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要約

このプロトコルは、腸間膜虚血再灌流障害を誘発し、生体内顕微鏡を使用して腸間小静脈の好中球細胞外トラップ(NET)を視覚化する方法を提示します。上腸間膜動脈の血流を1時間制限し、その後再灌流を行ったため、白血球の接着とNETosisを直接定量化することができました。

要約

腸管虚血再灌流(I / R)損傷は、腸間膜血管への血流の制限に起因する組織損傷を特徴とする急性疾患であり、予後不良の局所および全身の病状を引き起こします。虚血と再灌流はどちらも一連の細胞および分子反応を引き起こし、炎症細胞は病理の主要な調節因子として機能します。虚血性内皮とのこれらの相互作用は、複数の接着受容体によって媒介されます。この病理を模倣し、関与する分子経路を調査するために、いくつかの動物モデルが確立されています。この研究では、I/R 損傷の顕微手術モデルを生体内顕微鏡法と組み合わせて、白血球の転がり、接着、および好中球の細胞外トラップ (NET) 形成を視覚化します。このモデルは、内皮PAR1(F2r)を欠損したトランスジェニックマウスに適用され、虚血の1時間後および再灌流直後の白血球ローリングおよびNET形成に対するPAR1の影響を評価します。 In vivoでは、Acridine Orange白血球染色法を使用し、核酸染色を用いてNETsを可視化しました。興味深いことに、白血球接着の減少とNET形成は、内皮PAR1受容体を欠損したマウスで観察されました。このモデルにより、I/R損傷に関与する主要なレギュレーターの in vivo 分析が可能になります。

概要

急性腸間膜虚血 (AMI) は、死亡リスクが高いまれな病理1 であり、腹腔軸の血栓による腸間膜の血流の減少、または上腸間膜動脈または下腸間膜動脈の減少を特徴としています。症例の60%〜70%では、血栓症または塞栓術による上腸間膜動脈の急性閉塞が急性腸虚血の原因です3。対照的に、症例の5〜15%で、腸間膜静脈血栓症は、上腸間膜静脈、まれに下腸間膜静脈が関与する腸間膜虚血の原因となります4。虚血から生じる低酸素症と栄養失調は、細胞レベルでのエネルギー代謝障害につながります5。例えば、ミトコンドリアの機能障害は、複数のシグナル伝達経路を活性化し、細胞死メカニズムを開始します6。迅速な再灌流により好気性代謝の回復が可能となりますが、虚血領域への血流の回復は、活性酸素種(ROS)産生7、カルシウム過剰8、内皮機能障害9、炎症反応10により、しばしば広範な組織損傷を引き起こします。

虚血再灌流(I/R)損傷時の分子機構を解明するために、上腸間膜動脈の一時的な血管閉塞を用いた実験動物モデルが多数確立されている11。このようなモデルを生体内顕微鏡(IVM)と組み合わせて使用することは、根底にある細胞相互作用と疾患の進行に関する洞察を得るための基本です11。腸管バリア機能障害は虚血の直後に観察され12、上皮の完全性が失われ13、腸間膜リンパ節、脾臓、肝臓、腎臓などの腸外部位への細菌の転座を引き起こします 12,14。再灌流は粘膜損傷をさらに悪化させる15。細動脈の炎症反応は、L-セレクチン16、P-セレクチン(CD62P)17、血小板GPIIb/IIIa、フィブリノーゲン18などの分子に依存する内皮細胞層上の白血球の転がり固い接着によって現れます。興味深いことに、腸間小静脈への白血球の接着は、腸内細菌叢19およびToll様受容体4シグナル伝達10の存在によって影響を受ける。I/R損傷は、好中球の細胞外トラップ(NET)形成も引き起こします10。好中球などの活性化白血球に由来する細胞外DNAの治療的標的化は、腸内I/R損傷の転帰を改善する20。肝臓では、I/R損傷は常在するマイクロファージ21によって発火し、マイクロRNAの阻害は特にアポトーシスを弱める22。注目すべきは、腸間膜のI/R損傷は腸内細菌叢症を引き起こし、これは可逆的であり、血行再建術23の後に解消されます。

