Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo per indurre il danno da ischemia-riperfusione mesenterica e visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) nelle venule mesenteriche utilizzando la microscopia intravitale. Il flusso sanguigno nell'arteria mesenterica superiore è stato limitato per 1 ora, seguito da riperfusione, consentendo la quantificazione diretta dell'adesione leucocitaria e della NETosi.

Abstract

Il danno da ischemia-riperfusione intestinale (I/R) è una condizione acuta caratterizzata da un danno tissutale derivante da un limitato flusso sanguigno ai vasi mesenterici, che porta a patologie sia locali che sistemiche con prognosi infausta. Sia l'ischemia che la riperfusione innescano una serie di risposte cellulari e molecolari, con le cellule infiammatorie che fungono da regolatori chiave della patologia. Queste interazioni con l'endotelio ischemico sono mediate da più recettori di adesione. Diversi modelli animali sono stati stabiliti per imitare questa patologia e studiare i percorsi molecolari coinvolti. In questo studio, un modello microchirurgico di lesione I/R è combinato con la microscopia intravitale per visualizzare il rotolamento, l'adesione e la formazione di trappole extracellulari (NET) dei leucociti. Questo modello viene applicato a topi transgenici carenti di PAR1 endoteliale (F2r) per valutare l'impatto di PAR1 sul rollio leucocitario e sulla formazione di NET 1 ora dopo l'ischemia e immediatamente dopo la riperfusione. In vivo, è stata impiegata la colorazione leucocitaria Acridina Orange e i NET sono stati visualizzati utilizzando una colorazione con acido nucleico. È interessante notare che una ridotta adesione leucocitaria e la formazione di NET sono state osservate nei topi privi del recettore endoteliale PAR1. Questo modello consente l'analisi in vivo dei principali regolatori coinvolti nel danno I/R.

Introduzione

L'ischemia mesenterica acuta (IMA) è una patologia rara¹ ad alto rischio di mortalità², caratterizzata da una riduzione del flusso sanguigno nel mesentere a causa di trombi nell'asse celiaco, o nell'arteria mesenterica superiore o inferiore. Nel 60%-70% dei casi, le occlusioni acute dell'arteria mesenterica superiore dovute a trombosi o embolizzazione sono responsabili dell'ischemia intestinale acuta³. Al contrario, nel 5-15% dei casi, la trombosi venosa mesenterica rappresenta l'ischemia mesenterica che coinvolge la vena mesenterica superiore e, più raramente, la vena mesenterica inferiore⁴. L'ipossia e la malnutrizione derivanti dall'ischemia portano a disturbi del metabolismo energetico a livello cellulare⁵. Ad esempio, la funzione mitocondriale compromessa attiva molteplici vie di segnalazione, avviando meccanismi di morte cellulare⁶. Sebbene la riperfusione rapida consenta il ripristino del metabolismo aerobico, il ripristino del flusso sanguigno in una regione ischemica spesso causa un esteso danno tissutale a causa della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS)⁷, sovraccarico di calcio⁸, disfunzione endoteliale⁹ e risposte infiammatorie¹⁰.

Molti modelli animali sperimentali che impiegano l'occlusione vascolare temporanea dell'arteria mesenterica superiore sono stati stabiliti per chiarire i meccanismi molecolari durante il danno da ischemia-riperfusione (I/R)¹¹. L'uso di tali modelli in combinazione con la microscopia intravitale (IVM) è fondamentale per ottenere informazioni sulle interazioni cellulari sottostanti e sulla progressione della malattia¹¹. La disfunzione della barriera intestinale si osserva poco dopo l'ischemia¹², con l'epitelio che perde la sua integrit๳, con conseguente traslocazione batterica in siti extraintestinali come i linfonodi mesenterici, la milza, il fegato e i reni^12,14. La riperfusione aggrava ulteriormente la lesione della mucosa¹⁵. Una risposta infiammatoria nelle arteriole si manifesta con l'adesione rotolante e salda dei leucociti sullo strato cellulare endoteliale, che dipende da molecole come la L-selectina¹⁶, la P-selectina (CD62P)¹⁷, la GPIIb/IIIa piastrinica e il fibrinogeno¹⁸. È interessante notare che l'adesione dei leucociti alle venule mesenteriche è influenzata dalla presenza del microbiota intestinale¹⁹ e del recettore Toll-like 4 di segnalazione¹⁰. La lesione I/R innesca anche la formazione di trappole extracellulari neutrofile (NET)¹⁰. Il targeting terapeutico del DNA extracellulare, originato da leucociti attivati come i neutrofili, migliora l'esito del danno I/R intestinale²⁰. Nel fegato, il danno I/R viene innescato dai microfagi residenti²¹ e l'inibizione del microRNA attenua notevolmente l'apoptosi²². Da notare che la lesione I/R nel mesentere provoca disbiosi intestinale, che è reversibile e si risolve dopo la rivascolarizzazione²³.

