血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

要約

フロー下での血小板機能を評価し、マイクロ流体デバイスを使用してシミュレートされた止血蘇生法をモデル化でき、これは外傷および輸血医療に応用できます。

要約

マイクロ流体工学は、血管系を模倣する生理学的に関連性のある基質と流れを組み込んでいるため、血栓症と止血の側面を研究するための貴重なツールです。動脈の流れをシミュレートする高せん断環境では、マイクロ流体アッセイにより、流路の局所狭窄領域に多血小板血栓が形成されるため、血小板機能の研究が容易になります。少量のサンプルを許容するデバイスを利用することで、量が限られている患者サンプルや動物モデルからの流れ下での血小板機能の評価にも役立ちます。外傷患者のサンプルまたは血小板製品輸血後のサンプルを研究することは、血小板機能が重要な患者集団の治療戦略を指示するのに役立つ可能性があります。薬理学的薬剤による血小板阻害の効果も、このモデルで研究できます。このプロトコルの目的は、生理学的流れ、生物学的表面、および関連する止血メカニズムを組み込んだマイクロ流体プラットフォームを確立することです 外傷誘発性凝固障害と輸血医学の研究に影響を与える血小板機能を評価します。

概要

トラウマは、世界の主要な死因と障害の原因です。重傷は、外傷誘発性凝固障害(^TIC)1と呼ばれる、止血と血栓症の独特な内因性障害によってしばしば複雑になります。血小板はTICにおいて重要な役割を果たしており、適応機能と不適応機能の両方を持っていると説明されています²。損傷後の血小板機能障害のメカニズムは依然として不明であり、改善された蘇生と治療の開発を導くために、細胞応答をよりよく理解することが非常に重要です。損傷後の血小板機能に関する追加の厄介な問題は、外傷患者の血小板機能の現在の測定値の信頼性の不確実性です。

複数の研究により、臨床的出血表現型が知られていない軽傷の患者でさえ、凝^{集法などの}従来の血小板機能検査を使用して異常な血小板機能を持っていることが示されています^3,4。ただし、損傷環境で血小板機能を評価するための凝集法には、生理学的に関連する損傷表面の欠如、アゴニスト刺激への還元主義的アプローチ、全血インピーダンス凝集法によるサンプル希釈、光透過凝集法による血漿分離、およびサンプル評価の停滞が含まれます。さらに、この血小板機能の感度が真の細胞機能障害を表しているのか、それとも損傷の状況におけるベースラインの電気インピーダンスの増加などの測定アーティファクトを表しているのかは不明のままです²。したがって、トラウマの文脈で関連する血小板機能を研究することは、TICを理解するために重要であり、この分野には革新と改善の余地がかなりあります。

血小板機能の研究に伝統的に使用されてきたプラットフォームには、外傷や外傷誘発性凝固障害5に関連する血小板機能障害を理解するために重要な流体力学や流れ^{は含まれていません。}流れに依存する止血のメカニズムには、臨界せん断速度を超える高せん断でのフォン・ヴィレブランド因子(VWF)の伸長、および糖タンパク質1b ^6,7,8を介した血小板捕捉が含まれますが、これらは停滞した血小板機能アッセイでは捕捉されません。さらに、血小板は、血流レジームに応じてVWFまたはフィブリノーゲンに優先的に結合し、動脈血栓症と静脈血栓症において異なる役割を引き出します^9,10。動脈血栓は主に血小板で構成され、静脈血栓は主に赤血球で構成されており、一部はフローレジーム^{に基づいています11}。フローレジームを組み込んだアッセイは、凝固低下や出血表現型から凝固亢進性や血栓性表現型まで、TIC表現型のスペクトルに関連する機能障害の解明に役立ちます。最後に、外傷患者集団の血液量サンプリングの制約により、従来の血小板機能検査が困難になる可能性があります。このような状況では、フローサイトメトリーなどのアッセイを利用することができ、また利用すべきですが、多くの場合、結果はサンプルの物理的特性評価を示しており、止血機能評価ではありません。

