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요약

이 프로토콜은 장간막 허혈-재관류 손상을 유도하고 생체 내 현미경을 사용하여 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(NET)을 시각화하는 방법을 제시합니다. 상장간막동맥의 혈류를 1시간 동안 제한한 후 재관류를 수행하여 백혈구 유착 및 NETosis를 직접 정량화할 수 있었습니다.

초록

장 허혈-재관류(I/R) 손상은 장간막 혈관으로의 혈류 제한으로 인한 조직 손상을 특징으로 하는 급성 질환으로, 예후가 좋지 않은 국소 및 전신 병리학을 유발합니다. 허혈과 재관류는 모두 일련의 세포 및 분자 반응을 유발하며, 염증성 세포는 병리학의 핵심 조절자 역할을 합니다. 허혈성 내피와의 이러한 상호 작용은 다중 접착 수용체에 의해 매개됩니다. 이 병리학을 모방하고 관련된 분자 경로를 조사하기 위해 여러 동물 모델이 확립되었습니다. 이 연구에서는 I/R 손상의 미세수술 모델을 생체 내 현미경과 결합하여 백혈구 굴림, 접착 및 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 시각화합니다. 이 모델은 내피 PAR1(F2r)이 결핍된 형질전환 마우스에 적용하여 허혈 후 1시간 후 및 재관류 직후 백혈구 압연 및 NET 형성에 대한 PAR1의 영향을 평가합니다. 생체 내에서는 Acridine Orange 백혈구 염색을 사용하고, 핵산 염색을 사용하여 NET을 시각화했습니다. 흥미롭게도, 백혈구 부착 감소와 NET 형성이 내피 PAR1 수용체가 결핍된 마우스에서 관찰되었습니다. 이 모델을 사용하면 I/R 손상과 관련된 주요 조절 인자의 생체 내 분석을 수행할 수 있습니다.

서문

급성 장간막 허혈(Acute mesenteric ischemia, AMI)은 사망 위험2이 높은 희귀 병리1로, 셀리악 축(celiac axis) 또는 상부 또는 하부 장간막 동맥(superior or lower interenteric artery)의 혈전으로 인해 장간막의 혈류가 감소하는 것이 특징이다. 60%-70%의 경우, 혈전증이나 색전술로 인한 상장간막동맥의 급성 폐색이 급성 장 허혈의 원인이다3. 반면, 5-15%의 사례에서 장간막 정맥 혈전증은 상장간막 정맥(superior mesenteric vein)과 관련된 장간막 허혈(mesenteric ischemia)을 유발하며, 드물게는 하부 장간막 정맥(lower mesenteric vein)과 관련된 허혈(mesenteric ischemia)을 유발한다4. 허혈로 인한 저산소증과 영양실조는 세포 수준에서 에너지 대사 장애를 유발한다5. 예를 들어, 손상된 미토콘드리아 기능은 여러 신호 경로를 활성화하여 세포 사멸 메커니즘을 시작합니다6. 빠른 재관류는 호기성 대사의 회복을 가능하게 하지만, 허혈 부위로의 혈류 회복은 종종 활성산소종(ROS) 생성7, 칼슘 과부하8, 내피 기능 장애9 및 염증 반응10으로 인해 광범위한 조직 손상을 유발한다.

