Microfluídica na avaliação da função plaquetária

Resumo

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Resumo

A microfluídica incorpora substratos e fluxos fisiologicamente relevantes que mimetizam a vasculatura e são, portanto, uma ferramenta valiosa para estudar aspectos de trombose e hemostasia. Em ambientes de alto cisalhamento simulando fluxo arterial, um ensaio microfluídico facilita o estudo da função plaquetária, pois trombos ricos em plaquetas se formam em uma região estenótica localizada de um canal de fluxo. A utilização de dispositivos que permitem um pequeno volume de amostra também pode ajudar na avaliação da função plaquetária sob fluxo de amostras de pacientes com volume limitado ou modelos animais. O estudo de amostras de pacientes com trauma ou amostras após transfusão de produtos plaquetários pode ajudar a direcionar estratégias terapêuticas para populações de pacientes nas quais a função plaquetária é crítica. Os efeitos da inibição plaquetária via agentes farmacológicos também podem ser estudados neste modelo. O objetivo deste protocolo é estabelecer uma plataforma microfluídica que incorpore fluxo fisiológico, superfícies biológicas e mecanismos hemostáticos relevantes para avaliar a função plaquetária com implicações para o estudo da coagulopatia induzida por trauma e medicina transfusional.

Introdução

O trauma é uma das principais causas globais de morte e incapacidade. A lesão grave é frequentemente complicada por um distúrbio endógeno único de hemostasia e trombose, denominado coagulopatia induzida por trauma (TIC)¹. As plaquetas desempenham um papel crítico na TIC e foram descritas como tendo funções adaptativas e desadaptativas². Os mecanismos da disfunção plaquetária após a lesão permanecem obscuros, e há uma necessidade crítica de entender melhor a resposta celular para orientar o desenvolvimento de ressuscitação e terapia aprimoradas. Um problema adicional incômodo em relação à....

Protocolo

Todas as pesquisas foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais. A aprovação do Escritório de Proteção à Pesquisa Humana da Universidade de Pittsburgh foi obtida e o consentimento informado de voluntários humanos saudáveis foi obtido.

1. Preparação do dispositivo microfluídico

1. Para fabricar a parte PDMS do dispositivo, prepare um molde mestre usando latão por meio de microusinagem de controle numérico computadorizado (CNC).
   NOTA: Dependendo das dimensões do canal, técnicas de fotolitografia podem ser usadas para criar um molde mestre. O dispositivo usado neste ....

Resultados

Experimentos microfluídicos após o uso deste método devem mostrar a formação de trombos ricos em plaquetas na região de estenose do canal de fluxo (Figura 1). A Figura 1A ilustra resultados representativos em que as plaquetas funcionais formaram um trombo na região estenótica do canal para bloquear o fluxo sanguíneo através do canal. As curvas de intensidade média de fluorescência (MFI) das imagens cinéticas obtidas.......

Discussão

O protocolo acima tem algumas etapas críticas para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos experimentos. Primeiro, os anticorpos fluorescentes devem ser cuidadosamente considerados. Os anticorpos usados para detectar plaquetas na amostra não devem bloquear a função do receptor plaquetário da glicoproteína Ib (GPIb). A correspondência de lotes, sempre que possível entre os experimentos, também é fundamental para garantir a reprodutibilidade do sinal fluorescente. Outra.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer	Fisher Scientific	FB30786161
Nutating Mixer	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Scale	Uline	H-5852
Oven	Fisher Scientific	15-103-0520
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Software
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
10 mL syringe	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filters	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 antibody	Novus Biologicals	NB100-2614	1:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen Reagent	Chrono Log Corporation	385	1:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach	Fischer Scientific	50371500
Ethanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	1:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula	Fisher Scientific	18-001-017
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
Safety Scalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0.90%
Sartorius Polystyrene Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9285739	Polydimethylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Bar	McMaster-Carr	8954K721	For master mold fabrication
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626