Остеоорганоидный подход in vivo для забора терапевтических гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток

Резюме

В данной работе мы установили in vivo остеоорганоиды, запускаемые костными морфогенетическими белками-2 желатиновыми каркасами для сбора терапевтических гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток для реконструкции поврежденной кроветворной и иммунной системы. В целом, этот подход может стать многообещающим источником клеток для клеточной терапии.

Аннотация

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) требует достаточного количества терапевтических гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток (ТГСК). Чтобы определить адекватный источник HSPC, мы разработали остеоорганоид in vivo путем имплантации скаффолдов, загруженных рекомбинантным костным морфогенетическим белком-2 человека (rhBMP-2), во внутренний мышечный мешок рядом с бедренной костью у мышей. После 12 недель имплантации мы извлекли остеоорганоиды in vivo и провели анализ проточной цитометрии на HPSC, выявив значительное присутствие субпопуляций HSPC в остеоорганоидах in vivo .

Затем мы создали сублетальную модель повреждения гемопоэтической/иммунной системы у мышей в результате облучения и выполнили трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) путем введения извлеченных клеток, полученных из остеоорганоидов, в периферическую кровь облученных мышей. Эффект восстановления кроветворения оценивали с помощью гематологического анализа, анализа химеризма периферической крови и химеризма солидных органов. Результаты подтвердили, что клетки, полученные из остеоорганоидов in vivo , могут быстро и эффективно восстанавливать поврежденные периферические и твердые иммунные органы у облученных мышей. Этот подход имеет потенциал в качестве альтернативного источника ТГСК для ТГСК, предлагая преимущества для большего числа пациентов.

Введение

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток является традиционной терапией при различных гематологических злокачественных новообразованиях, а также многочисленных наследственных и аутоиммунных заболеваниях 1,2,3,4. Тем не менее, ограниченное количество и происхождение гемопоэтических стволовых/прогениторных клеток (ТГСК) стали существенным препятствием для клинического применения трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК)^5,6.

Широкомасштабная экспансия клеток in vitro является широко используемым методом сбора терапевтических клеток ^5,7. В различных исследованиях были разработаны условия, которые стимулируют ГСКК к самообновлению in vitro, как правило, путем использования комбинации агонистов самообновления (таких как цитокины и факторы роста) и сывороточного альбумина, что приводит к расширению ГСКХ ex vivo^. Тем не менее, важно отметить, что существующие методы по-прежнему требуют много времени и являются сложными для поддержания способности к самообновлению расширенных СЗПК⁹.

В отличие от вышеупомянутого метода, сбор клеток in vivo представляет собой новую и инновационную стратегию. Этот подход включает в себя создание in vivo остеоорганоида, который имитирует нативную структуру костного мозга^10,11. Для достижения этой цели мы формируем остеоорганоиды in vivo с использованием гелатиновых каркасов, загруженных костным морфогенетическим белком-2 (BMP-2), для получения обильных и высококачественных коктейлей аутологичных клеток, включая ГСК. С помощью терапевтического применения этих остеоорганоидов мы успешно вылечили повреждения от облучения и продемонстрировали, что ГСКХ, полученные из остеоорганоидов, могут быстро и стабильно восстанавливать экспериментально нарушенную иммунную систему.

протокол

В исследование были включены самцы и самки мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель. Все мыши были размещены в животноводческом центре Восточно-Китайского университета науки и технологии. Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию Восточно-Китайского университета науки и технологии (ECUST-21010).

1. Изготовление биоактивного каркаса

1. Подготовка
   1. Положите очищенные и высушенные хирургические ножницы и пинцет в стакан объемом 1000 мл. Оберните горлышко стакана впитывающей бумагой и плотно завяжите его хлопчатобумажной нитью.
   2. Поместите стакан в стерилизатор высокого давления, плотно закройте крышку, установите программу стерилизации на 121 °C на 30 минут и начните программу стерилизации.
   3. После завершения процесса стерилизации снимите стерилизованный стакан и перенесите его в сушильную печь, установленную при температуре 60 °C для сушки. После полного высыхания опрыскайте стакан 75% (v/v) спиртом и положите его на чистую скамью.
   4. Разморозьте стоковый раствор rhBMP-2 (1,0 мг/мл) за 2 ч до процедуры.
   5. После размораживания до комнатной температуры переложите исходный раствор rhBMP-2 и невскрытую желатиновую губку на стерильный чистый стол для изготовления биоактивных скаффолдов.
      1. Стерилизованными ножницами разрежьте желатиновую губку (60 мм x 20 мм x 5 мм) на 48 кусочков одинакового размера (5 мм x 5 мм x 5 мм) (рис. 1B) и переложите их на 48-луночную пластину.
      2. Смешайте стоковый раствор rhBMP-2 с помощью пипетки вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное перемешивание, стараясь не допустить образования пузырьков. Отсадите 30 μл раствора и добавьте его по каплям в желатиновую губку.
      3. Запечатайте 48-луночный планшет с помощью одного слоя парапленки, чтобы облегчить последующий процесс сублимационной сушки. Достаньте тарелку с желатиновой губкой с чистой скамьи. Поместите его при температуре -20 °C для замораживания. Одновременно включите сублимационную сушилку и предварительно охладите ее до температурного диапазона от -50 °C до -60 °C.
      4. После заморозки в течение 2 часов поместите лунку с желатиновыми губками в сублимационную сушилку на 12 часов. Чтобы сохранить сухость и стерильность образцов, нанесите дополнительный слой парапленки для герметизации луночной пластины после сублимационной сушки. Храните в холодильнике при температуре -20 °C.

