקות, אתנול 85% (v/v) למשך 2 דקות, אתנול מוחלט למשך 5 דקות, אתנול מוחלט למשך 5 דקות וקסילן למשך 5 דקות להתייבשות.
      6. מוציאים את החלקים מקסילן ואוטמים אותם בבלזם ניטרלי.
      7. התבוננו בחלקים שמתחת למיקרוסקופ וצלמו תמונות מייצגות בהגדלה של פי 10 לאחר שהבלסם הניטרלי התייבש.
4. ניתוח ציטומטריית זרימה עבור HPSCs
   1. הניחו את האורגנואידים הנאמנים in vivo שהתקבלו משלב 3.1 במכתש והוסיפו כמות מתאימה של חיץ צביעה. חותכים את האורגנואידים האוסטאו-אורגנואידים לשברים בקוטר של 1-3 מ"מ באמצעות מספריים אופתלמיים ומועכים אותם בחיץ הצביעה באמצעות המליטה והמזיק. לחץ אנכית במקום לטחון את שברי האורגנואידים הנטאו-אורגנואידים in vivo באמצעות מזיק כדי למנוע ירידה בשיעור הישרדות התא.
   2. אספו את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה וצנטריפוגו אותם ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C.
   3. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ lysis תאי דם אדומים כדי lyse את התאים במשך 3-5 דקות.
   4. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של חיץ צביעה וסננו אותם דרך מסנן ניילון 300 רשת לתוך ציטומטריית זרימה של 5 מ"ל.
   5. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. יש לצבוע את כ-100 μL (תאים) הנותרים בתחתית ציטומטריית הזרימה ב-4°C למשך 30 דקות באמצעות נוגדנים, כולל ערכת צביעה חיה/מתה, חלבון כלורופיל פרידינין-ציאנין5.5 (PerCp-Cy5.5)-קוקטייל אנטי-שושלת (1:10), פיקואריתרין-ציאנין5 (PE-Cy5)-אנטי-c-kit (1:200), Alexa Fluor 700(AF700)-anti-Stem cells antigen-1(Sca-1) (1:200), Brilliant Violet 711(BV711)-anti-CD16/32 (1:200), bio-anti-CD34 (1:200), BV421-anti-CD127 (1:200), PE-CF594-anti-CD135 (1:200), BV510-anti-CD48 (1:200) ו-PE-Cy7-anti-CD150 (1:200).
   6. השהה מחדש את התאים עם 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ללא Ca²⁺ ו- Mg²⁺ וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
   7. יש לשאוף את הסופרנאטנט והכתם עם נוגדן משני PE-streptavidin (1:200) למשך 60 דקות נוספות ב-4°C.
   8. להשהות מחדש את התאים עם 1 מ"ל של HBSS (לא Ca²⁺, Mg²⁺) וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   9. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים עם 300 מיקרוליטר HBSS (ללא Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. מערבולת הפתרון לביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה נוספת. נתח עוד יותר את הנתונים המתקבלים באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה כדי לקבל נתונים כמותיים על HSPCs.