内皮は、I / R損傷の損傷の影響も受け、ROSはそのプロセスにおいて極めて重要な役割を果たします24。白血球の内皮細胞層への接着、内皮損傷、および一酸化窒素(NO)代謝の変化が観察されます9。しかし、関与する分子経路はまだ完全には解明されていません。

プロテアーゼ活性化受容体1(PAR1、 F2r)は、内皮細胞を含む様々な細胞によって発現される膜受容体であり、炎症状態中に活性化される25。その活性化は、セリンプロテアーゼがN末端で受容体を切断し、つながれたリガンドを露出させ、分子の2番目の細胞外ループに結合することによって受容体を活性化するときに発生します26。内皮タンパク質C受容体(EPCR)-PAR1シグナル伝達経路は、内皮NO恒常性に影響を与え、末梢虚血における血流の回復を促進する27。

本研究では、内皮細胞特異的なPAR1欠損を特徴とする遺伝マウスモデルにI/R損傷を適用し、白血球の転がり、接着、NET形成を可視化した。I/Rマイクロサージェリー後の遺伝的マウスモデルと生体内顕微鏡法の組み合わせは、疾患の進行に関与する特定の細胞タイプを強調することにより、貴重な洞察を提供します。I/R損傷を遺伝的マウスモデルに適用することは、疾患の経過を改善するために使用できる潜在的な治療標的を特定するのに役立ちます。さらに、NETosisにおける内皮PAR1の重要性が示されました。

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プロトコル

マウスを含むすべての手順は、動物の立法に関する地元の委員会(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz、Koblenz、Germany;G21-1-041)。生後6-8週齢のオスとメスのB6。FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarcマウスを用いた。F2r(PAR1)の内皮細胞特異的な調節は、VE-Cadherin Creプロモーター28を介して起こる。本研究では、flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC) は内皮細胞上での F2r (PAR1) 発現の低下を示し、flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) は正常な内皮 F2r (PAR1) レベルを発現しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、材料表に記載されています。

1. 手術の準備

  1. 必要な手術器具(極細ハサミストレート、鉗子、血管クランプなど)を滅菌します。
  2. 酸素とイソフルランベースの麻酔システムをノーズコーンと加熱プレートで準備します。

2.動物の調理

  1. 動物の体重を量ります。
  2. 麻酔の実施: ミダゾラム (5 mg/kg)、メデトミジン (0.5 mg/mL)、およびフェンタニル (0.5 mg/kg) を含む溶液の腹腔内 (i.p.) 注射 により マウスに麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。
  3. 首と腹部の手術部位の毛を小動物用の電動シェーバーで取り除きます。
  4. マウスを加熱パッドの背側横臥位に配置し、ノーズコーン を介して 酸素システムに接続します。マウスの手足をサージカルテープで加熱されたパッドに固定します。ラテックスノーズコーンメンブレンがマウスの頭にしっかりとフィットしていることを確認します。げっ歯類専用の体温計を使用して、動物の体温を直腸で監視します。
  5. 脱毛クリームを塗って首の手術部位に残った毛を取り除き、手術部位の皮膚を70%エタノールで拭きます。
  6. つま先つま先つまみテスト(ペダル反射)を実施して、動物が完全に麻酔をかけられていることを確認します。