2. Хирургическая имплантация биоактивных каркасов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты стерилизованы для использования.

1. Голодайте на мышах в течение 1 ч до анестезии. Нанесите смазывающую ветеринарную мазь вокруг глаз мышей, чтобы уменьшить послеоперационный дискомфорт, вызванный сухостью в области глаз. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения 1% (мас/об) раствора пентобарбитала натрия (в дозе 48 мг/кг).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется этически одобренный метод анестезии с внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия. Другие методы, такие как ингаляция изофлурана или внутрибрюшинная инъекция кетамина-ксилазина, также могут быть использованы после одобрения.
2. Подтвердите глубину анестезии у мышей, обратив внимание на следующие признаки у лежачей мыши на спине: устойчивое сердцебиение и дыхание, расслабленные мышцы, неподвижные конечности, неподвижные усы, не реагирующие на прикосновения, и отсутствие педального рефлекса. Кроме того, зажимайте кожу мышей зубчатыми щипцами или стимулируйте пальцы ног или лапы мышей. Если мыши проявляют чувствительные реакции, анестезия слишком легкая; ввести дополнительную анестезию. После того, как плоскость анестезии будет достигнута, перенесите мышей в операционную зону в правое боковое лежачее положение, чтобы легко имплантировать биоактивный каркас в левую ногу.
3. Сбрейте волосы на левой ноге с помощью бритвенного станка. Продезинфицируйте выбритый участок, чередуя раунды хлоргексидина и спирта по 3 раза каждый, и сделайте надрезы на задней ноге, расположенной на боковой стороне латеральной мышцы. С помощью офтальмологических ножниц сделайте разрезы длиной примерно 3,0 мм, проходящие по направлению большеберцовой кости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильных условий во время операции использованные хирургические предметы должны храниться в специально отведенных местах. Стерильные принадлежности должны быть размещены в чистой зоне, чтобы предотвратить контакт с людьми, не являющимися оператором. Многоразовые хирургические инструменты должны быть немедленно продезинфицированы 75% (v/v) этанолом. Сведите к минимуму продолжительность операции, чтобы уменьшить контакт воздуха с ранами и снизить риск инфицирования.
4. Чтобы создать карман для имплантата, откройте фасцию в дистальном отделе латеральной мышцы, по направлению к большеберцовой кости.
5. С помощью офтальмологических щипцов придайте биоактивному каркасу форму цилиндра высотой примерно 5 мм и диаметром 5 мм. Имплантируйте каркас в мышечный карман вдоль мышечной щели, созданной офтальмологических ножницами, и закройте карман имплантата прерывистым рисунком швов через фасцию. Закройте разрез кожи с помощью шва 4-0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возникновение судорог или мочеиспускания у животных во время хирургического вмешательства свидетельствует о чрезмерно глубоком обезболивании, требующем незамедлительного принятия экстренных мер.
6. Повторите шаги 2.3-2.5 и имплантируйте еще один биоактивный каркас в мешочек правой бедренной мышцы мышей. Используйте тампоны йода для очистки хирургических и инъекционных мест мышей после операции, чтобы предотвратить инфекцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только один имплантат может быть вставлен в каждую латеральную мышцу.
7. Поместите мышей на платформу с постоянной температурой при температуре 37 °C, пока они не проснутся после эксперимента. Переворачивайте мышей каждые 10-15 минут, чтобы предотвратить скопление крови. После операции, в дополнение к поддержанию тепла, наблюдайте за послеоперационными мышами, не оставляя животное без присмотра, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения грудины. Обратите пристальное внимание на важные показатели мышей, такие как частота сердечных сокращений и частота дыхания.
   Примечание: Дрожь передних конечностей у мышей означает начало фазы восстановления.
8. Поместите мышей обратно в стерильную клетку, которая была продезинфицирована спиртовым распылением и ультрафиолетовым облучением. Не помещайте животное, перенесшее операцию, с другими животными до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет. Кроме того, применяйте мелоксикам для снятия послеоперационной боли в течение как минимум одного дня с возможностью продления до трех дней для более интенсивного обезболивания. Регулярно проверяйте животное и рану в течение 72-часового послеоперационного периода, чтобы выявить любые потенциальные побочные эффекты. Если инфекция обнаружена позже, усыпьте животных путем предварительной анестезии мышей путем внутрибрюшинного введения 1% раствора пентобарбитала натрия (в дозе 48 мг/кг) с последующим вывихом шейки матки после анестезии.