       הערה: איסוף הנתונים וניתוחם של ציטומטריית זרימה מתייחסים למאמרים הקודמים שלנו ולחומרים תומכים (איור משלים S1) עבור אסטרטגיות gating טיפוסיות המשמשות לזיהוי HSPCs¹⁰.
   11. קבע תרשים נקודות של אזור פיזור צדדי (SSC-A) לעומת אזור פיזור קדמי (FSC-A) ושער את האזור הסובב את אוכלוסיית התא המעניינת (P1) בתרשים הנקודות SSC-A לעומת FSC-A במהלך רכישת נתונים בציטומטר זרימה. לחץ פעמיים על שער P1; בחר את גובה הפיזור קדימה (FSC-H) עבור ציר X ואת רוחב הפיזור קדימה (FSC-W) עבור ציר Y כדי לבצע את הטיפול הראשון בהידבקות תאים. לחץ פעמיים על שער התאים הבודדים; בחר את גובה הפיזור הצדדי (SSC-H) עבור ציר X ואת רוחב הפיזור הצדדי (SSC-W) עבור ציר Y כדי לבצע את הטיפול השני בהידבקות התא. השתמש בכלי gating מלבני כדי לבחור את התאים הבודדים.
   12. לא לכלול תאים מתים. להבחין בין תאים חיים לתאים מתים על ידי זיהוי סמני כדאיות. קבע תרשים נקודה של SSC-A לעומת חי/מת ושער את האזור המתאים לתאים חיים, וקרא לו "תאים חיים".
   13. סנן את התאים המסומנים בנוגדנים ספציפיים ב"תאים חיים". לא לכלול את אוכלוסיית התאים שעשויה להיות מושפעת מהביטוי החיובי של נוגדנים ספציפיים לשושלת בשושלת תאי הגזע / תאי האב המיאלואידית על ידי שימוש בגיטינג שלילי לשושלת (lin^-). שער ^{תאי הפשתן} .
   14. מסך עבור תת-אוכלוסיות שונות של תאים בתוך תאי lin^. לחץ פעמיים על שער תאי הפשתן; בחר Sca-1-AF700 עבור ציר X ו- c-kit-PE-Cy5 עבור ציר Y. שער את תאי c-kit⁺Sca-1^- כתאי ^LKS- , את תאי c-kit⁺Sca-1⁺ כתאי LKS⁺, ואת התאים עם ביטוי נמוך של c-kit ו- Sca-1 כתאי LK^loS^lo. לחץ פעמיים על שער LKS^- ובחר CD34-PE עבור ציר X ו- FCγR-BV711 עבור ציר Y. לחץ פעמיים על שער ^LKS+; בחר FIt3-PE-CF594 עבור ציר X ו- IL7Rα-BV421 עבור ציר Y ובחר CD150-PE-Cy7 עבור ציר X ו- CD48-BV510 עבור ציר Y.
   15. בהתבסס על הספציפיות של נוגדנים, זהה שערים חיוביים או שליליים כדי להבחין בין תת-אוכלוסיות תאים: תאי גזע hematopoietic (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺) ואבות hematopoietic ממוינים: אבות multipotent (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻), אבות לימפואידים נפוצים (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺), אבות מיאלואידים נפוצים (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), אבות גרנולוציטים-מונוציטים (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺), ואבות אריתרואידים מגה-קריוציטים (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. מודל הקרנת עכבר