外傷では血小板機能障害のメカニズムが完全に理解されていない場合がありますが、P2Y12拮抗薬など、in vitroでの血小板機能障害のモデリングも、治療介入の研究を導くのに役立ちます。止血蘇生法は、全血または血液成分(赤血球、血漿、血小板濃縮物)のいずれかを使用してショック、凝固障害、および内皮損傷に対処するためにバランスの取れたアプローチで血液製剤が輸血される外傷患者にとって非常に重要です12,13,14。外傷患者では、血液製剤の早期使用は生存率の向上と関連しています^15,16。貯蔵寿命を延ばすために、冷蔵保存された血小板製品がますます研究されています。冷蔵保存された血小板の検査では、止血活性の増加と、損傷後に輸血した場合の安全性が示されています^17,18。

冷蔵保存血小板蘇生法の進化は、外傷に対して利用可能な最も効果的な血小板製品を理解するための追加の検査の必要性を強調しています。しかし、従来の血小板機能アッセイは、機能障害を検出するために過剰または過小に増強されることが多く、治療用血小板輸血を受けている外傷患者と、血小板貯留病変に見られる輸血製品自体の両方で発生します。機能障害の原因を特定することは、現在の血小板機能アッセイの限界(これらのテストのほとんどに静的な性質が含まれている)を考えると、困難な場合があります。したがって、 in vitroで止血蘇生法を研究する場合、レシピエントと製品血小板集団の両方のプラットフォームと検出方法は、最適な治療介入を決定する上で非常に重要です。

マイクロ流体試験は、血小板を研究するための生理学的に適切なアッセイを作成するためのフロープロファイルとバイオフィデリック表面を提供します。マイクロ流体デバイスは、血管穿刺¹⁹ または内皮損傷²⁰のような特定の病態生理学または損傷タイプを研究するためにカスタマイズすることができる。これらのデバイスは、一般に、ポリジメチルシロキサン(PDMS)をガラス顕微鏡スライドに結合し、コラーゲンなどの表面改質を施して、内皮下や組織の損傷を模倣することで構成されています。これらのタイプのフローベースのデバイスを利用することで、外傷関連の血小板機能障害の研究を導き、血小板機能障害を改善するための最適な輸血医学アプローチを検討するのに役立ちます。これらの戦略は、負傷した患者における凝集法などの静的血小板アッセイの関連性に関する既存の混乱を明らかにするのに役立つ可能性があります。

プロトコル

すべての研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。ピッツバーグ大学ヒト研究保護オフィスからの承認が得られ、健康な人間のボランティアからのインフォームドコンセントが得られました。