허혈-재관류(I/R) 손상 중 분자 메커니즘을 규명하기 위해 상장간막동맥의 일시적인 혈관 폐색을 사용하는 많은 실험 동물 모델이 확립되었습니다11. 이러한 모델을 생체 내 현미경(IVM)과 함께 사용하는 것은 기저 세포 상호 작용 및 질병 진행에 대한 통찰력을 얻기 위한 기본 요소입니다11. 허혈 직후 장 장벽 기능 장애가 관찰되며12 상피가 무결성을 잃고13 장간막 림프절, 비장, 간, 신장과 같은 장 외 부위로 세균 전좌가 발생합니다12,14. 재관류는 점막 손상을 더욱 악화시킨다15. 세동맥의 염증 반응은 L-selectin16, P-selectin (CD62P)17, 혈소판 GPIIb/IIIa 및 fibrinogen18과 같은 분자에 의존하는 내피 세포층에 백혈구가 굴러가고 단단히 접착되는 것에 의해 나타납니다. 흥미롭게도, 장간막 정맥에 대한 백혈구 부착은 장내 미생물총(microbiota)19 및 톨 유사 수용체(Toll-like receptor 4) 신호10의 존재에 의해 영향을 받습니다. I/R 손상은 또한 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 유발합니다10. 호중구와 같은 활성화된 백혈구에서 유래한 세포외 DNA의 치료적 표적화는 장 I/R 손상의 결과를 개선한다20. 간에서 I/R 손상은 상주 마이크로파지에 의해 발화되며(21), 마이크로RNA 억제(microRNA inhibitor)는 세포사멸(apoptosis)을 현저하게 약화시킨다22. 주목할 점은 장간막의 I/R 손상은 장 세균 불균형(gut dysbiosis)을 초래하며, 이는 혈관 재생술 후 되돌릴 수 있고 해결된다는 것이다23.

내피는 또한 I/R 손상의 손상 효과에 의해 영향을 받으며, ROS는 이 과정에서 중추적인 역할을 합니다24. 백혈구가 내피 세포층에 부착, 내피 손상 및 산화질소(NO) 대사의 변화가 관찰됩니다9. 그러나 관련된 분자 경로는 아직 완전히 조사되지 않았습니다.

프로테아제 활성화 수용체 1(Protease-activated receptor 1, PAR1, F2r)은 내피 세포를 포함한 다양한 세포에 의해 발현되는 막 수용체(membrane receptor)로, 염증성 질환 중에 활성화된다25. 세린 프로테아제(serine protease)가 N-말단(N-terminus)에서 수용체를 절단하여 테더링된 리간드(tethered ligand)를 노출시킬 때 활성화가 발생하며, 이 리간드는 분자의 두 번째 세포외 루프(extracellular loop)에 결합하여 수용체를 활성화합니다26. 내피 단백질 C 수용체(EPCR)-PAR1 신호전달 경로는 내피 NO 항상성에 영향을 미치고 말초 허혈에서 혈류 회복을 촉진한다27.

본 연구에서는 백혈구 롤링, 접착 및 NET 형성을 시각화하기 위해 내피 세포 특이적 PAR1 결핍을 특징으로 하는 유전자 마우스 모델에 I/R 손상을 적용했습니다. I/R 미세수술 후 유전자 마우스 모델과 생체 내 현미경 검사의 조합은 질병 진행과 관련된 특정 세포 유형을 강조함으로써 귀중한 통찰력을 제공합니다. 유전자 마우스 모델에 I/R 손상을 적용하는 것은 질병의 진행을 개선하는 데 사용할 수 있는 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, NETosis에서 내피 PAR1의 중요성이 밝혀졌다.

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프로토콜

쥐와 관련된 모든 절차는 동물 입법에 관한 지역 위원회(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Germany; G21-1-041). 6-8 주 된 수컷과 암컷 B6. FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc 마우스를 사용하여 연구를 진행했습니다. F2r(PAR1)의 내피 세포 특이적 조절은 VE-Cadherin Cre 프로모터28을 통해 발생합니다. 본 연구에서 flox-F2r x VE-Cadherin Cre+(F2RΔEC)는 내피 세포에서 F2r(PAR1) 발현이 감소했으며, flox-F2r x VE-Cadherin Cre-(WT)는 정상 내피 F2r(PAR1) 수치를 나타냅니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 준비

  1. 필요한 수술 도구(매우 좁은 가위, 곧은 가위, 집게, 혈관 클램프 등)를 소독하십시오.
  2. 콧방울과 가열판으로 산소 및 이소플루란 기반 마취 시스템을 준비합니다.