3. Характеристика остеоорганоидов in vivo через 12 недель после имплантации

Примечание: Биоактивные каркасы будут развиваться in vivo с образованием остеоорганоидов после имплантации.

1. Коллекция остеоорганоидов in vivo
   1. После имплантации остеоорганоидов in vivo в течение 12 недель проводят обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения 1% (w/v) раствора пентобарбитала натрия (в дозе 48 мг/кг) с последующим вывихом шейки матки после анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму вред для животных, мышей следует обезболить перед эвтаназией путем вывиха шейки матки.
   2. Распылите 75% (v/v) спирт на кожу в месте рассечения.
   3. Осторожно отсоедините заднюю конечность от туловища и удалите мышцу из остеоорганоидов с помощью миниатюрных ножниц.
   4. Удалите прикрепленные мягкие ткани с помощью марли.
   5. Зафиксировать некоторые остеоорганоиды в 4% (v/v) растворе параформальдегида (PFA) в течение 24 ч при комнатной температуре для гистологического анализа. Используйте оставшиеся образцы для макроскопической фотографии и анализа проточной цитометрии HPSC.
2. Макроскопические изображения
   1. Поместите остеоорганоиды на синюю фоновую пластину и сфотографируйте их с помощью цифровой камеры.
3. Гистологический анализ
   1. Подготовка к гистологическому окрашиванию
      1. Перенесите остеоорганоиды из раствора PFA в сверхчистую воду и замочите на 1 ч.
      2. Замените сверхчистую воду 0,5 М раствором этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) для декальцинации на 1 неделю.
      3. Поместите декальцинированные ткани в закладную кассету и погрузите кассету в сверхчистую воду на 1 ч.
      4. Для градиентной дегидратации погружают встраиваемую кассету в этанол в различных концентрациях (v/v): 75%, 80%, 90% и 95% на 1 ч каждая, а затем погружают в 100% (v/v) этанол I и II на 1 ч каждая.
         ПРИМЕЧАНИЕ: "100% (v/v) этанол I и II" указывает на то, что встраиваемая кассета должна быть погружена один раз в "контейнер I", заполненный 100% (v/v) этанолом, а затем второй раз погружен в "контейнер II", заполненный 100% (v/v) этанолом.
      5. После обезвоживания последовательно поместите внедренные ткани в смесь 100% (v/v) ксилола и абсолютного этанола (объемное отношение ксилола: этанол 1:1) на 1 ч и 100% (v/v) ксилола I и II на 30 мин каждая.
      6. Погрузите ткани в парафин I и II при постоянной температуре 60 °C на 2 часа каждая.
      7. Чтобы заделать смоченные в воске ткани с помощью засадочной машины, поместите расплавленный воск в форму для закладки. Прежде чем воск застынет, извлеките ткани из емкости для обезвоживания и поместите их в форму для закладки; обозначьте их соответствующим образом. Охладите форму при температуре -20 °C и после застывания воска извлеките восковой блок из закладной формы и обрежьте его.
      8. Нарежьте залитые восковые блоки на секции толщиной 4,5 мкм с помощью парафинового слайсера, а затем прикрепите секции к стеклянным предметным стеклам.
      9. Кратковременно выпекайте секции при температуре 40 °C, а затем соберите и храните их в коробке для образцов.
   2. Окрашивание H&E
      1. Поместите срезы на решетку для образцов и выпекайте в сушильном шкафу при температуре 60 °C в течение 30 минут.
      2. Депарафинизируйте срезы в ксилоле и этаноле. Последовательно поместите срезы парафина в ксилол I на 10 мин, ксилол II на 10 мин, ксилол III на 10 мин, абсолютный этанол I на 5 мин, абсолютный этанол II на 5 мин, 90% (v/v) этанол на 5 мин, 80% (v/v) этанол на 5 мин, 70% (v/v) этанол на 5 мин, 50% (v/v) этанол на 5 мин и переложите в чистую воду для процесса градиентной депарафинизации.
      3. Погрузите срезы в раствор для окрашивания гематоксилина на 2 мин, затем промойте их в проточной воде в течение 10 мин.
      4. Погрузите срезы в раствор для окрашивания эозина на 2 мин.
      5. Последовательно поместите срезы в 75% (v/v) этанола на 2 мин, 85% (v/v) этанола на 2 мин, абсолютный этанол на 5 мин, абсолютный этанол на 5 мин и ксилол на 5 мин для обезвоживания.
      6. Выньте секции из ксилола и заклейте их нейтральным бальзамом.
      7. Наблюдайте за срезами под микроскопом и делайте репрезентативные изображения с увеличением в 10 раз после высыхания нейтрального бальзама.
4. Анализ проточной цитометрии на HPSC
   1. Поместите остеоорганоиды in vivo , полученные на шаге 3.1, в раствор и добавьте соответствующее количество буфера для окрашивания. Остеоорганоиды разрезать на фрагменты диаметром 1-3 мм с помощью офтальмологических ножниц и измельчить их в буфере для окрашивания с помощью ступки и пестика. Вертикально прижимайте, а не измельчайте фрагменты остеоорганоидов in vivo с помощью пестика, чтобы предотвратить снижение выживаемости клеток.