1. マイクロ流体デバイスの調製

1. デバイスのPDMS部分を製造するには、コンピューター数値制御(CNC)マイクロマシニングを介して真鍮を使用してマスターモールドを準備します。
   注意: チャネルの寸法によっては、フォトリソグラフィー技術を使用してマスターモールドを作成できます。このプロトコルで使用されるデバイスには、幅約480μm、デバイスの入口と出口の高さが140μm、デバイスの狭窄部の高さが40μmの8つの並列マイクロマシニングチャネルが含まれ、狭窄領域との間のランプ長は約0.3mmです。チャンネルの長さは約6mmです。
2. 得られたマスターモールドを使用して、シリコンエラストマーベース(エラストマーキットから入手)を計量皿に注ぎます。シリコーンポリマー鎖の架橋を促進し、液体PDMSを耐久性と柔軟性のある固体に変換するシリコーン硬化剤(エラストマーキットから得られる)を10:1(ベース剤)の比率で添加し、混合物をよく攪拌します。
3. 型をペトリ皿に入れ、未硬化のPDMSを型に注ぎます。ペトリ皿を真空デシケーター内に30分間入れて、泡を取り除きます。
4. マスターモールドでのPDMSの硬化を完了するには、PDMSを70°Cに設定したオーブンに90分間入れます。
5. PDMSの硬化が完了したら、カミソリの刃やメスでマイクロ流路ギプスを切り取ります。チャネルの端に穴を開けます(両側の直径1.5 mm)。
6. ラボテープを使用して、スライドガラスの表面とマイクロ流体キャストのエッチング面を清掃します。必要に応じて圧縮空気を使用して、残っている破片を取り除きます。
7. スライドガラスとエッチング面を上向きにしたマイクロ流体キャストをプラズマクリーナーに入れます。真空ポンプを始動し、チャンバーを密閉し、プラズマクリーナーを高設定にします。スライドとPDMSをプラズマクリーナーに30秒間置いてから、プラズマクリーナーの電源を切り、真空を取り除きます。
8. プラズマクリーナーで上向きになっていた側面を優しく押し合わせて、プラズマクリーニングされたキャストとスライドガラスを結合します。次に、マイクロ流体デバイスを70°Cのオーブン/ホットプレートに10分間置きます。
   注:キャストとスライドガラスを接着するときは、チャネルの形態が失われる可能性があるため、圧力をかけすぎないでください。
9. 各チャンバーを10〜30μLの70%エタノールですすぎ、滅菌し、マイクロ流体デバイスを70°Cのホットプレートで乾燥させます。
   注:デバイスは少なくとも24時間前に作成する必要がありますが、数週間から数か月前に作成することもできます。デバイスは、密閉容器または蓋付きのペトリ皿に室温で保管する必要があります。
10. マイクロ流体デバイスでの実験の前日に、各チャンバーを10〜30μLの70%エタノールで再すすぎ、滅菌してマイクロ流体デバイスを70°Cのホットプレートで乾燥させます。
11. チャンバーを1型ウマ線維性コラーゲン試薬(1 mg/mL)でコーティングし、0.9% NaClで希釈し、1:5の容量比で、指定の出口から指定の入口まで通します。実験内で方向性が保存されていることを確認してください。コーティングされたコラーゲンがチャネル内で蒸発するのを防ぐために、デバイスを暖かく湿気の多い密閉容器に保管してください。
12. 1時間後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、コラーゲン溶液を洗い流します。コーティングの反対方向にフラッシュします。使用しないときは、デバイスを暖かく湿気の多い密閉容器に再度保管してください。

2.血液サンプルの準備

1. 静脈穿刺によりクエン酸全血サンプルを採取します。クエン酸全血をFC受容体ブロッキング溶液(1:600)でインキュベートします。
   注:血液サンプルは、実験前および実験中に室温で保存されます。
2. クエン酸全血を蛍光標識(お好みの蛍光色素を使用)CD41抗体(1:600)とインキュベートします。ナットロッカーで30分間染色します。
3. 血小板阻害のポジティブコントロールとして、PBSの30%w / v 2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP-β-CD)の溶液で再構成されたP2Y12受容体拮抗薬であるTicagrelorを追加します。.
   注:6.4 mMまでのチカグレロルストックを調製し、実験前にHP-β-CD溶液(PBSに溶解した30%HP-β-CD)でのチカグレロルストックをさらに希釈することができます(1,000倍のストック濃度を推奨)。
4. クエン酸サンプルをTicaglelor(最終濃度6.4 μMまで)と30分間インキュベートして、血小板阻害を観察します。
5. 血液製剤をクエン酸サンプルと混合する場合は、血液製剤をFC受容体ブロッキング溶液(1:600)および蛍光標識(クエン酸サンプルとは別の異なる蛍光色素を使用)CD41抗体(1:600)で染色します。
   1. 輸血した製品ユニットと同等の容量をクエン酸サンプルと混合します。たとえば、出血している人に輸血された 2 単位の血小板製剤 (製品あたり約 250 mL、総血液量 5,000 mL) をシミュレートするには、100 μL の血液製剤を 1,000 μL のクエン酸血液サンプルに混合します。
6. 実験の直前に、血液サンプルを40 μmフィルターでろ過し、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。

3. フロー下での血小板機能検査(方法1)