2. 동물 준비

  1. 동물의 무게를 잰다.
  2. 마취 수행: 미다졸람(5mg/kg), 메데토미딘(0.5mg/mL) 및 펜타닐(0.5mg/kg)이 포함된 용액의 복강내(IP) 주사를 통해 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
  3. 목과 복부 수술 부위의 털을 작은 동물용 전기면도기로 제거합니다.
  4. 마우스를 가열 패드의 등쪽 누운 자세에 놓고 노즈 콘을 통해 산소 시스템에 연결합니다. 수술용 테이프로 가열된 패드에 마우스의 팔다리를 고정합니다. 라텍스 노즈콘 멤브레인이 마우스 머리에 단단히 맞는지 확인합니다. 설치류 전용 온도계를 사용하여 동물의 체온을 직장에서 모니터링합니다.
  5. 제모 크림을 바르고 목 수술 부위에 남아 있는 털을 제거하고 수술 부위의 피부를 70% 에탄올로 닦습니다.
  6. 발가락 꼬집음 테스트(페달 반사)를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다.

3. 외과적 절차

  1. 경정맥에 카테터 이식
    1. 기관을 가로로 절개(~0.5cm)하고 목을 덮고 있는 피부를 제거하고 오른쪽 경정맥을 분리합니다.
    2. 5cm 정도의 명사를 사용하여 정맥의 말단 끝을 닫고 수술 겸자로 고정합니다. 정맥 아래 약 2cm에 3 개의 명주실을 놓습니다 : 하나는 원위 끝 부분에, 다른 두 개는 경정맥의 근위 끝 부분에 가깝습니다. 수술 매듭을 묶되 혈관을 닫지 마십시오.
    3. 0.9% NaCl로 채워진 폴리에틸렌 카테터(0.28mm ID, 0.61mm OD)를 준비하고 1mL 주사기로 막습니다. 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 매듭 사이에 구멍을 뚫고 카테터를 경정맥에 이식합니다. 주사기를 흡인하여 카테터에 혈액이 있는지 확인합니다.
    4. 명주실을 묶어 카테터를 정맥에 고정하고 단단히 고정되었는지 확인합니다. 의료용 테이프를 사용하여 주사기를 고정합니다.
    5. 아크리딘 오렌지 준비: 1mL 주사기에 2mg/mL 스톡 용액을 멸균 식염수(0.5mg/mL 최종 농도)로 1:4 희석합니다. 주사기를 어두운 곳에 두고 마우스에 50μL를 주입합니다.
    6. 핵산 염료 준비: 1mL 주사기에 5mM 원액을 멸균 식염수(5μM 최종 농도)로 1:1000으로 희석합니다. 주사기를 어두운 곳에 두고 마우스에 50μL를 주입합니다.
    7. 경정맥 카테터를 통해 생체 내 아크리딘 오렌지(50 μg/μL, 마우스당 50 μL)를 주입하여 염색 호중구 세포외 트랩(NET)(5 μM, 마우스당 50 μL)과 유사하게 염색된 백혈구 및 세포외 DNA 형광 염료를 시각화합니다. NET과 백혈구는 동시에 이미지화됩니다.
  2. 장간막 I/R 부상 모델
    1. 70% 에탄올로 복부 피부를 소독합니다.
    2. 수술용 가위를 사용하여 알바 선을 따라 3-5cm 개복술을 수행합니다.
    3. 식염수에 적신 두 개의 면 팁을 사용하여 장을 부드럽게 제거하고 지방이 최소한으로 덮인 위치를 식별합니다. 검은 반죽 위에 작은 장 가지를 놓아 배경 신호를 줄입니다.
    4. I/R(허혈 전) 전에 비디오를 획득합니다.
    5. NaCl로 수분을 찜질하고 그 안에 장을 넣으십시오. 장이 압박으로 둘러싸여 있고 5.6단계에서 수분을 유지하는지 확인합니다.
    6. 작은 혈관 클램프로 상장간막 동맥을 폐색합니다.
    7. 식염수에 적신 면봉을 사용하여 장을 복강 안으로 부드럽게 밀어 넣고 7-0 봉합사를 사용하여 복벽을 닫아 수분과 온도의 손실을 방지합니다. 60분 동안 허혈 상태를 유지하고 최소 20분마다 마취를 확인합니다.
    8. 1시간 후 클램프를 제거하여 재관류를 시작합니다.
      참고: 허혈 절차를 적절하게 실행하면 눈에 띄는 변화가 나타납니다. 처음에는 혈류 부족으로 인해 해당 부위가 창백하거나 하얗게 보일 수 있습니다. 클램프를 제거하면 혈류가 점차 허혈 부위로 돌아가 정상적인 색을 되찾아 성공적인 폐색을 의미합니다. 허혈 단계 전반에 걸쳐 마우스를 지속적으로 면밀히 관찰하는 것이 필수적입니다.
    9. 허혈 기간이 지나면 잘린 부위에 식염수 몇 방울을 떨어뜨린 다음 클립 어플리어를 사용하여 미세혈관 클립을 부드럽게 제거합니다.
    10. 식염수에 적신 면봉을 사용하여 다시 부드럽게 장을 제거하고 정맥의 작은 가지를 검은 반죽에 놓고 다시 50μL의 아크리딘 오렌지를 주입하고 같은 위치(허혈 후)에서 동일한 정맥의 비디오를 캡처합니다.