L'endotelio è anche influenzato dagli effetti dannosi del danno I/R, con i ROS che svolgono un ruolo fondamentale nel processo²⁴. Si osservano l'adesione dei leucociti allo strato cellulare endoteliale, il danno endoteliale e le alterazioni del metabolismo dell'ossido nitrico (NO)⁹. Tuttavia, i percorsi molecolari coinvolti non sono ancora stati completamente esplorati.

Il recettore 1 attivato dalla proteasi (PAR1, F2r), è un recettore di membrana espresso da una varietà di cellule, comprese le cellule endoteliali, ed è attivato durante le condizioni infiammatorie²⁵. La sua attivazione avviene quando le serina proteasi scindono il recettore all'N-terminale, esponendo il ligando legato che, a sua volta, attiva il recettore legandosi al secondo loop extracellulare della molecola²⁶. La via di segnalazione del recettore endoteliale della proteina C (EPCR)-PAR1 influisce sull'omeostasi endoteliale dell'NO e facilita il ripristino del flusso sanguigno nell'ischemia periferica²⁷.

In questo studio, il danno I/R è stato applicato a un modello murino genetico caratterizzato da deficit di PAR1 specifico per le cellule endoteliali per visualizzare il rotolamento, l'adesione e la formazione di NET nei leucociti. La combinazione di un modello genetico murino e della microscopia intravitale dopo la microchirurgia I/R fornisce preziose informazioni evidenziando i tipi cellulari specifici coinvolti nella progressione della malattia. L'applicazione del danno I/R a modelli murini genetici è fondamentale per identificare potenziali bersagli terapeutici che possono essere utilizzati per migliorare il decorso della malattia. Inoltre, è stata dimostrata l'importanza di PAR1 endoteliale nella NETosi.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato locale per la legislazione degli animali (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Coblenza, Germania; G21-1-041). Maschio e femmina B6 di 6-8 settimane. Per lo studio sono stati utilizzati topi FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc. La regolazione endoteliale cellulo-specifica di F2r (PAR1) avviene tramite il promotore VE-Caderina Cre²⁸. In questo studio, flox-F2r x VE-Caderin Cre⁺ (F2R^ΔEC) ha mostrato una ridotta espressione di F2r (PAR1) sulle cellule endoteliali e flox-F2r x VE-Caderina Cre^- (WT) esprimono livelli normali di F2r endoteliale (PAR1). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione per l'intervento chirurgico

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici necessari (forbici extra strette dritte, pinze, pinza vascolare, ecc.).
2. Preparare il sistema di anestesia a base di ossigeno e isoflurano con un cono nasale e una piastra riscaldante.

2. Preparazione degli animali

1. Pesare l'animale.
2. Eseguire l'anestesia: anestetizzare i topi tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione contenente midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,5 mg/mL) e fentanil (0,5 mg/kg) (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
3. Rimuovere i peli dall'area operativa del collo e dell'addome con un rasoio elettrico per piccoli animali.
4. Posizionare il mouse in decubito dorsale sul termoforo e collegarlo al sistema di ossigeno tramite un cono. Fissare gli arti del mouse a un tappetino riscaldato con nastro chirurgico. Assicurarsi che la membrana del cono del naso in lattice aderisca saldamente alla testa del mouse. Monitora la temperatura corporea dell'animale per via rettale utilizzando un termometro specifico per roditori.
5. Applicare la crema depilatoria per rimuovere i peli rimanenti dall'area chirurgica del collo e pulire la pelle dell'area dell'operazione con etanolo al 70%.
6. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi (riflesso del pedale) per assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato.