3. 外科的処置

  1. 頸静脈へのカテーテル留置術
    1. 気管を横切開(~0.5cm)し、首を覆っている皮膚を取り除き、右頸静脈を分離します。
    2. 約5cmの絹糸を使用し、静脈の遠位端を閉じ、外科用鉗子で固定します。静脈の約2 cm下に3本の絹糸を置きます:1本は頸静脈の遠位端に近く、2本は近位端に近くます。外科用結び目を結びますが、血管を閉じないでください。
    3. 0.9% NaCl を充填し、1mL シリンジで塞いだポリエチレン カテーテル (内径 0.28 mm、外径 0.61 mm) を準備します。ハサミを使って2番目と3番目の結び目の間に穴を開け、カテーテルを頸静脈に埋め込みます。シリンジを吸引して、カテーテルに血液が存在することを確認します。
    4. 絹糸を結んでカテーテルを静脈に固定し、しっかりと固定されていることを確認します。医療用テープを使用してシリンジを固定します。
    5. アクリジンオレンジを調製する:1 mLシリンジで滅菌生理食塩水(最終濃度0.5 mg / mL)で2 mg / mLストック溶液を1:4で希釈します。.シリンジを暗所に置き、マウスに50μLを注入します。
    6. 核酸色素を調製する:1 mLシリンジで、滅菌生理食塩水(最終濃度5 μM)を含む5 mMストック溶液を1:1000に希釈します。シリンジを暗所に置き、マウスに50μLを注入します。
    7. 頸静脈カテーテル を介して in vivoのアクリジンオレンジ(50 μg/μL、マウスあたり50 μL)を注入して、好中球細胞外トラップ(NET)を染色するのと同様に、染色された白血球と細胞外DNA蛍光色素を視覚化します(マウスあたり5 μM、50 μL)。NETと白血球を同時に画像化します。
  2. 腸間膜I/R損傷モデル
    1. 腹部の皮膚を70%エタノールで消毒します。
    2. 手術用ハサミを使用して、 alba線 に沿って3〜5cm開腹術を行います。
    3. 生理食塩水で湿らせた2つのコットンチップを使用して、腸をそっと取り除き、脂肪被覆が最小限に抑えられた場所を特定します。小さな腸の枝を黒い生地の上に配置して、バックグラウンドシグナルを減らします。
    4. I/R(虚血前)の前に動画を取得してください。
    5. NaClで水分を圧縮し、その中に腸を置きます。ステップ5.6では、腸が湿布に囲まれ、水分が維持されていることを確認します。
    6. 小さな血管クランプで上腸間膜動脈を閉塞します。
    7. 生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して腸を腹腔内にそっと押し戻し、7-0縫合糸を使用して腹壁を閉じ、水分と温度の損失を防ぎます。虚血を60分間維持し、少なくとも20分ごとに麻酔をチェックします。
    8. 1時間後、クランプを取り外して再灌流を開始します。
      注:虚血手順を適切に実行すると、目に見える変化が生じます。最初は、血流が不足しているため、患部は青白くまたは白く見えます。クランプを取り外すと、血流は徐々に虚血領域に戻り、虚血領域は正常な色に戻り、閉塞が成功したことを意味します。虚血段階を通じてマウスを連続的に観察することが不可欠です。
    9. 虚血期の後、クリップされた領域に生理食塩水を数滴塗布し、クリップアプライヤーを使用して微小血管クリップをそっと取り外します。
    10. 生理食塩水で湿らせた綿の先端を使用して、腸を再び穏やかに取り除き、静脈の小さな枝を黒い生地に配置し、50μLのアクリジンオレンジを再度注入し、同じ場所で同じ静脈のビデオをキャプチャします(虚血後)。

4. Intravital High-speed Video Epifluorescence Microscopy(生体内高速ビデオ落射蛍光顕微鏡)

  1. 長距離コンデンサー、モノクロメーター、10倍水浸対物レンズ、電荷結合デバイスカメラを搭載した高速広視野蛍光顕微鏡で、白血球とNETを可視化します。画像取得は、30 msの露光時間とAlexa Fluor 488(495/519)およびRhodamine Red(570/590)フィルターを使用して行いました。
  2. 画像の取得と分析には、イメージングソフトウェアを使用します。
  3. 0.06 mm²の関心領域内の細胞動員を定量化します。
  4. 付着性白血球を、20秒間の観察期間、静止したまままたは内皮の内層に付着した細胞として定量化します。
  5. NETは、白血球と細胞外核酸蛍光色素の両方で標識された細胞外構造として同定します。
  6. 実験の最後に子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させます(制度的に承認されたプロトコルに従います)。

5. 肝臓内皮細胞(LEC)の単離と定量的RT-PCR

  1. 磁気セルソーティング(MACS) による LECの単離29.
  2. 全RNAを単離します。
  3. 2 μgの全RNAを2 μLのRT Buffer、0.8 μLのdNTP Mix、2 μLのRT Random Primers、1 μLの逆転写酵素、および4.2 μLの滅菌蒸留H2Oと混合することにより、相補的DNA(cDNA)合成27を実行します。
  4. cDNA転写は、25°Cで10分間、37°Cで120分間、85°Cで5分間の条件を適用して行いました。
  5. qPCRには20 ngのcDNAを使用します。
  6. 次のプライマーを使用してください: F2r (フォワード):TGAACCCCCGCTCATTCTTTC、 F2r (リバース):CCAGCAGGACGCTTTTTTTTT、 L32 (フォワード):CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC、 L32 (リバース):TCTGGGTTTCCGCCAGTTT。次の条件を使用します:95 °C 30 s、45 サイクル (95 °C で 10 秒、60 °C で 25 秒)、60 °C から 95 °C で 6 秒、ΔΤ 1 °C で。