4. Intravital 고속 비디오 epifluorescence 현미경 검사

  1. 장거리 콘덴서, 모노크로메이터, 10배 침수 대물렌즈 및 전하 결합 장치 카메라가 장착된 고속 광시야 형광 현미경으로 백혈구 및 NET을 시각화합니다. 이미지 획득은 30ms 노출 시간과 Alexa Fluor 488(495/519) 및 Rhodamine Red(570/590) 필터로 수행되었습니다.
  2. 이미지 획득 및 분석을 위해 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
  3. 0.06 mm² 관심 영역 내에서 세포 동원을 정량화합니다.
  4. 부착 백혈구를 20초 관찰 기간 동안 내피 내막에 고정되어 있거나 부착된 세포로 정량화합니다.
  5. NET을 백혈구 및 세포외 핵산 형광 염료로 표지된 세포 외 구조로 식별합니다.
  6. 실험이 끝날 때 자궁경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름).

5. 간 내피 세포(LEC) 분리 및 정량적 RT-PCR

  1. 자기 세포 분류(MACS) 를 통한 LEC 분리29.
  2. 전체 RNA를 분리합니다.
  3. 총 RNA 2 μg과 RT 완충액 2 μL, dNTP 믹스 0.8 μL, RT 랜덤 프라이머 2 μL, 역전사 효소 1 μL, 멸균 증류 H2O 4.2 μL를 혼합하여 상보적 DNA(cDNA) 합성27을 수행합니다.
  4. cDNA 전사는 다음 조건에 따라 수행하였다: 25°C 10분, 37°C 120분, 85°C 5분 동안.
  5. qPCR에는 cDNA 20ng을 사용합니다.
  6. F2r(정방향): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r(역방향): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32(전방향): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32(역방향): TCTGGGTTTCCGCCAGTTTTT. 다음 조건을 사용하십시오 : 95 ° C 30 초, 45 사이클 (95 ° C 10 초, 60 ° C 25 초), 60 ° C에서 95 ° C 6 초 동안 ΔΤ 1 ° C.