1. 顕微鏡と関連ソフトウェアの電源を入れます。
2. 回収シリンジポンプを顕微鏡のステージと同じレベルに設定します。シリンジポンプの設定を調整します。
   1. 式(1)および(2)²¹を使用して、チャネルの狭窄領域で3,500 ^s-1の所望の平均壁せん断速度(γ)の体積流量(Q)を計算します。
      (1)
      (2)
      ここで、Aはチャネルの断面積、Pは接液周囲長、λは形状係数、bは長方形の短辺(高さ)、aは長方形の長辺(幅)です。
      注:3,500 ^s-1の値は、VWF臨界せん断のために選択され、動脈レジーム^7,22,23にあります。
3. マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージに置きます。マイクロ流体デバイスの端をステージにテープで固定して、動きを避けます。コンセントが顕微鏡の背面を向いていることを確認してください。
4. 内径1/16インチチューブ(長さ約30cm)の一方の端をエルボーコネクターに接続し、もう一方の端を内径1/16インチコネクター付きの10mLシリンジに接続します。
5. シリンジに滅菌PBSを充填し、シリンジポンプに接続します。
6. エルボコネクタをデバイスのコンセントに差し込みます。
7. 長さ約10cmのインレットラインを用意し、一方の端にエルボーコネクタ、もう一方の端に角度のついたカットを配置します。
8. インレットエルボコネクタをデバイスインレットに接続します。
9. インレットラインを角度付きホルダーの廃マイクロ遠心チューブに配置します。
10. 幅約500μmのチャネル寸法の10倍対物レンズを使用し、マイクロ流体デバイスのチャネルエッジに焦点を当てます。
11. PBSでラインをプライミングし、シリンジポンプを手動で進めて、PDMS/破片のチャネルをクリアします。チャネルの入口と出口の近くを必ず確認してください。
12. 保存した画像キャプチャ設定を開くか、血液サンプルに使用された蛍光CD41抗体に対応する明視野チャネルと蛍光チャネルを使用して、1〜2秒ごとにキャプチャされた時系列画像の画像キャプチャ手順を作成します。
13. ろ過したクエン酸血液サンプルを採取し、実験の直前にピペッティングで上下させて混合します。角度のついた微量遠心分離機ホルダーにサンプルを置きます。
14. インレットラインをサンプルに配置します。
15. 画像キャプチャの記録を開始します。
16. ゆっくりとシリンジを引き出し、チューブ内のデッドボリュームを充填します。血液がチャネルに到達したら、すぐにシリンジポンプで 再生 を押して、目的のせん断速度で流れを再開します。
17. 必要に応じてフォーカスを調整します。
18. 血小板がマイクロ流体デバイスの狭窄領域を完全に閉塞するまで、または実験エンドポイント(つまり、10分)まで実験を実行します。
19. 実験期間中、インレットチューブが血液サンプルに沈められていることを確認してください。
20. 実験が完了したら、画像キャプチャを停止し、シリンジポンプを停止します。画像キャプチャーを保存します。
21. インレットエルボコネクタを取り外し、チューブの内容物を廃棄物円錐形に空にします。シリンジとアウトレットラインの内容物も廃棄物円錐形に空にします。
22. 後続のサンプルの必要に応じて、インレットコネクタとアウトレットコネクタ、およびチューブを交換します。

4. 少量サンプル(1mL未満)を用いたフロー下での血小板機能検査(方法2)

1. 上記のように手順 1.1 から 1.4 を繰り返します。
2. チャネルの端に直径1.5mmの出口と直径3mmの入口を打ち抜きます。
3. 上記のように手順1.6から3.6を繰り返します。
4. 幅約500μmのチャネル寸法の10倍対物レンズを使用し、マイクロ流体デバイスのチャネルエッジに焦点を当てます。
5. シリンジポンプを手動で進め、実験室のワイプでアクセス液を吸い上げて、PDMS/破片のチャネルをクリアします。マイクロ流体デバイスの上部にあるラボテープで破片を取り除きます。
6. ポンプを手動で進めて、3mmのインレットリザーバーにPBSを充填します。
7. 保存した画像キャプチャ設定を開くか、血液サンプルに使用された蛍光CD41抗体に対応する明視野チャネルと蛍光チャネルを使用して、1〜2秒ごとにキャプチャされた時系列画像の画像キャプチャ手順を作成します。
8. シリンジポンプで(手動または設定速度で)回収を開始し、PBSがチャネルに進み、リザーバーの充填ラインが下がったら、ポンプの回収を一時停止します。
9. ピペットでリザーバーから余分なPBSを取り除きます。
10. 画像キャプチャを開始します。
11. 血液サンプルをリザーバー(約40μL)にピペットで入れ、すぐに離脱シリンジを開始します。フローが開始されていることを確認します。
    注:ステップ4.8で回収用のシリンジポンプモーターがプライミングされなかった場合、フローはすぐには開始されず、実験を繰り返す必要があります。
12. 実験期間中は血液リザーバーを補充し、エアポケットがチャネルに入らないようにします。
13. 血小板がマイクロ流体デバイスの狭窄領域を完全に閉塞するまで、または実験の終点(すなわち、10分)まで実験を実行します。
14. 実験が完了したら、画像キャプチャを停止し、シリンジポンプを停止します。画像キャプチャーを保存します。
15. ピペッティングでリザーバー内の余分な血液を取り除きます。引き出しチューブの内容物を廃棄物の円錐形のチューブに空にします。
16. 後続のサンプルの必要に応じて、コネクタとチューブを交換します。