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結果

白血球のローリングと接着、およびNET形成に対する内皮細胞依存性の影響を研究するために、最初に、VE-Cadherin Cre誘導性 F2r欠損症の有効性を内皮細胞で調べました。磁気細胞ソーティングを用いて、肝内皮細胞を単離した。続いて、RNAを単離し、続いて定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を行った。VE-カドヘリンプロモーターの制御下で発現したCre組換え酵素が存?...

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ディスカッション

腸間膜I/R損傷と生体内顕微鏡検査を併用し、内皮細胞のF2r(PAR1)欠損の遺伝子マウスモデルに適用し、虚血1時間後の白血球およびNETのin vivo解析を行った。腸間膜I/R損傷モデルは、虚血と再灌流の両方の時間が数分から数時間23,31まで変化するげっ歯類で頻繁に使用され、炎症結果32および死亡?...

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開示事項

著者は、利益相反を開示していません。

謝辞

C.R.は、Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz and ReALity(プロジェクトMORE)、BMBF Cluster4Future CurATime(プロジェクトMicrobAIome;03ZU1202CA)、Wilhelm Sander-Stiftung(Nr.2022.131.1)、およびDeutsche Zentren der Gesundheitsforschung(DZG)イノベーションファンド「Microbiome」(81X2210129)からの資金提供を認めています。C.R.は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK)の科学者です。C.R.は、ヨハネス・グーテンベルク・マインツのCenter for Translational Vascular Biology(CTVB)、Research Center for Immunotherapy(FZI)、およびPotentialbereich EXPOHEALTHのメンバーです。C.R.はDFG研究ユニット5644 INFINITE(RE3450/15-1)のメンバーです。ヨハネス・グーテンベルク・マインツ大学のグーテンベルク研究大学からフェローシップを授与されました。株式会社は、DZHKの「Promotion of Women Scientists」エクセレンスプログラムの支援を受けており、Young DZHKのメンバーです。Z.G.とO.D.は、マインツ・リサーチ・スクール・オブ・トランスレーショナル・バイオメディシン(TransMed)の博士課程の学生です。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acridine orangeSigma-Aldrich  A-6014
96-well plate Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Anaesthesia Systems for RodentsGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
black doughStaedtlermodelling clay
CD146 Microbeads, mouseMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3software
charge-coupled device cameraHamamatsu PhotonicsORCA-R2camera
cotton swabsBöttger09-119-9100
Curved Hemostat 125mm/5"Indigo Instruments 22466
Depilatory creamBaleanot applicable
Dorbene Vetzoetis
Dumont ForcepsFine Science Tools11251-35
Ethanol p.a. 99,5 %Roth5504.20
Extra Narrow Scissors – Straight/Sharp-Sharp/10.5FST14088-10
FentanylJanssen-Cilag GmBH
Forceps "Dumont #5" (Inox, tip 0.1mm, length 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10software
isoflurane Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Leukofix medical tapeBSNMedical0213600
Liver Dissociation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Separation columns MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 µmMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
Needle holderFST12001-13
Nonabsorbable Braided Silk Suture, Size: 7/0, 91 Meters Fine Science Tools18020-70
Olympus BX51WI fluorescence microscopeOlympusmicroscope
PCR for Tube StripsSarstedt72985002.00
PCR Tube LidsSarstedt65989002.00
Plyethylene CatheterSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polypropylen 6-0, Nahtmaterial Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Reverse Tanscription Kit (High Capacity cDNA)Applied Biosystems4368813.00
School scale KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Spring Scissors - Angled to SideFST15006-09
Stereo microscopeLeicaM50
Straight Hemostats 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Syringe 1 mLBraun9166017V
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Temperature Controller TC-1000FMI Föhr Medical Instruments GmbHnot applicable
Tissue Forceps - 1x2 TeethFST18057-14
vascular clampFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

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