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결과

백혈구 롤링 및 접착 및 NET 형성에 대한 내피 세포 의존적 효과를 연구하기 위해 처음에는 내피 세포에서 VE-Cadherin Cre 유도 F2r 결핍의 효능을 조사했습니다. 간 내피 세포를 분리하기 위해 자기 세포 분류가 사용되었습니다. 그 후, RNA를 분리한 후 정량적 real-time PCR(qRT-PCR)을 수행했습니다. VE-Cadherin promoter의 제어하에 발현된 Cre 재조합효소가 없는 F2rΔEC

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토론

생체 내 현미경 검사와 결합된 장간막 I/R 손상은 허혈 1시간 후 백혈구 및 NET의 생체 내 분석을 위해 내피 세포의 F2r(PAR1) 결핍에 대한 유전자 마우스 모델에 적용되었습니다. 장간막 I/R 손상 모델은 허혈과 재관류 시간이 몇 분에서 몇 시간까지 다양한 설치류에서 자주 사용되며, 23,31 염증 결과32 ...

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공개

저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

감사의 말

C.R.은 Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz and ReALity(프로젝트 MORE), BMBF Cluster4Future CurATime(프로젝트 MicrobAIome, 03ZU1202CA), Wilhelm Sander-Stiftung(Nr. 2022.131.1) 및 Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung(DZG) 혁신 기금 "마이크로바이옴"(81X2210129)의 자금 지원을 인정합니다. C.R.은 독일 심혈관 연구 센터(DZHK)의 과학자입니다. C.R.은 CTVB(Center for Translational Vascular Biology), FZI(Research Center for Immunotherapy) 및 요하네스 구텐베르크 대학교 마인츠(Johannes Gutenberg-University Mainz)의 Potentialbereich EXPOHEALTH의 회원입니다. C.R.은 DFG Research Unit 5644 INFINITE(RE 3450/15-1)의 구성원입니다. C.R.은 마인츠 요하네스 구텐베르크 대학의 구텐베르크 연구 대학으로부터 펠로우십을 받았습니다. K.K.는 DZHK "Promotion of Women Scientists" Excellence Programme의 지원을 받고 있으며 Young DZHK의 회원입니다. Z.G.와 O.D.는 마인츠 중개 생물 의학 연구 학교(TransMed)의 박사 과정 학생입니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acridine orangeSigma-Aldrich  A-6014
96-well plate Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Anaesthesia Systems for RodentsGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
black doughStaedtlermodelling clay
CD146 Microbeads, mouseMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3software
charge-coupled device cameraHamamatsu PhotonicsORCA-R2camera
cotton swabsBöttger09-119-9100
Curved Hemostat 125mm/5"Indigo Instruments 22466
Depilatory creamBaleanot applicable
Dorbene Vetzoetis
Dumont ForcepsFine Science Tools11251-35
Ethanol p.a. 99,5 %Roth5504.20
Extra Narrow Scissors – Straight/Sharp-Sharp/10.5FST14088-10
FentanylJanssen-Cilag GmBH
Forceps "Dumont #5" (Inox, tip 0.1mm, length 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10software
isoflurane Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Leukofix medical tapeBSNMedical0213600
Liver Dissociation Kit, mouseMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Separation columns MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 µmMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
Needle holderFST12001-13
Nonabsorbable Braided Silk Suture, Size: 7/0, 91 Meters Fine Science Tools18020-70
Olympus BX51WI fluorescence microscopeOlympusmicroscope
PCR for Tube StripsSarstedt72985002.00
PCR Tube LidsSarstedt65989002.00
Plyethylene CatheterSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polypropylen 6-0, Nahtmaterial Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Reverse Tanscription Kit (High Capacity cDNA)Applied Biosystems4368813.00
School scale KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Spring Scissors - Angled to SideFST15006-09
Stereo microscopeLeicaM50
Straight Hemostats 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Syringe 1 mLBraun9166017V
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Temperature Controller TC-1000FMI Föhr Medical Instruments GmbHnot applicable
Tissue Forceps - 1x2 TeethFST18057-14
vascular clampFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

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