5. 除染

1. 血液の入口と出口のラインを10%漂白剤溶液に洗い流してきれいにします。
2. マイクロ流体デバイスのすべてのチャネルが使用されている場合は、デバイスをシャープスのバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。
   注:すべての生物学的廃棄物は、バイオハザード廃棄物として適切に処分する必要があります。

6. 画像解析

1. ソフトウェアを使用して速度論的実験から画像をエクスポートするには、[ファイル] |エクスポート/インポート |エクスポート。
2. 次のパラメータを選択します: filetype: Tagged Image File Format (TIFF);圧縮:LZW;オリジナルデータとシフトピクセルを確認してください。[表示カーブとチャンネルの色を適用] のチェックを外します。サブセットの定義(領域、長方形領域)をチェックし、条件間で幅と高さの測定値を節約するチャネル領域を選択します。目的のフォルダにエクスポートし、[フォルダの作成]をオンにします。
3. ソフトウェアで以下の実験値に注意してください:血液がチャネルに入ったときの開始フレーム。フレーム レート (情報、時系列)。
4. Supplemental File 1として提供されるMatlabコードを使用して、実験の各フレームの各フレームの正規化された平均蛍光強度を測定し、各実験の次の入力を変更します:実験の長さに基づく開始フレーム/終了フレーム(実験の長さが条件間で保存されていることを確認してください)。実験名/フォルダ名。X、Y、H、W パラメータのトリミング。コードをレシピエント血小板蛍光チャンネルに1回、製品血小板蛍光チャンネルに1回実行します。正規化されたMFI(2列目)と正規化されたAUC値(開始フレームに正規化された値)を報告します。正規化された AUC 値から実験の長さの値を減算します。

結果

この方法を使用した後のマイクロ流体実験では、流路の狭窄領域に多血小板血栓が形成されることが示されています(図1)。 図1A は、機能性血小板がチャネルの狭窄領域に血栓を形成してチャネルを通る血流を遮断する代表的な結果を示しています。実験期間中に撮影されたカイネティック画像の平均蛍光強度(MFI)曲線は、...

ディスカッション

上記のプロトコルには、実験の信頼性と再現性を確保するためのいくつかの重要なステップがあります。まず、蛍光抗体を慎重に検討する必要があります。サンプル中の血小板を検出するために使用される抗体は、糖タンパク質Ib(GPIb)血小板受容体の機能を阻害してはなりません。実験間で可能な限りロットマッチングを行うことも、蛍光シグナルの再現性を確保す?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer	Fisher Scientific	FB30786161
Nutating Mixer	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Scale	Uline	H-5852
Oven	Fisher Scientific	15-103-0520
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Software
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
10 mL syringe	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filters	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 antibody	Novus Biologicals	NB100-2614	1:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen Reagent	Chrono Log Corporation	385	1:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach	Fischer Scientific	50371500
Ethanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	1:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula	Fisher Scientific	18-001-017
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
Safety Scalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0.90%
Sartorius Polystyrene Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9285739	Polydimethylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Bar	McMaster-Carr	8954K721	For master mold fabrication
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626