Microfluidica nella valutazione della funzione piastrinica

Riepilogo

La funzione piastrinica sotto flusso può essere valutata e la rianimazione emostatica simulata può essere modellata utilizzando un dispositivo microfluidico, che ha applicazioni nella medicina traumatologica e trasfusionale.

Abstract

La microfluidica incorpora substrati e flussi fisiologicamente rilevanti che imitano la vascolarizzazione e sono, quindi, uno strumento prezioso per studiare gli aspetti della trombosi e dell'emostasi. In ambienti ad alto taglio che simulano il flusso arterioso, un saggio microfluidico facilita lo studio della funzione piastrinica, poiché i trombi ricchi di piastrine si formano in una regione stenotica localizzata di un canale di flusso. L'utilizzo di dispositivi che consentono un volume di campione ridotto può inoltre aiutare a valutare la funzione piastrinica sotto flusso da campioni di pazienti o modelli animali a volume limitato. Lo studio di campioni di pazienti traumatizzati o di campioni successivi alla trasfusione di prodotti piastrinici può aiutare a indirizzare le strategie terapeutiche per le popolazioni di pazienti in cui la funzione piastrinica è fondamentale. In questo modello possono essere studiati anche gli effetti dell'inibizione piastrinica tramite agenti farmacologici. L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire una piattaforma microfluidica che incorpori il flusso fisiologico, le superfici biologiche e i meccanismi emostatici rilevanti per valutare la funzione piastrinica con implicazioni per lo studio della coagulopatia indotta da traumi e della medicina trasfusionale.

Introduzione

Il trauma è una delle principali cause globali di morte e disabilità. La lesione grave è spesso complicata da un disturbo endogeno unico dell'emostasi e della trombosi, definito coagulopatia indotta da trauma (TIC)¹. Le piastrine svolgono un ruolo fondamentale nella TIC e sono state descritte come aventi funzioni sia adattative che disadattive². I meccanismi della disfunzione piastrinica dopo la lesione rimangono poco chiari e vi è un bisogno critico di comprendere meglio la risposta cellulare per guidare lo sviluppo di una migliore rianimazione e terapia. Un ulteriore problema fastidios....

Protocollo

Tutte le ricerche sono state condotte nel rispetto delle linee guida istituzionali. È stata ottenuta l'approvazione dall'Ufficio per la protezione della ricerca umana dell'Università di Pittsburgh ed è stato ottenuto il consenso informato da volontari umani sani.

1. Preparazione del dispositivo microfluidico

1. Per fabbricare la parte PDMS del dispositivo, preparare uno stampo master utilizzando l'ottone tramite microlavorazione a controllo numerico computerizzato (CNC).
   NOTA: A seconda delle dimensioni del canale, le tecniche di fotolitografia possono essere utilizzate per crea....

Risultati

Gli esperimenti microfluidici successivi all'uso di questo metodo dovrebbero mostrare la formazione di trombi ricchi di piastrine nella regione di stenosi del canale di flusso (Figura 1). La Figura 1A illustra i risultati rappresentativi in cui le piastrine funzionali hanno formato un trombo nella regione stenotica del canale per bloccare il flusso sanguigno attraverso il canale. Le curve di intensità media di fluorescenza (MFI.......

Discussione

Il protocollo di cui sopra prevede alcuni passaggi critici per garantire l'affidabilità e la riproducibilità degli esperimenti. Innanzitutto, gli anticorpi fluorescenti devono essere attentamente considerati. Gli anticorpi utilizzati per rilevare le piastrine nel campione non devono bloccare la funzione del recettore piastrinico della glicoproteina Ib (GPIb). Anche la corrispondenza dei lotti, quando possibile tra gli esperimenti, è fondamentale per garantire la riproducibilità del s.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer	Fisher Scientific	FB30786161
Nutating Mixer	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Scale	Uline	H-5852
Oven	Fisher Scientific	15-103-0520
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Software
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
10 mL syringe	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filters	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 antibody	Novus Biologicals	NB100-2614	1:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen Reagent	Chrono Log Corporation	385	1:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach	Fischer Scientific	50371500
Ethanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	1:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula	Fisher Scientific	18-001-017
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
Safety Scalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0.90%
Sartorius Polystyrene Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9285739	Polydimethylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Bar	McMaster-Carr	8954K721	For master mold fabrication
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626