   2. Соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и центрифугируйте их при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
   3. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов для лизирования клеток в течение 3-5 минут.
   4. Промойте клетки 1 мл красящего буфера и отфильтруйте их через нейлоновый фильтр 300 меш в проточную цитометрическую пробирку объемом 5 мл.
   5. Центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Окрашивание оставшихся примерно 100 μл (клеток) на дне пробирки проточной цитометрии при температуре 4 °C в течение 30 мин с использованием антител, включая набор для окрашивания живых/мертвых клеток, антилинейный коктейль Peridinin chlorophyll protein-Cyanine5.5 (PerCp-Cy5.5) (1:10), Phycoerythrin-Cyanine5 (PE-Cy5)-anti-c-kit (1:200), Alexa Fluor 700(AF700)-анти-стволовые клетки антиген-1(Sca-1) (1:200), Brilliant Violet 711(BV711)-анти-CD16/32 (1:200), био-анти-CD34 (1:200), BV421-анти-CD127 (1:200), PE-CF594-анти-CD135 (1:200), BV510-анти-CD48 (1:200) и PE-Cy7-анти-CD150 (1:200).
   6. Ресуспендируйте клетки 1 мл сбалансированного солевого раствора Ганкса (HBSS) без Ca²⁺ и Mg²⁺ и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   7. Аспирируйте надосадочную жидкость и окрашивайте вторичным антителом к PE-стрептавидину (1:200) в течение дополнительных 60 минут при 4 °C.
   8. Ресуспендируйте клетки 1 мл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺) и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   9. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 300 мкл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺).
   10. Вихревой раствор для выполнения дальнейшего анализа проточной цитометрии. Дальнейший анализ полученных данных с помощью программного обеспечения проточной цитометрии для получения количественных данных о ГСК.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных и анализ проточной цитометрии относятся к нашим предыдущим статьям и вспомогательным материалам (Дополнительный рисунок S1) для типичных стратегий стробирования, используемых для идентификации HSPC¹⁰.
   11. Установите точечную диаграмму между боковой областью рассеяния (SSC-A) и прямой областью рассеяния (FSC-A) и определите окружающую область интересующей клеточной популяции (P1) на точечной диаграмме SSC-A и FSC-A во время сбора данных на проточном цитометре. Двойной клик по воротам P1; выберите высоту прямого рассеяния (FSC-H) для оси X и ширину прямого рассеяния (FSC-W) для оси Y, чтобы выполнить обработку адгезии первой ячейки. Дважды кликните по одноячеистым воротам; выберите высоту бокового рассеяния (SSC-H) для оси X и ширину бокового рассеяния (SSC-W) для оси Y, чтобы выполнить обработку адгезии второй ячейки. Используйте инструмент прямоугольного стробирования для выделения отдельных ячеек.
   12. Исключите мертвые клетки. Отличайте живые клетки от мертвых, обнаруживая маркеры жизнеспособности. Установите точечную диаграмму SSC-A и Live/Dead и определите область, соответствующую живым клеткам, назвав ее «живыми клетками».
   13. Проведите скрининг клеток, помеченных специфическими антителами, в «живых клетках». Исключите популяцию клеток, на которую может влиять положительная экспрессия линейно-специфических антител в линии миелоидных гемопоэтических стволовых/прогениторных стволовых/прогениторных клеток, используя линейно-отрицательное (лин^-) гейтинг. Затвор в ^{лин-клетках} .
   14. Скрининг различных субпопуляций клеток внутри ^{лин-клеток}. Дважды кликните по затвору ячейки; выберите Sca-1-AF700 для оси X и c-kit-PE-Cy5 для оси Y. Вентиль для клеток c-kit⁺Sca-1^- как клетки LKS, клетки c-kit⁺Sca-1⁺ как клетки LKS⁺, а клетки с низкой экспрессией c-kit и Sca-1 как клетки LK^loS^lo. Дважды щелкните по затвору LKS- и выберите CD34-PE для оси X и FCγR-BV711 для оси Y. Двойной клик по воротам LKS⁺; выберите FIt3-PE-CF594 для оси X и IL7Rα-BV421 для оси Y, а также выберите CD150-PE-Cy7 для оси X и CD48-BV510 для оси Y.
   15. Исходя из специфичности антител, определить положительные или отрицательные ворота для различения клеточных субпопуляций: гемопоэтических стволовых клеток (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁺) и дифференцированных гемопоэтических предшественников: мультипотентных предшественников (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁺CD48⁻CD150⁻), общих лимфоидных предшественников (Lin⁻c-kit-Sca-1-Flt3⁺IL7Rα⁺.), общие миелоидные предшественники (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁻), гранулоцитарно-моноцитарные предшественники (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁺FCγR⁺) и эритроидные предшественники мегакариоцитов (Lin⁻c-kit⁺Sca-1⁻CD34⁻FCγR⁻).