הערה: עכברי C57BL/6 הוקרנו בקרני רנטגן באמצעות מקרין רנטגן.

1. כדי להשיג ליקוי תת-קטלני של המערכת ההמטופויטית/חיסונית, יש לחשוף עכברים מסוג פרא (WT) בקבוצה שטופלה ב-5 מלח אפור (Gy) פוספט חוצץ מלוחים (PBS), בקבוצה שטופלה במח עצם טבעי 5 Gy (BM), ובקבוצת 5 Gy אוסטאו-אורגנואידים שטופלו ב-5 Gy להקרנה של 5 Gy (1.25 Gy/min) 24 שעות לפני ההשתלה.
   הערה: ודא שעכברי WT בקבוצה המטופלת ב- PBS 0 Gy מטופלים ב- PBS ואינם עוברים הקרנה.

5. תהליך הטיפול התאי

הערה: כל ההליכים צריכים להיעשות בתנאים סטריליים.

1. רכישת invivo osteo-organoid-derived ותאים מקומיים ממח עצם
   1. השתילו שני פיגומים ביו-אקטיביים בכיס השרירים של עכברי C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) ודגרו עליהם במשך 12 שבועות כדי ליצור את האורגנואידים הנאמנים in vivo . קצרו שני אורגנואידים נאמנים in vivo ושתי עצמות הירך מעכבר CD45.1 אחד שהוזכר לעיל. לאחר מכן, לנקות את הרקמה הרכה על פני השטח של osteo-organoids ואת עצם הירך באמצעות מלקחיים גזה.
   2. הניחו בנפרד את האורגנואידים הניאו-אורגנואידים ועצם הירך במכתש והוסיפו 1 מ"ל HBSS (ללא Ca²⁺, Mg²⁺).
      הערה: HBSS ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺ יכול להפחית את צבירת התאים. התמיסה המשמשת להשתלה אינה יכולה להכיל רכיבי סרום כדי למנוע תגובות דחייה פוטנציאליות.
   3. חותכים את הדגימות עם מספריים כירורגיים בעדינות למחוץ אותם במכתש ו pestle.
   4. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   5. הסר את supernatant ו resuspend את כדורי התא עם 300 μL של HBSS (לא Ca²⁺, Mg²⁺). יש לערבב היטב כדי לקבל תרחיף של תאים שמקורם באוסטאו-אורגנואידים או תאי מח עצם שלמים.
      הערה: כדי לנצל באופן מלא את קוקטיילים התאיים הנגזרים מאוסטאו-אורגנואיד in vivo, בחרנו להשתמש בתאי מח עצם שלמים לטיפול. המספר הטיפוסי של תאים בסך 30 מיקרוגרם BMP-2 המושרה in vivo אוסטאו-אורגנואיד הוא 30,000,000-40,000,000.
2. הזרקת סינוס ורידי אורביטלי
   הערה: CD45.1⁺ תאי מח עצם שלמים שנאספו מאורגנואידים או עצם הירך in vivo הוזרקו דרך הסינוס הוורידי האורביטלי למקבל C57BL/6 המוקרן באופן תת-קטלני (CD45.2), בהתאמה. הזרקת סינוס ורידי אורביטלי והזרקת ורידים בזנב הן שיטות נפוצות בניסויים בבעלי חיים. הזרקת סינוס ורידי אורביטלי נבחרה בשל פשטותה ושיעור הכישלון הנמוך למתחילים. במהלך תהליך ההזרקה המסלולית, יש לנקוט באמצעי הגנה מסוימים, כגון הרדמה מראש של העכברים, שימוש בצלחת מחוממת כדי להפחית את הסיכון להיפותרמיה, וריסון מכני של העכברים כדי למנוע תנועה.
   1. הניחו את עכברי CD45.2 בתא טרום הרדמה וגרמו להרדמה באמצעות איזופלורן. יש למרוח משחה וטרינרית מסככת סביב עיניהם של עכברים כדי למנוע יובש ולנטרל את הגירויים העינים הנגרמים על ידי איזופלורן.
      הערה: כדי למזער את הנזק לבעלי החיים, הרדמה איזופלורנית ניתנת לעכברים לפני הזרקת סינוס ורידי אורביטלי.
   2. מעבירים את העכברים לשולחן ההרדמה להמשך הרדמה.
   3. כדי להפחית את הסבירות להיפותרמיה בעכברים, הניחו את העכבר המוקרן והמורדם על כרית חימום תרמוסטטית המוגדרת ב -37 מעלות צלזיוס.
   4. הניחו את העכבר בשכיבה צידית שמאלית כשראשו פונה ימינה לאחר הרדמה מלאה.
   5. כדי להבליט את העין, הניחו אצבע על החלק העליון של הראש ולאורך קו הלסת. משכו בעדינות את העור אחורה ולמטה.
   6. השתמש מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 25 G כדי לשאוף 200 μL של תרחיף תאים invivo osteo-organoid נגזר או תרחיף תאים נגזר מח עצם טבעי של עכברים CD45.1⁺ שהושגו בשלב 5.1.5.
   7. מכניסים בזהירות את המחט, משופעים כלפי מטה, בזווית של כ-30 מעלות, לתוך הקנטוס המדיאלי.
      הערה: הזרקות ניתנות בדרך כלל עם המחט משופעת כלפי מעלה, אך עבור זריקות רטרו-מסלוליות, עדיף למקם את שיפוע המחט כלפי מטה כדי להפחית את הסיכון לנזק לעיניים.
   8. השתמש במחט כדי לעקוב אחר קצה גלגל העין כלפי מטה עד שקצה המחט נמצא בבסיס העין.
   9. לאט ובצורה חלקה להזריק את ההזרקה.
   10. לאחר השלמת ההזרקה, החזירו את העכבר לכלוב להתאוששות.