3. Procedura chirurgica

1. Impianto di catetere nella vena giugulare
   1. Praticare un'incisione trasversale (~0,5 cm) sulla trachea, rimuovere la pelle che copre il collo e isolare la vena giugulare destra.
   2. Utilizzare un filo di seta di circa 5 cm, chiudere l'estremità distale della vena e fissarla con una pinza chirurgica. Posizionare tre fili di seta a circa 2 cm sotto la vena: uno vicino all'estremità distale e due vicino all'estremità prossimale della vena giugulare. Fai un nodo chirurgico, ma non chiudere il vaso.
   3. Preparare un catetere in polietilene (0,28 mm ID, 0,61 mm OD) riempito con NaCl allo 0,9% e collegato con una siringa da 1 mL. Usa le forbici per praticare un foro tra il secondo e il terzo nodo e impiantare il catetere nella vena giugulare. Aspirare la siringa per assicurarsi che il sangue sia presente nel catetere.
   4. Fissare il catetere nella vena legando il filo di seta, assicurandosi che sia fissato saldamente. Utilizzare del nastro adesivo per fissare la siringa.
   5. Preparare l'arancia acridina: diluire la soluzione madre 1:4 a 2 mg/mL con soluzione fisiologica sterile (concentrazione finale 0,5 mg/mL) in una siringa da 1 mL. Tenere la siringa al buio e iniettare 50 μl nel topo.
   6. Preparare il colorante degli acidi nucleici: diluire 1:1000 una soluzione madre da 5 mM con soluzione fisiologica sterile (concentrazione finale di 5 μM) in una siringa da 1 mL. Tenere la siringa al buio e iniettare 50 μl nel topo.
   7. Iniettare in vivo l'arancia acridina (50 μg/μL, 50 μL per topo) attraverso il catetere della vena giugulare per visualizzare i leucociti colorati e un colorante fluorescente al DNA extracellulare in modo simile alle trappole extracellulari dei neutrofili (NET) (5 μM, 50 μL per topo). NET e leucociti vengono visualizzati simultaneamente.
2. Modello di lesione I/R mesenterica
   1. Disinfettare la pelle addominale con etanolo al 70%.
   2. Eseguire una laparotomia di 3-5 cm lungo la linea alba utilizzando le forbici chirurgiche.
   3. Utilizzando due punte di cotone inumidite con soluzione salina, rimuovere delicatamente l'intestino e identificare una posizione con una copertura di grasso minima. Posizionare i rami dell'intestino tenue su un impasto nero per ridurre il segnale di fondo.
   4. Acquisire i video prima dell'I/R (pre ischemia).
   5. Fai un impacco di umidità con NaCl e mettici dentro l'intestino. Assicurarsi che l'intestino sia circondato dall'impacco e mantenere l'umidità durante il passaggio 5.6.
   6. Occludere l'arteria mesenterica superiore con un piccolo morsetto vascolare.
   7. Spingere delicatamente l'intestino nella cavità addominale utilizzando tamponi di cotone inumiditi con soluzione salina e utilizzare una sutura 7-0 per chiudere la parete addominale per prevenire la perdita di umidità e temperatura. Mantenere l'ischemia per 60 minuti, controllando l'anestesia almeno ogni 20 minuti.
   8. Dopo 1 ora, avviare la riperfusione rimuovendo la pinza.
      NOTA: La corretta esecuzione della procedura di ischemia provoca un cambiamento visibile. Inizialmente, l'area interessata apparirà pallida o bianca a causa della mancanza di flusso sanguigno. Dopo la rimozione del morsetto, il flusso sanguigno tornerà gradualmente alla regione ischemica, che riacquisterà il suo colore normale, indicando il successo dell'occlusione. È imperativo osservare attentamente il topo continuamente durante la fase di ischemia.
   9. Dopo il periodo ischemico, applicare alcune gocce di soluzione fisiologica sulla zona tagliata, quindi rimuovere delicatamente le clip microvascolari utilizzando un applicatore di clip.
   10. Utilizzando punte di cotone inumidite con soluzione salina, rimuovere delicatamente l'intestino, posizionare i piccoli rami della vena su un impasto nero, iniettare nuovamente 50 μl di arancia acridina e catturare i video della stessa vena nella stessa posizione (post-ischemia).

4. Microscopia intravitale a videoepifluorescenza ad alta velocità

1. Visualizza leucociti e NET con un microscopio a fluorescenza ad ampio campo ad alta velocità dotato di un condensatore a lunga distanza, un monocromatore, un obiettivo a immersione in acqua 10x e una fotocamera per dispositivi ad accoppiamento di carica. L'acquisizione dell'immagine è stata eseguita con un tempo di esposizione di 30 ms e filtri Alexa Fluor 488 (495/519) e Rhodamine Red (570/590).
2. Utilizzare il software di imaging per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
3. Quantificare il reclutamento cellulare all'interno di una regione di interesse di 0,06 mm².
4. Quantificare i leucociti aderenti come cellule che rimangono stazionarie o attaccate al rivestimento endoteliale per un periodo di osservazione di 20 s.
5. Identificare i NET come strutture extracellulari marcate con coloranti fluorescenti sia per leucociti che per acidi nucleici extracellulari.
6. Eutanasia degli animali mediante lussazione cervicale al termine dell'esperimento (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).