4. Модель облучения мыши

Мышей C57BL/6 облучали рентгеновскими лучами с использованием рентгеновского облучателя.

1. Для достижения сублетального нарушения кроветворной/иммунной системы мышей дикого типа (WT) в группе 5 Грей (Гр) фосфатно-солевого буфера (PBS), группе 5 Гр нативного костного мозга (БМ) и группе 5 Гр остеоорганоидов облучению 5 Гр (1,25 Гр/мин) за 24 ч до трансплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мыши WT в группе, получавшей PBS 0 Гр, лечатся PBS и не подвергаются облучению.

5. Процесс клеточной терапии

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться в стерильных условиях.

1. Получение in vivo остеоорганоидных и нативных клеток костного мозга
   1. Имплантируйте два биологически активных каркаса в мышечный мешок мышей C57BL/6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) и инкубируйте их в течение 12 недель для формирования остеоорганоидов in vivo . Соберите два остеоорганоида in vivo и две бедренные кости у одной мыши типа CD45.1, упомянутой выше. Затем очистите мягкие ткани на поверхности остеоорганоидов и бедренных костей с помощью щипцов и марли.
   2. Отдельно поместите остеоорганоиды и бедренные кости в ступку и добавьте 1 мл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺).
      ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺ может снижать агрегацию клеток. Раствор, используемый для трансплантации, не должен содержать компоненты сыворотки, чтобы избежать любых потенциальных реакций отторжения.
   3. Разрежьте образцы хирургическими ножницами и аккуратно раздавите их в ступке и пестиком.
   4. Отфильтровать клеточную суспензию через сетчатое фильтр 40 μм и центрифугировать при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы 300 мкл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺). Тщательно перемешайте, чтобы получить суспензию клеток, полученных из остеоорганоидов или целых клеток костного мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы в полной мере использовать клеточные коктейли, полученные из остеоорганоида in vivo, мы решили использовать для терапии цельные клетки костного мозга. Типичное общее количество клеток в 30 мкг BMP-2, индуцированного in vivo остеоорганоиде, составляет 30 000 000-40 000 000.
2. Инъекция орбитального венозного синуса
   Примечание: CD45.1⁺ цельные клетки костного мозга, собранные из остеоорганоидов или бедренных костей in vivo , вводили через орбитальный венозный синус сублетально облученному реципиенту C57BL/6 (CD45.2) соответственно. Инъекция орбитального венозного синуса и инъекция в хвостовую вену являются широко используемыми методами в экспериментах на животных. Инъекция орбитального венозного синуса была выбрана из-за ее простоты и низкого процента неудач для начинающих. В процессе орбитальной инъекции необходимо принимать определенные защитные меры, такие как предварительная анестезия мышей, использование нагреваемой пластины для снижения риска гипотермии и механическое удержание мышей для предотвращения движения.
   1. Поместите мышей CD45.2 в преданестезиологическую камеру и индуцируйте анестезию с помощью изофлурана. Нанесите смазывающую ветеринарную мазь вокруг глаз мышей, чтобы предотвратить сухость и противодействовать раздражению глаз, вызванному изофлураном.
      Примечание: Чтобы свести к минимуму вред для животных, перед инъекцией орбитального венозного синуса мышам вводят изофлурановую анестезию.
   2. Перенесите мышей на стол для анестезии для дальнейшей анестезии.
   3. Чтобы снизить вероятность переохлаждения у мышей, поместите облученную мышь под наркозом на термостатическую грелку, установленную при температуре 37 °C.
   4. Поместите мышь в левое боковое лежачее положение головой вправо после полного обезболивания.
   5. Чтобы выпячить глаз, поместите палец на макушку головы и вдоль линии подбородка. Аккуратно потяните кожу назад и вниз.
   6. С помощью шприца объемом 1 мл с иглой 25 G отсасывайте 200 мкл клеточной суспензии in vivo на основе остеоорганоидов или суспензии нативных клеток костного мозга мышей с CD45.1⁺ , полученных на шаге 5.1.5.
   7. Осторожно введите иглу, скошенную вниз, под углом примерно 30°, в медиальный кантус.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции обычно делаются со скосом иглы вверх, но для ретроорбитальных инъекций лучше расположить скос иглы вниз, чтобы снизить риск повреждения глаз.
   8. Используйте иглу, чтобы следовать по краю глазного яблока вниз, пока кончик иглы не окажется у основания глаза.
   9. Медленно и плавно вводите инъекционный препарат.
   10. После завершения инъекции поместите мышь обратно в клетку для восстановления.