6. הערכת השפעות הטיפול

1. ניתוח המטולוגי
   הערה: כדי לנתח את ההמטולוגיה של מושתלים בבדיקות בנייה מחדש של מערכת החיסון, אספנו דגימות דם היקפיות ממושתלים שעברו טיפולים שונים: טיפול 0 Gy PBS, טיפול 5 Gy PBS, טיפול 5 Gy יליד BM, וטיפול 5 Gy אוסטאו-אורגנואידים. דגימות הדם התקבלו באמצעות ניקוב רטרו-אורביטלי יומיים לפני ו-2, 4, 8, 12 ו-16 שבועות לאחר ההשתלה. חלק מדגימת הדם של אותה קבוצה שימש לניתוח המטולוגי, ואילו החלק השני שימש לניתוח כימריזם. ישנן שיטות דגימת דם שונות, כגון דרך וריד submandibular או וריד הזנב. ניקוב רטרו-אורביטלי הוא אחת השיטות הנפוצות לדגימת דם בעכברים והוא מותר בתנאים אתיים.
   1. חזור על שלבים 5.2.1-5.2.5 כדי להרדים את העכברים ולהבליט את עיני העכברים.
      הערה: כדי להפחית את הנזק לבעלי החיים, הרדמה איזופלורנית ניתנת לעכברים לפני דגימת דם לניקוב רטרו-אורביטלי.
   2. מקמו את צינור הנימים בקוטר של 0.5 מ"מ בקנתוס המדיאלי של העין וכוונו אותו בצורה קאודלית בזווית של 30°-45° ביחס למישור האף.
   3. סובב את צינור הנימים בעדינות תוך הפעלת לחץ, ומאפשר לו לחדור דרך קרום הלחמית. אפשר לדם לזרום לתוך צינור הנימים באמצעות פעולה נימית.
   4. הפעל לחץ מתמשך לאחר שהדם מתחיל לזרום כדי לקיים את הזרימה.
   5. לאחר ציור 100 μL של דם, לשחרר את הלחץ על הצוואר מיד. במקביל, הסר את צינור הנימים כדי לאפשר לעין לחזור למצב הרגיל כדי למנוע דימום לאחר הניתוח מאתר הניקוב.
   6. יש להוציא מיד את הדם לתוך צינור צנטריפוגה שנשטף בתמיסת 1.5% (w/v) ethylenediamine tetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2) ולאחר מכן נוסף 10 μL של 1.5% (w/v) תמיסת EDTA-K2. נערו בעדינות את צינור הצנטריפוגה כדי להבטיח ערבוב יסודי של תמיסת EDTA-K2 ודם, ולמנוע קרישה.
   7. לאחר ניגוב הפצע עם כותנה סטרילית והפעלת לחץ קל כדי לעצור דימום, להתבונן בעכברים במשך 1-2 דקות לאחר hemostasis כדי לוודא שאין חריגות ולאחר מכן להחזיר אותם לכלובים שלהם.
   8. בצע ניתוח המטולוגי על חלק מדגימות הדם של כל קבוצה באמצעות מנתח המטולוגי, כולל ספירת תאי הדם הלבנים (WBC), תאי הדם האדומים (RBC) וטסיות הדם (PLT).
      הערה: יש לנתח את כל דגימות הדם תוך שעתיים מהאיסוף.
2. ניתוח כימריזם דם היקפי
   הערה: בדומה לאנליזה המטולוגית, דגימות דם היקפיות מקבוצות 5 Gy ילידי BM ו-5 Gy אוסטאו-אורגנואידים שטופלו נאספו על ידי ניקור רטרו-אורביטלי לאחר 2, 4, 8, 12 ו -16 שבועות לאחר ההשתלה.
   1. השתמש בחלק השני של דגימת הדם ההיקפית המתקבלת משלב 6.1 לניתוח כימריזם דם היקפי.
   2. הוסף 1 מ"ל של חיץ ליזה אריתרוציטים לדגימה וליז במשך 3-5 דקות. הפוך את הדגימה בעדינות כדי להקל על ליזה טובה יותר של כדוריות דם אדומות.
   3. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
   4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהוסיף 1 מ"ל HBSS (ללא Ca²⁺, Mg²⁺) כדי להשהות מחדש את הכדור.
   5. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. יש לצבוע את התאים הנותרים בתחתית צינור הצנטריפוגה ב-4°C למשך 30 דקות באמצעות נוגדנים, כולל ערכת צביעה חיה/מתה, PE-anti-CD45.1 (1:200), Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-anti-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-anti-B220 (1:200), AF700-anti-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-anti-CD4 (1:200) ו-Allophycocyanin (APC)-anti-CD3e (1:200).
   6. להשהות מחדש את התאים עם 1 מ"ל של HBSS (לא Ca²⁺, Mg²⁺) וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   7. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים עם 300 מיקרוליטר HBSS (ללא Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. מערבול את המתלה כדי לבצע ניתוח ציטומטריה זרימה נוספת.