5. Isolamento delle cellule endoteliali epatiche (LEC) e RT-PCR quantitativa

1. Isolare le LEC tramite smistamento magnetico delle celle (MACS)²⁹.
2. Isolare l'RNA totale.
3. Eseguire la sintesi del DNA complementare (cDNA)²⁷ mescolando 2 μg di RNA totale con 2 μL di tampone RT, 0,8 μL di dNTP Mix, 2 μL di RT Random Primers, 1 μL di trascrittasi inversa e 4,2 μL di H₂O distillato sterile.
4. La trascrizione del cDNA è stata eseguita applicando le seguenti condizioni: 25 °C per 10 min, 37 °C per 120 min, 85 °C per 5 min.
5. Utilizzare 20 ng di cDNA per la qPCR.
6. Utilizzare i seguenti inneschi: F2r (avanti): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (indietro): CCAGCAGGACCTTTCATTTTT, L32 (avanti): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (indietro): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Utilizzare le seguenti condizioni: 95 °C 30 s, 45 cicli di (95 °C per 10 s, 60 °C per 25 s), da 60 °C a 95 °C per 6 s con ΔΤ 1 °C.

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Risultati

Per studiare gli effetti dipendenti dalle cellule endoteliali sul rotolamento e l'adesione dei leucociti, nonché sulla formazione di NET, inizialmente è stata esaminata l'efficacia del deficit di F2r inducibile VE-Caderina Cre nelle cellule endoteliali. La selezione magnetica delle cellule è stata impiegata per isolare le cellule endoteliali epatiche. Successivamente, l'RNA è stato isolato, seguito dalla PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). I topi ^{F2r ΔEC}

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Discussione

Il danno I/R mesenterico combinato con la microscopia intravitale è stato applicato a un modello murino genetico di deficit di F2r (PAR1) in cellule endoteliali per l'analisi in vivo di leucociti e NET dopo 1 ora di ischemia. Il modello di lesione I/R mesenterica è frequentemente utilizzato nei roditori con tempi di ischemia e riperfusione che variano da minuti a diverse ore^23,31, influenzando l'esito infiamma...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acridine orange	Sigma-Aldrich	A-6014
96-well plate Multiply PCR-Platten	Sarstedt	721977202.00
Anaesthesia Systems for Rodents	GROPPLER medizintechnik	Uni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVM	B Braun Melsungen	53402101
black dough	Staedtler		modelling clay
CD146 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-007
cellSens	Olympus	Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3	software
charge-coupled device camera	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2	camera
cotton swabs	Böttger	09-119-9100
Curved Hemostat 125mm/5"	Indigo Instruments	22466
Depilatory cream	Balea	not applicable
Dorbene Vet	zoetis
Dumont Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ethanol p.a. 99,5 %	Roth	5504.20
Extra Narrow Scissors – Straight/Sharp-Sharp/10.5	FST	14088-10
Fentanyl	Janssen-Cilag GmBH
Forceps "Dumont #5" (Inox, tip 0.1mm, length 11 cm)	FST	11251-20
GentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-236
Graphpadprism	Graphpad	Prism 10	software
isoflurane	Piramal	4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml	BioRad	1725125.00
Leukofix medical tape	BSNMedical	0213600
Liver Dissociation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-105-807
LS-Separation columns MACS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Smart Strainer 100 µm	Miltenyi Biotec	130-098-463
Microseal B Seal Seals	Biorad	MSB1001
Midazolam	hameln	5918501.00
NaCl	Braun	2350748
Needle holder	FST	12001-13
Nonabsorbable Braided Silk Suture, Size: 7/0, 91 Meters	Fine Science Tools	18020-70
Olympus BX51WI fluorescence microscope	Olympus		microscope
PCR for Tube Strips	Sarstedt	72985002.00
PCR Tube Lids	Sarstedt	65989002.00
Plyethylene Catheter	Smith Medical Deutschland GmbH	800/100/100
Prolene (8648G), Polypropylen 6-0, Nahtmaterial	Johnson & Johnson Medical GmbH	8695H
Relia Prep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6112
Reverse Tanscription Kit (High Capacity cDNA)	Applied Biosystems	4368813.00
School scale	KERN & SOHN GmbH	EMB 500-1
Spring Scissors - Angled to Side	FST	15006-09
Stereo microscope	Leica	M50
Straight Hemostats 135mm/5.5"	Indigo Instruments	22468
Syringe 1 mL	Braun	9166017V
SYTOX Orange	Thermo Fisher Scientific	S11368
Temperature Controller TC-1000	FMI Föhr Medical Instruments GmbH	not applicable
Tissue Forceps - 1x2 Teeth	FST	18057-14
vascular clamp	Fine Science Tools	18055-02
Vetiva mini	WAHL	1584-0480