6. Оценка эффектов лечения

1. Гематологический анализ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа гематологии реципиентов в анализах восстановления иммунной системы мы собрали образцы периферической крови у реципиентов, подвергшихся различным видам лечения: 0 Гр PBS, 5 Гр PBS, 5 Гр нативного BM и 5 Гр остеоорганоидного лечения. Образцы крови были получены с помощью ретроорбитальной пункции за 2 дня до и через 2, 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации. Часть образца крови той же группы была использована для гематологического анализа, а другая часть — для анализа химеризма. Существуют различные методы забора крови, например, через подчелюстную вену или хвостовую вену. Ретроорбитальная пункция является одним из распространенных методов забора крови у мышей и разрешена при соблюдении этических норм.
   1. Повторите шаги 5.2.1-5.2.5 для обезболивания мышей и выпучивания глаз мышей.
      Примечание: Для смягчения вреда для животных мышам вводят изофлуранную анестезию перед забором крови методом ретроорбитальной пункции.
   2. Расположите капиллярную трубку диаметром 0,5 мм в медиальном кантусе глаза и направьте ее каудально под углом 30°-45° относительно плоскости носа.
   3. Осторожно вращайте капиллярную трубку, оказывая давление, позволяя ей проникать через конъюнктивальные мембраны. Позвольте крови течь в капиллярную трубку с помощью капиллярного действия.
   4. Надавливайте на постоянное давление после того, как кровь начнет течь, чтобы поддерживать поток.
   5. После забора 100 μл крови немедленно ослабьте давление на шею. Одновременно удалите капиллярную трубку, чтобы позволить глазу вернуться в нормальное положение и предотвратить послеоперационное кровотечение из места пункции.
   6. Немедленно вытолкните кровь в центрифужную пробирку, которая была промыта 1,5% (по объему) раствором этилендиамина тетрауксусной кислоты дигидрата соли калия (ЭДТА-К2), а затем в нее было добавлено 10 мкл 1,5% (по массе) раствора ЭДТА-К2. Осторожно встряхните пробирку центрифуги, чтобы обеспечить тщательное смешивание раствора ЭДТА-К2 с кровью, предотвращая свертывание крови.
   7. Протерев рану стерильной ватой и слегка надавлив для остановки кровотечения, понаблюдайте за мышами в течение 1-2 минут после гемостаза, чтобы убедиться в отсутствии отклонений, а затем верните их в клетки.
   8. Проведите гематологический анализ части образцов крови каждой группы с помощью гематологического анализатора, включая количество лейкоцитов, эритроцитов (RBC) и тромбоцитов (PLT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте все образцы крови в течение 2 часов после сбора.
2. Анализ на химеризм периферической крови
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогично гематологическому анализу, образцы периферической крови из групп с индукцией 5 Гр и 5 Гр с остеоорганоидами были собраны с помощью ретроорбитальной пункции через 2, 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации.
   1. Используйте другую часть образца периферической крови, полученного на шаге 6.1, для анализа химеризма периферической крови.
   2. Добавьте в образец 1 мл буфера для лизиса эритроцитов и лизируйте в течение 3-5 минут. Аккуратно переверните образец вверх дном, чтобы способствовать лучшему лизису эритроцитов.
   3. Центрифугировать при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
   4. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺) для ресуспендирования гранулы.
   5. Центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Окрашивайте оставшиеся приблизительно 100 мкл клеток на дне центрифужной пробирки при температуре 4 °C в течение 30 мин с использованием антител, включая набор для окрашивания живых/мертвых клеток, PE-anti-CD45.1 (1:200), флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-анти-CD45.2 (1:200), PE-Cy7-анти-B220 (1:200), AF700-анти-CD11b (1:200), PerCp-Cy5.5-анти-CD8a (1:200), PE-Dazzle594-анти-CD4 (1:200) и аллофикецианин (APC)-анти-CD3e (1:200).