   9. נתח עוד יותר את הנתונים שהתקבלו באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה כדי לקבל מידע על שיעור הכימריזם של HSPCs בדם ההיקפי של עכברים מושתלים הן בקבוצה 5 Gy יליד BM שטופלה והן בקבוצה 5 Gy אוסטאו-אורגנואידים שטופלו.
      הערה: לניתוח נתונים ציטומטריים של זרימה, עיין באיור המשלים S2 לקבלת אסטרטגיות gating טיפוסיות המשמשות לזיהוי תאי CD45.1⁺ שמקורם בתורם בדם היקפי של מקבלי CD45.2.
   10. חזור על שלבים 3.4.11-3.4.12 כדי לשער את האזור המתאים לתאים חיים.
   11. לנתח כימריזם דם היקפי על ידי זיהוי ראשוני של אוכלוסיות תאים ולאחר מכן הבחנה בין תאים תורמים ומקבלים.
       1. מסך תאים ספציפיים המסומנים בנוגדנים בתוך תאים חיים. בחר CD11b-AF700 עבור ציר X ו- B220-PE-Cy7 עבור ציר Y. שער את תאי B220⁺CD11b כתאי B, תאי B220-CD11b⁺ כתאים מיאלואידים, ותאי B220-CD11b כתאים שליליים כפולים (DN).
       2. לחץ פעמיים על שער תאי DN, באמצעות CD3-APC עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. שער את תאי CD3⁺ כתאי T.
       3. לחץ פעמיים על שער תאי CD3⁺, ובחר CD4-PE-Dazzle594 עבור ציר X ו- CD8-PerCp-Cy5.5 עבור ציר Y. שער תאי CD8 ⁺ CD4 כתאי T ציטוטוקסיים (CTL) ותאי CD8-CD4⁺ כתאי T רגולטוריים (Treg).
   12. לבסוף, ניתוח כימריזם דם היקפי מבוצע על התאים התורם והמקבל. בתוך אוכלוסיות התאים המיועדות, לחץ פעמיים כדי לבחור CD45.1-PE עבור ציר X ו - CD45.2-FITC עבור ציר Y. שער תאי CD45.1⁺ ובצע ספירת תאים כדי לקבוע את חלקם של תאי CD45.1⁺ באוכלוסיית התא, ובכך משקף את קצב הכימריזם.
3. ניתוח של כימריזם איברים מוצקים
   הערה: לאחר 16 שבועות לאחר ההשתלה, BM, טחול וכימרות בלוטת התימוס נותחו בקבוצה שטופלה ב-5 Gy BM ובקבוצת 5 Gy שטופלו באוסטאו-אורגנואידים.
   1. חזור על שלבים 5.1.1-5.1.4 כדי להשיג את כדורי התא הנגזרים מה- BM.
   2. הניחו מסנן ניילון 300 רשת מעל צלחת תרבית תאים (6 ס"מ) המכילה 1 מ"ל HBSS (ללא Ca²⁺, Mg²⁺).
   3. הניחו את הטחול או בלוטת התימוס המנותחים על מסנן הניילון.
   4. טוחנים את האיברים שהוזכרו באמצעות פקק הגומי הקדמי של מזרק 5 מ"ל עד שלא נשאר מבנה רקמה ברור, רק רקמה סיבית שיורית. טפל בתאים בעדינות כדי להבטיח את קיום התא.
   5. לאסוף את התסנין ואת הצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   6. הסר את supernatant כדי לקבל את משקעי התא שמקורם הטחול או בלוטת התימוס.
   7. הוסף 1 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים לכדורי התא שהתקבלו בשלבים 6.3.1 ו- 6.3.6, וליז למשך 3-5 דקות.
   8. חזור על שלבים 6.2.3-6.2.8 לניתוח ציטומטריית צביעה וזרימה.
   9. ניתוח נוסף של הנתונים שהתקבלו באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה כדי לקבל מידע על קצב הכימריזם של HSPCs באיברים מוצקים (BM, טחול ותימוס) של עכברים מושתלים הן בקבוצה 5 Gy יליד BM שטופלה והן בקבוצה 5 Gy אוסטאו-אורגנואידים שטופלו.
      הערה: לניתוח נתונים ציטומטריים של זרימה, מתייחס לאיור משלים S2 עבור אסטרטגיות gating טיפוסיות המשמשות לזיהוי תאי CD45.1⁺ שמקורם בתורם ב- BM, טחול ובלוטת התימוס של מקבלי CD45.2.
   10. החליפו את הדם ההיקפי בשלבים 6.2.10-6.2.12 ב-BM, טחול ובלוטת התימוס כדי לקבל את שיעור הכימריזם של איברים מוצקים.

תוצאות

בהתאם לפרוטוקול, יצרנו פיגום ביו-אקטיבי על ידי טפטוף BMP-2 לתוך ספוג ג'לטין מתכלה בתנאים סטריליים. הפיגום הושתל בשרירי הגפיים התחתונות של עכברים כדי לבסס invivo אוסטאו-אורגנואידים. לאחר תקופת דגירה של 12 שבועות, ערכנו צילום מקרוסקופי, ניתוח היסטולוגי וניתוח ציטומטריית זר?...

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה לביסוס invivo אוסטאו-אורגנואידים בעלי מבנים דמויי מח עצם על ידי השתלת פיגומים מספוגי ג'לטין עמוסים ב-BMP-2. אנו מראים כי אלה in vivo osteo-organoids יכול לייצר ביציבות HSPCs טיפוליים על פני תקופה ארוכה של זמן (יותר מ -12 שבועות). בהשוואה לשיטות קיימות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.