   6. Ресуспендируйте клетки 1 мл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺) и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   7. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 300 мкл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺).
   8. Вихревую суспензию проводят для проведения дальнейшего анализа проточной цитометрии.
   9. Дальнейший анализ полученных данных с помощью программного обеспечения проточной цитометрии для получения информации о частоте химеризма ГСКХ в периферической крови мышей-реципиентов как в группе с нативной КМ 5 Гр, так и в группе с остеоорганоидной обработкой 5 Гр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных проточной цитометрии обратитесь к дополнительному рисунку S2 для типичных стратегий гейтирования, используемых для идентификации донорских ^CD45.1+ клеток в периферической крови реципиентов CD45.2.
   10. Повторите шаги 3.4.11-3.4.12, чтобы определить область, соответствующую живым клеткам.
   11. Анализируйте химеризм периферической крови, первоначально идентифицируя клеточные популяции, а затем различая донорские и реципиентные клетки.
       1. Скрининг специфических клеток, меченных антителами, в живых клетках. Выберите CD11b-AF700 для оси X и B220-PE-Cy7 для оси Y. Гейты B220⁺CD11b-клетки как В-клетки, B220-CD11b⁺ клетки как миелоидные клетки, а B220-CD11b-клетки как двойные негативные (DN) клетки.
       2. Дважды щелкните по затвору DN-клеток, используя CD3-APC для оси X и SSC-A для оси Y. Загатите CD3⁺ клетки в Т-клетки.
       3. Дважды щелкните по затвору ячеек CD3⁺, выбрав CD4-PE-Dazzle594 для оси X и CD8-PerCp-Cy5.5 для оси Y. Гейтируйте CD8⁺CD4-клетки как цитотоксические Т-клетки (CTL), а CD8-CD4⁺ клетки как регуляторные Т-клетки (Treg).
   12. Наконец, проводится анализ химеризма периферической крови на клетках донора и реципиента. В указанных популяциях клеток дважды щелкните мышью, чтобы выбрать CD45.1-PE для оси X и CD45.2-FITC для оси Y. Загатите клетки CD45.1⁺ и выполните подсчет клеток, чтобы определить долю клеток CD45.1⁺ в клеточной популяции, отражающую таким образом скорость химеризма.
3. Анализ химеризма солидных органов
   Примечание: Через 16 недель после трансплантации были проанализированы химеры КМ, селезенки и тимуса в группе, получавшей БМ 5 Гр, и группе 5 Гр, получавших остеоорганоиды.
   1. Повторите шаги 5.1.1-5.1.4 для получения клеточных гранул, полученных из БМ.
   2. Поместите нейлоновый фильтр с плотностью 300 меш над чашкой для клеточных культур (6 см), содержащей 1 мл HBSS (без Ca²⁺, Mg²⁺).
   3. Поместите рассеченную селезенку или тимус на капроновый фильтр.
   4. Измельчите упомянутые органы с помощью передней резиновой пробки шприца объемом 5 мл до тех пор, пока не останется явной структуры ткани, только остаточная фиброзная ткань. Обращайтесь с клетками осторожно, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток.
   5. Соберите фильтрат и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   6. Удаляют надосадочную жидкость для получения клеточных осадков, выведенных из селезенки или тимуса.
   7. Добавьте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов к клеточным гранулам, полученным на этапах 6.3.1 и 6.3.6, и лизируйте в течение 3-5 мин.
   8. Повторите шаги 6.2.3-6.2.8 для окрашивания и анализа проточной цитометрии.
   9. Дальнейший анализ полученных данных с помощью программного обеспечения проточной цитометрии для получения информации о частоте химеризма ГСКК в солидных органах (КМ, селезенке и тимусе) мышей-реципиентов как в группе с нативной КМ мощностью 5 Гр, так и в группе с остеоорганоидной обработкой 5 Гр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных проточной цитометрии см. Дополнительный рисунок S2 для типичных стратегий гейтирования, используемых для идентификации донорских клеток CD45.1⁺ в КМ, селезенке и тимусе реципиентов CD45.2.
   10. Замените периферическую кровь на этапах 6.2.10-6.2.12 на КМ, селезенку и тимус для получения уровня химеризма солидных органов.

Результаты

В соответствии с протоколом, мы создали биоактивный каркас путем капания BMP-2 в разлагаемую желатиновую губку в стерильных условиях. Затем каркас был имплантирован в мышцы нижних конечностей мышей для создания in vivo остеоорганоидов. После инкубационного периода п...

Обсуждение

В этом протоколе мы представляем подход к созданию in vivo остеоорганоидов с костномозговыми структурами путем имплантации каркасов из желатиновой губки, загруженных BMP-2. Мы демонстрируем, что эти остеоорганоиды in vivo могут стабильно продуцировать терапевтиче...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AF700-anti-CD11b (M1/70)	eBioscience	56-0112-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
AF700-anti-Sca-1 (D7)	BioLegend	108141	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
APC-anti-CD3e (145-2C11)	Tonbo	20-0031-U100	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
bio-anti-CD34 (RAM34)	eBioscience	13-0341-82	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV421-anti-CD127 (IL-7Rα)	BioLegend	135023	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV510-anti-CD48 (HM48-1)	BioLegend	103443	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
BV711-anti-CD16/32 (93)	BioLegend	101337	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Capillary tube	Shanghai Huake Labware Co.	DC616297403604-100mm/0.5mm
Cell strainer	CORNING	352340
Ethanol	GENERAL-REAGENT	01158566
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution	Servicebio	G1105
Ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium salt dihydrate (EDTA-K2)	Solarbio	E8651
FITC-anti-CD45.2 (104)	BioLegend	109806	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Flowjo	Becton, Dickinson & Company		A flow cytometry.
Gelatin sponge	Jiangxi Xiangen Co.		Use under sterile conditions.
HBSS without Ca2+ and Mg2+	Gibco	14170112	HBSS without Ca2+ and Mg2+ can prevent cell aggregation.
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i Diff
iodine swabs	Xiangtan Mulan Biological Technology Co., Ltd.	01011	To prevent the infection after operation.
Isoflurane	RWD	R510-22-10	To avoid adverse effects of anesthesia waste gases on the environment and laboratory personnel, a gas recovery system should be used in conjunction.
Kraft paper			absorbent paper
LIVE/DEAD Fixable Near IR Dead Cell Staining Kit(used in 3.4.5)	Thermo Fisher Scientific	L34962	A live/dead staining kit. Store at -20 °C. Dissolve in 50 μL of DMSO for working solution.
lubricating vet ointment	Pfizer		To prevent dryness and counteract the ocular irritations caused by isoflurane.
Neutral balsam	Solarbio	G8590
nylon filter	Shanghai Shangshai Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd.		Used for cell filtration.
Paraffin liquid	Macklin	P815706
Paraformaldehyde (PFA) solution	Servicebio	G1101	Immersion fixation is used for routine animal tissues. The volume of fixative used is generally 10-20 times the tissue volume, and fixation at room temperature for 24 hours is sufficient.
PE-anti-CD45.1 (A20)	BioLegend	110708	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-CF594-anti-CD135 (A2F10.1)	BD Biosciences	562537	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy5-anti-c-kit (2B8)	BD Biosciences	105809	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-B220 (RA3-6B2)	BioLegend	103222	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Cy7-anti-CD150 (TC15-12F12.2)	BioLegend	115914	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PE-Dazzle594-anti-CD4 (GK1.5)	BioLegend	100456	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	57-33-0	Prepare for use at a concentration of 1% (w/v).
PerCp-Cy5.5-anti-CD8a (53-6.7)	BioLegend	100734	Store at 4 °C. Dilute 1:200 for staining.
PerCp-Cy5.5-anti-lineage cocktail	BD Biosciences	561317	Store at 4 °C. Dilute 1:10  for staining.
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Store at 4 °C. Use in clean bench.
rhBMP-2	Shanghai Rebone Biomaterials Co.		The concentration of rhBMP-2 in the stock solution is 1.0 mg/mL.
Staining buffer	BioLegend	420201	Store at 4 °C.
Xylene	GENERAL-REAGENT	01018114
Zombie UV Fixable Viability Kit (used in 6.2.5)	BioLegend	423108	A live/dead staining kit. For reconstitution, bring the kit to room temperature; add 100 µL of DMSO to one vial of Zombie UV dye until fully dissolved.